受体偏好的IL2/抗IL2单链抗体融合蛋白的制作方法

受体偏好的il2/抗il2单链抗体融合蛋白
技术领域
1.本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及一种受体偏好的il2/抗il2单链抗体融合蛋白，特别是涉及对il-2rαβγ亲和力降低、对il-2rβγ亲和力提高的il2/抗il2单链抗体融合蛋白，及其在治疗肿瘤或慢性感染性疾病中的用途。


背景技术：

2.白细胞介素-2(il-2)是一种白细胞介素，是免疫系统中一种细胞因子信号分子。它是一种分子量大小为15.5-16kda的蛋白质，可调节负责免疫的白细胞(白细胞，通常是淋巴细胞)的活性。il-2是身体对微生物感染的自然反应，以及区分外来“非自我”和“自我”的一部分。il-2通过与淋巴细胞表达的il-2受体结合介导其作用。
3.il-2是最早获得批准用于治疗癌症的免疫疗法之一。作为一种细胞因子，它具有激活cd8阳性t细胞，自然杀伤细胞并且促进它们增殖的能力，因此曾经获得美国fda的批准用于治疗黑色素瘤和肾细胞癌。然而，il-2同时具有激活具有免疫抑制功能的调节性t细胞(treg)的能力。这反而会抑制t细胞的抗癌免疫反应，而且可能导致其它毒副作用。因此，il-2领域的一个研发重心是开发能够在cd8阳性t细胞中选择性激活il-2受体信号通路的激活剂。
4.il-2通过il-2受体发出信号，il-2的受体链有3种：il-2rα/β/γ，它们与il-2的亲和力不同。配体特异性il-2受体α链(il-2rα，cd25，tac抗原)在活化淋巴细胞上表达，与il-2以低亲和力结合；il-2rβ(cd122)和il-2rγ(现称为共同的细胞因子受体γ链，γc或cd132)结合，形成il-2rβ/γc复合物，主要存在于记忆性t细胞和nk细胞表面，以中亲和力结合il-2；当三条受体链在treg细胞上共同表达时，il-2与3者以高亲和力结合形成4元复合物。中亲和力和高亲和力受体形式是功能性的，可传递il-2信号。全身性il-2补充可以在多种疾病(范围从赘生物到病毒感染)中增强nk介导的免疫力。然而，其全身性应用受限于其严重的副作用，并且其功效也受限于调节性t细胞(t-reg)的激活，通过与包含il2rα、il2rβ和il2rγ的高亲和性多亚基受体复合物的相互作用介导il2信号传导。成人nk细胞可以仅表达il2rβ和il2rγ亚基并且因此对于il2是相对不敏感的。概言之，在正常生理状态下，人体内的il2浓度低且半衰期短，优先激活高表达il2rαβγ受体的抑制性treg细胞(cd4 t细胞亚类)，维持体内的免疫平衡，但在肿瘤微环境中，il2对treg细胞的激活会削弱表达il2rβγ受体的cd8细胞在肿瘤内发挥杀伤作用。因此降低il2对treg细胞的激活效应，提高il2对cd8细胞和nk细胞的激活效应，成为肿瘤免疫治疗领域的热点。
5.il-2信号可以通过3种不同的信号通路(jak-stat，pi3k/akt/mtor和mapk/erk通路)转导，因此il-2的多效性得以实现。il-2与其受体结合后，cd122和cd132的细胞质结构域异二聚体化，导致janus激酶jak1和jak3的激活，随后使得cd122上的t338磷酸化。该磷酸化过程有stat转录因子加入，主要是stat5，它们二聚化并迁移到细胞核，然后与dna结合。
6.目前有多家制药公司和研究机构在对il2进行工程化改造，比如研发il2突变体，il2融合cd25，peg修饰il2等具有受体偏好的激动剂，通过降低对treg细胞的激活，从而达
到提高cd8阳性t细胞和nk细胞等的抗肿瘤作用。如苏黎世大学的nara1leukin(sahin等，nature communications.(2020)11:6440；)，在体内外实验均能激活细胞毒t细胞和nk细胞，并降低对treg细胞的激活，在动物模型中具有抗肿瘤效果。alkermes公司的alks4230(us9428563b2)，目前正处于临床ii期，在黑素瘤和肾癌中都看到了一定的响应率。表明il2选择性的激动剂对肿瘤有着积极疗效。诺华有限公司利用杂交瘤技术获得鼠抗人il2单克隆抗体nara1，根据germline数据库选择人源化模板，进行抗体序列人源化设计，获得人源化nara1。根据kabat定义编号，在轻链cdr1区的y27d和d28之间以及g29和d30之间打开，d28g29替换为gs，将hil2在k96和n97位打开，hil-2新n端n97通过ggg接头连接到lcdr1 y27d的新c端，hil-2新c端k96通过gggg接头连接至lcdr1n端d30，hil-2的原始n端残基p22和c端残基t153连接在一起，从而将重新排列的il2完全嵌入il2抗体轻链的cdr1区，获得融合蛋白107351(nara1leukin)。alkermes公司将环状重排(circularly permuted)的il2与cd25胞外区(即il2rα胞外区)通过gsgggs接头连接产生cpil2-cd25融合蛋白rdb1405(us9428563b2)。


技术实现要素：

7.尽管现有技术中为制备受体偏好的il-2进行了许多有益的尝试，但由于il-2功能的多样性和作用机制的复杂性，制备有受体偏好性的il-2药物仍未取得突破性进展。例如2000年bayer设计了bay50-4798，选择性结合il-2raβγ，减少和il-2βγ的结合，减少il-2rβγ+nk细胞介导的细胞毒性，但是最终临床治疗和传统il-2比较却没有改善。另外，结构改造的il-2尽管与天然的il-2相比一定程度上降低了对il-2rαβγ受体的亲和力，但对il-2rαβγ受体的亲和力仍然高于对il-2rβγ受体的亲和力。
8.本发明在il-2与其受体复合物结构分析的基础上，提供一种重排的il-2或其变体，并且将重排的il-2或其变体与抗il-2单链抗体通过接头连接制备融合蛋白。所述含有重排il-2和抗il-2单链抗体的融合蛋白改变了天然il-2的受体亲和力偏好，显著降低了对il-2rα的亲和力、同时提高了对il-2rβ的亲和力，从而降低了对带有il-2rαβγ受体阳性的treg细胞的激活、提高了对il-2rβγ受体阳性的cd8+、nk等细胞的激活。本发明的il-2/抗il-2单链抗体融合蛋白对il-2rβγ受体的亲和力高于对il-2rαβγ受体的亲和力，对于肿瘤、慢性感染等treg负调控相关疾病的治疗具有广阔的应用前景。
9.具体而言：
10.一方面，本发明提供一种重排的il-2分子，所述重排il-2分子是将天然il-2成熟分子从中间打开，将获得的n端片段连接于c端片段的下游。
11.在一个实施例中，本发明提供一种重排的il-2分子，其包括il-2的s95-t153片段和il-2的s24-q94片段，其中所述il-2的s95-t153片段通过肽键、接头肽、或氨基酸连接于il-2的s24-q94片段的n端或氨基端。
12.在另一个实施例中，本发明提供一种重排的il-2分子，其包括il-2的h99-t153片段和il-2的s24-f98片段，其中所述il-2的h99-t153片段通过肽键、接头肽、或氨基酸连接于il-2的s24-f98片段的n端或氨基端。
13.进一步，本发明所述的重排il-2分子，其特征在于其中il-2的片段来源于人il-2或其已知的人工突变体、动物il-2或其已知的人工突变体，并且根据seq id no:1所示天然
人il-2的序列对其氨基酸进行编号。
14.进一步，本发明所述的重排il-2分子，其特征在于il-2的两个片段之间通过gg接头肽连接。
15.第二方面，本发明提供一种融合蛋白，其包括：
16.(1)如权利要求1-4中任一项所述重排的il-2分子；
17.(2)抗il-2单链抗体；
18.可选的，
19.(3)纯化标签；
20.其中，所述(1)重排的il-2分子通过肽键、接头肽、或氨基酸连接于(2)抗il-2单链抗体的n端或氨基端，优选通过gs(g3s)3接头肽连接。
21.进一步，本发明所述融合蛋白，其特征在于所述(2)抗il-2单链抗体能够抑制或阻断il-2与il-2rα的结合、增强或不干扰il-2与il-2rβ的结合；从而减少或消除il-2对il-2rαβγ阳性细胞，如treg等的激活，同时增强或保持il-2对il-2rβγ阳性细胞，如cd8+t细胞、nk细胞等的激活。
22.进一步，本发明所述融合蛋白，其特征在于所述(2)抗il-2单链抗体的选自seq id no:2-6中任一项重链可变区的重链cdrs；和/或
23.选自seq id no:7-11中任一项轻链可变区的轻链cdrs。
24.进一步，本发明所述融合蛋白，其特征在于所述重链可变区通过肽键、接头肽、或氨基酸连接于轻链可变区的n端，优选通过sg3sg4sg4s接头肽连接。
25.进一步，本发明所述融合蛋白，其特征在于所述(3)纯化标签通过通过肽键、接头肽、或氨基酸连接于(2)抗il-2单链抗体的c端或羧基端，优选通过gg接头肽将6
×
his标签连接于(2)抗il-2单链抗体的c端或羧基端。
26.第三方面，本发明提供一种多核苷酸分子，其编码前述任一项所述重排il-2分子、或前述任一项所述融合蛋白。
27.进一步，本发明所述多核苷酸分子的核酸构建体或重组宿主细胞。
28.第四方面，本发明提供一种组合物，其包含前述任一项所述重排il-2分子、前述任一项所述融合蛋白、前述多核苷酸分子、和/或前述的核酸构建体或重组宿主细胞。
29.第五方面，本发明还提供前述任一项所述重排il-2分子、前述任一项所述融合蛋白、前述多核苷酸分子、前述的核酸构建体或重组宿主细胞、和/或前述组合物的用途，其特征在于：
30.增强或保持il-2对il-2rβγ阳性细胞的激活，所述il-2rβγ阳性细胞包括cd8+t细胞、nk细胞；
31.减少或消除il-2对il-2rαβγ阳性细胞的激活，所述il-2rαβγ阳性细胞包括treg细胞；
32.制备治疗肿瘤或慢性感染性疾病的药物。
33.为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
34.本文使用的“人白介素-2”或“hil-2”是指具有uniprot id号p60568的人il-2(野生型或wt)，在本文中以seq id no:1再现。在本发明的各种实施方式中，还包括人野生型
il-2的变体、同种型和物种同源物。因此，本公开的抗体在某些情况下可与来自除人以外的物种的il-2交叉反应。在某些实施方式中，抗体对于一种或多种人il-2蛋白可以是完全特异性的，并且可能不显示物种或其他类型的非人类交叉反应性。
35.术语“白介素-2突变体”是指其中已经对白介素-2蛋白进行特定取代的多肽。在涉及施用模式和治疗而使用时，术语“il-2突变蛋白”是指1种、2种、3种、4种或5种以上il-2突变蛋白。例如，使用il-2突变蛋白的治疗可以指用单一il-2突变蛋白或多个il-2突变蛋白的组合治疗。人il-2的一个实例是wo2012/107417a1中公开的与wt hil-2相比具有3个突变的il-2突变蛋白。proleukin(阿地白介素)是人wt il-2的变体的另一个实例，本领域技术人员众所周知。另外本领域技术人员可以通过检索生物数据库获得现有技术中可用的il-2变体，例如il-2_c145a(pdb:3ink)、d10il-2-突变蛋白("超级运动因子”:pdb:3qb1)等。
36.术语“抗体”或“il-2的抗体”等指与il-2表位相互作用(例如通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)并干扰il-2与il-2受体α(也称为cd25)的结合的完整抗体。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(h)和两条轻链(l)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域ch1、ch2和ch3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为vl)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。vh和vl区还可以细分为高变区(称为互补决定区(cdr))，中间间隔着更保守的区域(称为框架区(fr))。每个vh和vl由3个cdr和4个fr构成，按照以下顺序从氨基末端至羧基末端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。
37.术语“单链fv抗体(或scfv抗体)”是指包含抗体的vh和vl结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。对于scfv综述，可参见国际专利申请公开号wo88/01649和美国专利第4946,778号和第5260,203号。
[0038]“互补决定区”(“cdr”)是氨基酸序列，其边界使用许多众所周知的方案中的任何一种确定，包括由kabat等(1991)，“sequences of proteins of immunologicalinterest”，第5版，public health service，national institutes of health，bethesda，md(“kabat”编号方案)、al-lazikani等人，(1997)jmb273,927-948(“chothia”编号方案)和immunogentics(imgt)编号(lefranc,m.-p.，immunologist,7,132-136(1999)；lefranc,m.-p.等,dev.comp.immunol.,27,55-77(2003)(“imgt”编号方案)所述的那些。例如，对于经典格式，遵循kabat，所述重链可变域(vh)中的cdr氨基酸残基编号为31-35(hcdr1)、50-65(hcdr2)和95-102(hcdr3)；轻链可变域(vl)中的cdr氨基酸残基编号为24-34(lcdr1)、50-56(lcdr2)和89-97(lcdr3)。遵循chothia，vh中的cdr氨基酸编号为26-32(hcdr1)、52-56(hcdr2)和95-102(hcdr3)；并且vl中的氨基酸残基编号为26-32(lcdr1)、50-52(lcdr2)和91-96(lcdr3)。通过组合kabat和chothia两者的cdr定义，cdr由人vh中的氨基酸残基26-35(hcdr1)、50-65(hcdr2)和95-102(hcdr3)和人vl中的氨基酸残基24-34(lcdr1)、50-56(lcdr2)和89-97(lcdr3)构成。遵循imgt，vh中的cdr氨基酸残基编号大致为26-35(cdr1)、51-57(cdr2)和93-102(cdr3)，vl中的cdr氨基酸残基编号大致为27-32(cdr1)、50-52(cdr2)和89-97(cdr3)(根据“kabat”编号)。遵循imgt，抗体的cdr区可以使用程序imgt/domaingap align确定。
[0039]
术语“亲和力”是指所述抗体-抗原复合物的整体稳定性或强度的信息量度。其受
到三个主要因素的控制：抗体表位亲和力；抗原和抗体的价态；以及相互作用部分的结构排列。这些因素最终确定了所述抗体的特异性，即特定抗体与精确抗原表位结合的可能性。包含表位的给定多肽的区域可使用本领域众所周知的任何数量的表位绘图技术来鉴定。参见例如epitope mapping protocols in methods in molecular biology,第66卷(glenn e.morris编著，1996)humana press,totowa,n.j.。例如，线性表位可以通过下述方式来确定：例如在固体支持物上同时合成大量的肽，所述肽对应于蛋白质分子的一部分，并且在这些肽仍然与支持物连接的同时使所述肽与抗体反应。这些技术在本领域中是已知的并且在例如美国专利4,708,871号；geysen等，(1984)proc.natl.acad.sci.usa 8:3998-4002；geysen等,(1985)proc.natl.acad.sci.usa82:78-182；geysen等，(1986)mol.immunol.23:709-715中描述。类似地，通过确定氨基酸的空间构象可以容易地鉴定构象表位，例如通过x射线晶体学和二维核磁共振。参见例如epitope mapping protocols，同上。蛋白质的抗原区域也可使用标准抗原性和亲水性图来鉴定，例如使用例如可从oxfordmolecular group获得的omiga版本1.0软件程序计算的那些图。该计算机程序采用hopp/woods方法(hopp等,(1981)proc.natl.acad.sci usa78:3824-3828)用于确定抗原性图谱，以及kyte-doolittle技术(kyte等,(1982)j.moi.biol.157:105-132)用于亲水性图。本文所用的术语“亲和力”是指作为配体的il-2衍生物与其受体之间形成复合物的稳定性或强度的信息量度。其可以采用抗原-抗体亲和力相同的方法进行测量和表征。
[0040]
术语“融合蛋白”是两种分开的蛋白的融合物，其具有或不具有额外的接头序列。
[0041]
术语“接头肽”是用于连接或接合两种蛋白质片段的氨基酸序列。
[0042]
术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸以及d和l光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。如果肽链较短，则三个或更多个氨基酸的肽通常称为寡肽。如果肽链较长，则肽通常称为多肽或蛋白质。术语“生物标志物”或“标志物”在本文中可互换使用。生物标志物是核酸或多肽，并且存在或不存在该多肽的突变或差异表达用于确定对根据本发明的包含抗il-2抗体的任何治疗的敏感性。例如，当蛋白与正常(非癌性)细胞或对照细胞中的相同蛋白质相比缺陷、突变、缺失时，或在翻译后修饰、生产、表达、水平、稳定性和/或活性方面下降时，该蛋白是癌细胞的生物标志物。
[0043]
术语“核酸分子”旨在包括dna分子和rna分子。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以是cdna。
[0044]
术语“多肽”是指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，对链的长度没有上限。蛋白质中的一个或多个氨基酸残基可含有修饰，例如但不限于糖基化，磷酸化或二硫键。“蛋白质”可以包含一种或多种多肽。
[0045]
术语“载体”或“核酸构建体”是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接另外的dna区段的环状双链dna环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的dna区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点和游离型哺乳动物载体的细菌载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。这种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组dna技术中有用的表达载体通常以质粒的形式存在。然而，也包括其他形式的表达载体，如病毒载
体(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)，其起到等同的功能。
[0046]
术语“宿主细胞”在其中载体可以增殖并且其dna可以表达的细胞，所述细胞可以是原核细胞或者真核细胞。该术语还包括受试宿主细胞的任何后代。应理解，并不是所有的后代都与亲本细胞相同，因为在复制过程中可能会发生突变，这类后代被包括在内。
[0047]
术语“癌症”和“肿瘤”指包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，不论组织病理学类型或侵袭阶段如何。癌症病症的实例包括但不限于实体瘤、软组织肿瘤和转移性病灶。实体瘤的实例包括各种器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤、腺癌和癌，例如影响肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠(例如结肠)、泌尿生殖道(例如肾，尿道上皮细胞)、前列腺和咽的那些恶性肿瘤。腺癌包括恶性肿瘤，如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。在一个实施方式中，癌症是黑色素瘤，例如晚期黑色素瘤。上述癌症的转移性病变也可以使用本发明的方法和组合物治疗或预防。
[0048]
使用本文公开的融合蛋白可抑制其生长的示例性癌症包括通常对免疫疗法有反应的癌症。用于治疗的优选癌症的非限制性实例包括黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。此外，可以使用本文所述的融合蛋白治疗难治性或复发性恶性肿瘤。
[0049]
可以治疗的其他癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃食管癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性粒细胞性白血病白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、包括急性骨髓性白血病、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症、包括那些由石棉诱导的癌以及所述癌症的组合。
[0050]
本发明取得了以下有益的技术效果：
[0051]
本发明提供受体偏好的il2/il2单链抗体融合蛋白，相比于il2对il2rβ的亲和力更高，对il2rα的亲和力更低，因而在表达il2rβγ和il2rαβγ的细胞之间具有激活偏好，具体表现为对表达il2rβγ的细胞有更好的激活效应，而对表达il2rαβγ的细胞的激活效应降低。
[0052]
本发明提供受体偏好的il2/il2单链抗体融合蛋白，对下游信号分子的激活能力结果表明，其对表达il2rβγ受体细胞的激活能力高于对表达il2rαβγ受体细胞的激活能力。
[0053]
本发明提供受体偏好的il2/il2单链抗体融合蛋白与现有技术中的nara1leukin相比，不仅采用了更加简洁的融合表达方式，而且受体偏好性得到了进一步优化，βγ/αβγ比率显著提高。
具体实施方式
[0054]
下面将结合实施例更详细地描述本公开的示例性实施方式。应当理解，可以以各
种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0055]
实施例1：il2/il2单链抗体融合蛋白的表达
[0056]
将hil2/c125s(阿地白介素)在q94和s95位，或者f98和h99位打开进行了环形重排，用gg接头将原始c端t153和原始n端s24通过gg接头连接；用sgggsggggsggggs接头将nara1的重链可变区和轻链可变区连接，产生nara1scfv；用gsgggsgggsgggs接头将环形重排的il2与nara1scfv连接，获得具有il2受体偏好的融合蛋白cpil2-nara1scfv和mcpil2-nara1scfv。
[0057]
在融合蛋白的n端加上甲硫氨酸，c端通过gg接头连接6*组氨酸标签，通过密码子优化合成dna序列克隆至原核表达载体，使用大肠杆菌表达系统诱导表达融合蛋白，通过包涵体变复性和层析纯化获得融合蛋白。
[0058]
实施例2：表面等离子共振法(spr)检测受试物与白介素-2受体的亲和力
[0059]
il2rα、il2rβ、il2rαβ与il-2和cpil2-nara1scfv之间动力学亲和力实验使用biacore x100进行。将抗his抗体偶联于cm5芯片表面，然后将il2rα-his，il2rβ-his,或两者1:1混合孵育5-30min的混合物，捕获于cm5芯片表面，检测受试物与三种il2受体的动力学亲和力。结果如表1所示
[0060]
表1 biacore亲和力检测结果
[0061][0062][0063]
表1的结果表明，cpil2-nara1scfv与il2rα受体的亲和力较il2降低了约25倍，与il2rβ受体的亲和力提高了约61倍，与il2rαβ受体的亲和力降低了约61倍。cpil2-nara1scfv与il2rβ的解离速率更慢，因此具有比cpil2-cd25ecd更高的亲和力。
[0064]
实施例3：报告基因法检测受试物对于受体激活的偏好性
[0065]
构建293ec18/βγ/jak3/stat5及293ec18/αβγ/jak3/stat5细胞，测试各受试物对于il-2rβγ受体及il-2rαβγ的激活效应。根据βγ和αβγ活性的比值可知，il2强烈地偏向于激活αβγ受体，结果如表2所示。此外，cpil2-nara1scfv和mcpil2-nara1scfv并且能够
改变il2的受体激活偏好，并且改变偏好的比例显著优于alks4230和nara1leukin，alks4230和nara1leukin对两种受体的激活结果如表3所示。
[0066]
表2.cpil2-nara1scfv和mcpil2-nara1scfv结合两种受体激活p-stat5
[0067]
分子il2rβγec50(nm)il-2rαβγec50(nm)βγ/αβγratiorhil23330100.003cpil2-nara1scfv16.4467.594.111mcpil2-nara1scfv24.8292.843.740
[0068]
表3.alks4230和nara1leukin结合两种受体激活p-stat5
[0069]
分子il2rβγec50(nm)il-2rαβγec50(nm)βγ/αβγratioalks42300.720.871.208nara1leukin3.52.60.743
[0070]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。