表达牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的重组牛结节疹病毒及其应用的制作方法

表达牛疱疹病毒ⅰ型gb基因的重组牛结节疹病毒及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种表达牛疱疹病毒ⅰ型gb基因的重组牛结节疹病毒及其应用。


背景技术：

2.牛疱疹病毒ⅰ型(bhv
‑ⅰ
)属于α疱疹病毒，引起牛传染性鼻气管炎(ibr)，表现为呼吸道疾病、生殖道损害、流产甚至致命性系统感染等临床症状。bhv
‑ⅰ
的囊膜表面至少存在10种糖蛋白，其中糖蛋白gb是参与bhv
‑ⅰ
侵入宿主细胞机制的重要分子，为病毒复制所必需。同时，gb亦是刺激宿主免疫应答的主要抗原蛋白之一，能诱导宿主产生高水平的体液和细胞免疫反应。
3.结节性皮肤病(lumpy skin disease，lsd)又称牛结节疹，牛结节性皮炎或牛疙瘩皮肤病，是由痘病毒科的结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus，lsdv)引起的一种牛的急性或亚急性传染病。
4.目前，对于结节性皮肤病的防疫：将种毒接种到制备好的羊睾丸细胞上培养约72小时后收获，用灭活剂灭活后，与油佐剂乳化而成。
5.对于牛传染性鼻气管炎的防疫：一种是将牛传染性鼻气管炎病毒接种到dmbk细胞上培养约72小时后收获，用灭活剂灭活后，与油佐剂乳化而成；另外一种是cho表达牛传染性鼻气管炎gb蛋白，收获后换液，与油佐剂乳化而成。
6.然而这些方案的疫苗都需要灭活后乳化制备，并且免疫后均只能对单种疫病进行预防。
7.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

8.本发明的第一目的在于提供一种重组牛结节疹病毒。
9.本发明的第二目的在于提供上述重组牛结节疹病毒的制备方法。
10.本发明的第三目的在于提供上述重组牛结节疹病毒的培养方法。
11.本发明的第四目的在于提供上述重组牛结节疹病毒的应用。
12.本发明的第五目的在于提供一种预防牛结节疹和牛传染性鼻气管炎的疫苗。
13.本发明的第六目的在于提供上述疫苗的制备方法。
14.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
15.一种重组牛结节疹病毒，所述重组牛结节疹病毒为含有牛疱疹病毒ⅰ型gb基因的牛结节疹病毒；所述牛疱疹病毒ⅰ型gb基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
16.进一步地，所述牛疱疹病毒ⅰ型gb基因插入在牛结节疹病毒的tk基因中，片段连接方式为tk1
‑
gb
‑
tk2，牛疱疹病毒ⅰ型gb基因连有第一启动子；
17.优选地，第一启动子包括p7.5或p11。
18.进一步地，牛疱疹病毒ⅰ型gb基因的核苷酸序列5’或3’端连接有报告基因，片段连
接方式为tk1
‑
gb
‑
报告基因
‑
tk2或tk1
‑
报告基因
‑
gb
‑
tk2，报告基因连有第二启动子，第二启动子与第一启动子不同；
19.优选地，第二启动子包括p7.5或p11；
20.优选地，报告基因包括egfp、gpt或lacz。
21.进一步地，片段连接方式为tk1
‑
gb
‑
p7.5
‑
p11
‑
egfp
‑
tk2。
22.进一步地，片段p7.5
‑
gb
‑
tk1的核苷酸序列如seq id no.2所示，片段p11
‑
egfp
‑
tk2的核苷酸序列如seq id no.3所示。
23.上述重组牛结节疹病毒的制备方法，将含有seq id no.1的质粒导入牛结节疹病毒感染的细胞中，培养筛选得到所述重组牛结节疹病毒。
24.进一步地，所述质粒的功能性片段为tk1
‑
gb
‑
p7.5
‑
p11
‑
egfp
‑
tk2，片段p7.5
‑
gb
‑
tk1的核苷酸序列如seq id no.2所示，片段p11
‑
egfp
‑
tk2的核苷酸序列如seq id no.3所示；
25.优选地，质粒为psp72或pbluescript ii sk(
‑
)；
26.优选地，细胞为羊睾丸细胞。
27.上述重组牛结节疹病毒的培养方法，将重组牛结节疹病毒在vero全悬浮细胞上培养，得到重组牛结节疹病毒。
28.上述重组牛结节疹病毒在制备预防牛结节疹和牛传染性鼻气管炎的疫苗中的应用。
29.一种预防牛结节疹和牛传染性鼻气管炎的疫苗，活性成分为上述重组牛结节疹病毒。
30.上述疫苗的制备方法，将重组牛结节疹病毒与冻干保护剂混匀，冻干得到所述疫苗；
31.优选地，冻干保护剂包括：1
‑
3％海藻糖、1
‑
3％右旋糖酐、0.5
‑
1.5％甘露醇、0.5
‑
1.5％聚乙二醇4000、1
‑
3％冷水鱼明胶、0.05
‑
2％tween 80和90
‑
110nmol甘氨酸。
32.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
33.本发明提供的重组牛结节疹病毒，其中含有seq id no.1所示的牛疱疹病毒ⅰ型gb基因，该病毒在保留牛结节疹病毒抗原的同时可以表达牛疱疹病毒ⅰ型的抗原，使之兼具两种病毒的抗原表位，以此作为活载体疫苗可以实现直接接种，避免了灭活、佐剂乳化等操作，对牛结节疹病毒和牛传染性鼻气管炎病毒均具有良好的免疫原性，实现“一针两防”。同时，本发明的培养方式实现了重组牛结节疹病毒在悬浮的vero细胞中培养，避免了原代细胞培养的不足，简化了培养工艺。该重组牛结节疹病毒制备的疫苗与常规全病毒灭活疫苗相比，不仅生产成本低、安全性好、免疫效力优于单苗的效果。
附图说明
34.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
35.图1为本发明实施例中psp72
‑
p7.5
‑
tk1和psp72
‑
p11
‑
tk2的鉴定图；
36.图2为本发明实施例中psp72
‑
p7.5
‑
gb
‑
tk1和psp72
‑
p11
‑
egfp
‑
tk2的鉴定图；
37.图3为本发明实施例中pb
‑
tk1
‑
gb
‑
p7.5
‑
p11
‑
egfp
‑
tk2鉴定图。
具体实施方式
38.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
39.除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
40.本发明提供一种重组牛结节疹病毒，该重组病毒为在出发牛结节疹病毒的基因组中插入可表达的牛疱疹病毒ⅰ型gb基因改造得到。其中，牛疱疹病毒ⅰ型gb基因的序列如seq id no.1所示。该重组病毒既具有牛结节疹病毒的抗原，又有牛疱疹病毒ⅰ型的抗原，以此作为活载体疫苗可以实现直接接种，避免了灭活、佐剂乳化等操作，对牛结节疹病毒和牛传染性鼻气管炎病毒均具有良好的免疫原性，实现“一针两防”。
41.caataggatctatgggggaaatcacagacctggtggataaaaaatggcggtgtctgagcaaagctgagtatctgagatcaggtcggaaggtggtcgccttcgaccgggatgacgacccttgggaagcccctctcaagcctgcaaggctgagtgctccaggagtgagagggtggcacaccaccgatgatgtttacacagccctgggaagcgctggattgtatagaacgggcacaagcgtaaactgcattgtggaggaagtggaagccagatccgtgtacccctacgactccttcgctctgtccaccggtgacatcatttacatgtctcccttctatggcttgcgggaaggagctcacagggaacacacttcttatagcccagagcggtttcagcagatagagggctactataagcgcgacatggccactgggcgccgcctcaaggaacctgtttcacggaattttctgcgcacccaacatgtgactgtggcttgggattgggtgcctaaaagaaaaaacgtgtgttccctggccaagtggcgggaggctgatgaaatgctgagagatgagagcaggggtaatttccgctttacggccaggtcattgagcgccaccttcgtgagcgactcccatacatttgccctgcagaatgtgcccctgagcgattgcgtaatagaggaggctgaagccgccgtcgaacgagtgtacagggaacggtacaatggtactcacgtcctgtcaggcagtctcgaaacctacctggctcgaggtggatttgttgtggccttcaggccaatgctttcaaatgagctcgctaagttgtacctccaggaattggccagatcaaacggaacactggaaggactttttgcagccgctgccccaaaacctggccctagaagagctagaagagctgctccaagcgctcctggaggaccaggagccgcaaatggaccagcaggtgatggcgatgctggaggaagagtgacaaccgtgagtagcgccgaatttgcagccttgcagtttacttacgaccatatacaggatcatgtcaatacaatgttttctaggctcgctacctcatggtgcctgctccagaacaaggagcgagctctttgggcagaagctgctaaactgaatccaagcgcagcagcttcagccgcactggatcgcagagcagccgcaagaatgctgggcgatgccatggctgtgacatactgccatgaactcggcgaaggacgagtctttattgagaatagcatgagggctccagggggagtttgctactctagaccaccagtgtctttcgcctttgggaatgagtctgagccagtggaagggcagctgggcgaggataacgagctgttgccaggacgggagttggtggaaccgtgtacggctaatcacaagaggtacttccgattcggggccgattacgtgtattacgaaaactacgcttacgtcaggagggtgccgctggcagaattggaagtaatttctacgtttgtggatctcaacctcaccgtgctggaggatcgggagttcttgcctctggaggtctacacccgagccgagttggcagacacaggcctgctggattattccgagatccagaggcgaaaccagcttcacgagcttaggttttacgatattgacagagtggtaaaaacagacgggaacatggcaattatgcgaggcttggccaacttcttccaaggactgggtgccgtaggacaagctgtgggtacagtggtactgggagccgctggcgctgccttgtcaactgtttcaggtatagcctctttcatcgctaatccttttggtgcgctggctactggcctcttggtgctggcaggtcttgtggccgcttttctcgcatataggtacatatca
cggctgcgctcaaacccgatgaaggctctttatcctatcaccaccagggcactcaaagacgacgcaagaggagcgactgcccctggtgaagaagaagaggagtttgacgccgcaaagctggagcaggcacgagaaatgattaagtatatgagcctggtgtcagctgtcgagagacaggaacacaaagctaaaaaatctaacaagggaggccctctccttgccacacggcttacacaactggctcttagaagacgagcgccgcccgagtatcaacaattgcctatggctgatgtcggcggcgccccgcggatcat(seq id no.1)
42.在一种实施方式中，为了实现该重组牛结节疹病毒具有两种免疫原性，牛疱疹病毒ⅰ型gb基因插入在牛结节疹病毒的tk基因中，该操作不会影响牛结节疹病毒的抗原表达，同时破坏了其tk基因的功能，有利于病毒筛选，具体的片段连接方式为tk1
‑
gb
‑
tk2，同时，为了确保gb基因的表达，牛疱疹病毒ⅰ型gb基因连有第一启动子，具体可以为tk1
‑
第一启动子
‑
gb
‑
tk2或tk1
‑
gb
‑
第一启动子
‑
tk2。其中，第一启动子可以为p7.5或p11。
43.在一种实施方式中，为了实现重组牛结节疹病毒的鉴定筛选，牛疱疹病毒ⅰ型gb基因的核苷酸序列5’或3’端连接有报告基因，片段链接方式为tk1
‑
gb
‑
报告基因
‑
tk2或tk1
‑
报告基因
‑
gb
‑
tk2，可以理解的是，为了确保报告基因可以表达，报告基因连有第二启动子，具体可以为tk1
‑
gb
‑
第一启动子
‑
第二启动子
‑
报告基因
‑
tk2、tk1
‑
报告基因
‑
第二启动子
‑
第一启动子
‑
gb
‑
tk2等等，同时，第一启动子与第二启动子不同。其中，第二启动子可以为p7.5或p11。
44.优选地，报告基因包括egfp、gpt或lacz等。
45.在一种优选地实施方式中，片段连接方式为tk1
‑
gb
‑
p7.5
‑
p11
‑
egfp
‑
tk2。
46.在一种优选地实施方式中，片段p7.5
‑
gb
‑
tk1的核苷酸序列如seq id no.2所示，片段p11
‑
egfp
‑
tk2的核苷酸序列如seq id no.3所示。
47.ctagtaagctcatctatatactatatagtaataccaatactcaagactacgaaactgatacaatctcttatcatgtgggtaatgttctcgatgtcgatagccatatgcccggtagttgcgatatacataaactgatcactaattccaaacccacccgctttttatagtaagtttttcacccataaataataaatacaataattaatttctcgtaaaagtagaaaatatattctaatttattgcacggtaaggaagtagaatcataaagaacagtgacggatccccgggatctatgggggaaatcacagacctggtggataaaaaatggcggtgtctgagcaaagctgagtatctgagatcaggtcggaaggtggtcgccttcgaccgggatgacgacccttgggaagcccctctcaagcctgcaaggctgagtgctccaggagtgagagggtggcacaccaccgatgatgtttacacagccctgggaagcgctggattgtatagaacgggcacaagcgtaaactgcattgtggaggaagtggaagccagatccgtgtacccctacgactccttcgctctgtccaccggtgacatcatttacatgtctcccttctatggcttgcgggaaggagctcacagggaacacacttcttatagcccagagcggtttcagcagatagagggctactataagcgcgacatggccactgggcgccgcctcaaggaacctgtttcacggaattttctgcgcacccaacatgtgactgtggcttgggattgggtgcctaaaagaaaaaacgtgtgttccctggccaagtggcgggaggctgatgaaatgctgagagatgagagcaggggtaatttccgctttacggccaggtcattgagcgccaccttcgtgagcgactcccatacatttgccctgcagaatgtgcccctgagcgattgcgtaatagaggaggctgaagccgccgtcgaacgagtgtacagggaacggtacaatggtactcacgtcctgtcaggcagtctcgaaacctacctggctcgaggtggatttgttgtggccttcaggccaatgctttcaaatgagctcgctaagttgtacctccaggaattggccagatcaaacggaacactggaaggactttttgcagccgctgccccaaaacctggccctagaagagctagaagagctgctccaagcgctcctggaggaccaggagccgcaaatggaccagcaggtgatggcgatgctggaggaagagtgacaaccgtgagtagcgccgaatttgcagccttgcagtttacttacgaccatatacaggatcatgtcaatacaatgttttctaggctcgctacctcatggtgcctgctccagaacaaggagcgagctctttgggcagaagctgctaaactgaatccaagcgcagcagctt
cagccgcactggatcgcagagcagccgcaagaatgctgggcgatgccatggctgtgacatactgccatgaactcggcgaaggacgagtctttattgagaatagcatgagggctccagggggagtttgctactctagaccaccagtgtctttcgcctttgggaatgagtctgagccagtggaagggcagctgggcgaggataacgagctgttgccaggacgggagttggtggaaccgtgtacggctaatcacaagaggtacttccgattcggggccgattacgtgtattacgaaaactacgcttacgtcaggagggtgccgctggcagaattggaagtaatttctacgtttgtggatctcaacctcaccgtgctggaggatcgggagttcttgcctctggaggtctacacccgagccgagttggcagacacaggcctgctggattattccgagatccagaggcgaaaccagcttcacgagcttaggttttacgatattgacagagtggtaaaaacagacgggaacatggcaattatgcgaggcttggccaacttcttccaaggactgggtgccgtaggacaagctgtgggtacagtggtactgggagccgctggcgctgccttgtcaactgtttcaggtatagcctctttcatcgctaatccttttggtgcgctggctactggcctcttggtgctggcaggtcttgtggccgcttttctcgcatataggtacatatcacggctgcgctcaaacccgatgaaggctctttatcctatcaccaccagggcactcaaagacgacgcaagaggagcgactgcccctggtgaagaagaagaggagtttgacgccgcaaagctggagcaggcacgagaaatgattaagtatatgagcctggtgtcagctgtcgagagacaggaacacaaagctaaaaaatctaacaagggaggccctctccttgccacacggcttacacaactggctcttagaagacgagcgccgcccgagtatcaacaattgcctatggctgatgtcggcggcgccccgcggatggactacgggtatatccacctcatcattggtccaatgttctcaggtaaaagcacagaactcataaggattgtgaagcggtatcagatcgcacagtataaatgctgcgtggtgaaatatctgaaggatatccggtacggaaattctgtatatacccacgataacaaccatgtaagcgccatcagcaccactctgctgtatgatgtcgtcgacaagatcatgaccgcgg(seq id no.2)；
48.agatgcatcgatagcgatgctacgctagtcacaatcaccactttcatatttagaatatatgtatgtaaaaatatagtagaatttcattttgtttttttctatgctataaatagatctatgtctagagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggaggtagatttatgcatcctcttgtcatgagaagtcgaattgttcccattctgtgtgttgcagctacagatggagatacatagagatactcgtggattttgcttagtgttgagttttgttctggttgtgaactaaaagtttatacatttgcaggaaataaatagccttttgtttaaatcaaaaggtcttacctatgttattgcgtgaggcattggatcccaaagagagaactccaaaatgcgaggctacatgttatggactagtatcaggttgggagacctcctgagaagctccagcaagtaagcctcgatcacgcaaaatgtttgaggtctgatgttcaatagcttgttttgtttcactttgctttggactttcttttcgccaatgagctatgtttctgatggttttcactcttttggtgtgtagagaaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacagaattcagtaaatggagtgctacaaagacgccgcttttagcaaacggataacaaaagaaaaggagatcgagttgatcggcggtaaagagaaatataaatctgtgtgtcgcaagtgctatttcctggaagggcccactgct(seq id no.3)
49.本发明还提供一种重组牛结节疹病毒的制备方法，将含有seq id no.1的质粒导入牛结节疹病毒感染的细胞中，培养筛选得到所述重组牛结节疹病毒。该方式利用转移载体质粒与牛结节疹病毒在宿主细胞中实现同源重组的原理，将外源基因整合到牛结节疹病
毒的基因组特定位点。优选地，质粒与牛结节疹病毒的同源重组片段为tk1
‑
gb
‑
p7.5
‑
p11
‑
egfp
‑
tk2，片段p7.5
‑
gb
‑
tk1的核苷酸序列如seq id no.2所示，片段p11
‑
egfp
‑
tk2的核苷酸序列如seq id no.3所示。其中，质粒优选为psp72或pbluescript ii sk(
‑
)，细胞优选为羊睾丸细胞。
50.本发明还提供一种重组牛结节疹病毒的培养方法，将重组牛结节疹病毒在vero全悬浮细胞上培养，得到重组牛结节疹病毒。其中，vero全悬浮细胞的驯化方法例如：
51.vero贴壁细胞复苏后在含血清培养基中培养，血清添加量为8％，连续传2
‑
3代后，待细胞增殖稳定后开始降低血清含量，每传一代降低2％血清，当血清浓度降至5％后，培养基中添加2％的酵母提取物，2％植物水解蛋白，若生长缓慢继续维持原有血清浓度培养，直至血清含量降至1％，细胞生长稳定后培养1
‑
2代之后，将vero贴壁细胞从方瓶中直接转入摇瓶进行悬浮培养。采用无血清悬浮培养基，培养基中添加1％的酵母提取物，1％植物水解蛋白，vero悬浮细胞在摇瓶中培养，以1.0
×
106cells/ml为起始接种密度，每日计算细胞活率和密度，倍增后传代(约68h)，培养条件为：37℃、含5.0％co2，湿度＞60％，80r/min
‑
120r/min(50mm orbital throw shaker)的培养摇床中培养。vero贴壁细胞转入悬浮培养基中添加适应于悬浮培养的维生素、氨基酸、无机盐等，其中l－谷氨酰胺(1mmol/l)、l－谷氨酸(1.5mmol/l)、l－亮氨酸(0.05mmol/l)、l－甲硫氨酸(1.5mmol/l)；维生素b6(1.5mg/l)、维生素b12(1.0mg/l)、烟酰胺(0.15mg/l)；硫酸镁(1.5mg/l)，进行培养，直至细胞稳定，部分冻存，部分继续传代接种重组病毒培养抗原。
52.本发明提供的重组牛结节疹病毒可以用于制备预防牛结节疹和牛传染性鼻气管炎的疫苗。与常规全病毒灭活疫苗相比，不仅生产成本低，在应用中可以产生良好的免疫效力。该疫苗的制备将重组牛结节疹病毒与冻干保护剂混匀，冻干得到。冻干保护剂包括：1
‑
3％海藻糖、1
‑
3％右旋糖酐、0.5
‑
1.5％甘露醇、0.5
‑
1.5％聚乙二醇4000、1
‑
3％冷水鱼明胶、0.05
‑
2％tween 80和90
‑
110nmol甘氨酸。
53.下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
54.实施例1转移载体质粒的制备
55.psp72
‑
p7.5
‑
gb
‑
tk1质粒的构建
56.根据p7.5和tk1基因序列，在p7.5启动子的5’端添加酶切位点hindiii(aagct)，在3’端添加酶切位点bamh i(ggatc)；在tk1的5’端添加酶切位点salii(ccgcgg)，在3’端添加酶切位点sacii(ccgcgg)；p7.5和tk1连接一起人工合成。
57.gb基因5’端添加酶切位点bamhi(ggatc)，在3’端添加酶切位点salii(ccgcgg)，人工合成。
58.用hindiii和sacii对载体psp72和p7.5
‑
tk1分别进行双酶切，酶切完毕后用胶回收试剂盒去除酶切缓冲液，获得线性带酶切位点的psp72和p7.5
‑
tk1，用t4dna连接酶连接，将产物转化感受态细胞，涂琼脂糖固体培养基含(amp)，在37℃温箱过夜培养，第二天挑单个菌落于含的培养液的试管中，放置37℃的摇床过夜培养。提取质粒，鉴定阳性将质粒命名为psp72
‑
p7.5
‑
tk1。鉴定图片见图1的1号泳道。
59.用bamhi和salii对载体psp72
‑
p7.5
‑
tk1和gb基因分别进行双酶切，酶切完毕后用胶回收试剂盒去除酶切缓冲液，获得线性带酶切位点的psp72
‑
p7.5
‑
tk1和gb dan用t4dna
连接酶连接，将产物转化感受态细胞，涂琼脂糖固体培养基含(amp)，在37℃温箱过夜培养，第二天挑单个菌落于含的培养液的试管中，放置37℃的摇床过夜培养。提取质粒，鉴定阳性将质粒命名为psp72
‑
p7.5
‑
gb
‑
tk1。鉴定图片见图2的2号泳道。
60.psp72
‑
p11
‑
egfp
‑
tk2质粒的构建
61.根据p11和tk2基因序列，在p11启动子的5’端添加酶切位点bspdi(atcgat)，在3’端添加酶切位点bglii(agatct)；在tk2的5’端添加酶切位点ecori(gaattc)，在3’端添加酶切位点apai(gggccc)；p11
‑
tk2连接一起人工合成。
62.egfp基因5’端添加酶切位点bglii(agatct)在3’端添加酶切位点ecori_(gaattc)，人工合成。
63.用bspdi和apai对载体psp72和p11
‑
tk2分别进行双酶切，酶切完毕后用胶回收试剂盒去除酶切缓冲液，获得线性带酶切位点的psp72和p11
‑
tk2，用t4dna连接酶连接，将产物转化感受态细胞，涂琼脂糖固体培养基含(amp)，在37℃温箱过夜培养，第二天挑单个菌落于含的培养液的试管中，放置37℃的摇床过夜培养。提取质粒，鉴定阳性将质粒命名为psp72
‑
p11
‑
tk2。鉴定图片见图1的2号泳道。
64.用bglii和ecori对载体psp72
‑‑
p11
‑
tk2和gb基因分别进行双酶切，酶切完毕后用胶回收试剂盒去除酶切缓冲液，获得线性带酶切位点的psp72
‑
p11
‑
tk2和egfp dan用t4dna连接酶连接，将产物转化感受态细胞，涂琼脂糖固体培养基含(amp)，在37℃温箱过夜培养，第二天挑单个菌落于含的培养液的试管中，放置37℃的摇床过夜培养。提取质粒，鉴定阳性将质粒命名为psp72
‑
p11
‑
egfp
‑
tk2。鉴定图片见图2的4号泳道。
65.pb
‑
tk1
‑
gb
‑
p7.5
‑
p11
‑
egfp
‑
tk2转移载体的构建
66.用hindiii和sacii对载体pbluescript ii sk(
‑
)和psp72
‑
p7.5
‑
gb
‑
tk1分别进行双酶切，酶切完毕后用胶回收试剂盒回收载体和目的片段p7.5
‑
gb
‑
tk1，获得线性带酶切位点的pbluescript ii sk(
‑
)(以下简称pb)和p7.5
‑
gb
‑
tk1片段，用t4dna连接酶连接，将产物转化感受态细胞，涂琼脂糖固体培养基含(amp)，在37℃温箱过夜培养，第二天挑单个菌落于含的培养液的试管中，放置37℃的摇床过夜培养。提取质粒，鉴定阳性将质粒命名为pb
‑
p7.5
‑
gb
‑
tk1。
67.用bspdi和apai对载体pb
‑
p7.5
‑
gb
‑
tk1和psp72
‑
p11
‑
egfp
‑
tk2分别进行双酶切，酶切完毕后用胶回收试剂盒回收载体和目的片段，获得线性带酶切位点的pb
‑
p7.5
‑
gb
‑
tk1和p11
‑
egfp
‑
tk2用t4dna连接酶连接，将产物转化感受态细胞，涂琼脂糖固体培养基含(amp)，在37℃温箱过夜培养，第二天挑单个菌落于含的培养液的试管中，放置37℃的摇床过夜培养。提取质粒，鉴定阳性将质粒命名为pb
‑
tk1
‑
gb
‑
p7.5
‑
p11
‑
egfp
‑
tk2。酶切鉴定见图3的2号泳道。
68.实施例2重组牛结节疹病毒的制备
69.6孔板上铺制lt细胞(羊睾丸细胞)，待细胞长成单层后，按0.1感染复数(multiple of infection，m.o.i.)给6孔板上的lt细胞接种牛结节疹弱毒株，37℃吸附2h，制备好的重组转移质粒pb
‑
tk1
‑
gb
‑
p7.5
‑
p11
‑
egfp
‑
tk2用脂质体转染方法，按lipofectamine
tm
2000transfection reagent试剂盒说明书分别进行转染。每孔细胞用pb
‑
tk1
‑
gb
‑
p7.5
‑
p11
‑
egfp
‑
tk2重组质粒2
‑
3μg，
70.脂质体用量约为dna的3倍(质量体积比)，用opti
‑
mem约100～200μl稀释。转染48h
后在荧光显微镜下观察是否有荧光，同时观察细胞病变的逐步发展。当90％细胞发生病变且有荧光出现时，将细胞培养板收于
‑
70℃保存。
71.重组牛结节疹病毒的纯化
72.6孔板上铺制羊睾丸细胞(lt)，待细胞长成单层后，将上述收获的病毒进行10倍梯度稀释，取10
－5
～10
－7
各取100μl加入含lt细胞的6孔板，每孔再补充2ml的无血清mem，感做2小时。2小时后，弃去培养上清，取无菌的低熔点胶与含2％血清的mem混合后，覆盖于接种重组病毒的细胞上，待胶凝固后，置37℃含5％co2培养箱中，2天后观察出现荧光的部位并予以标记，在生物安全柜中，将标记荧光的区域从六孔板中取出，置于1.5ml含无血清培养基的离心管中，冻融三次后，一部分接种lt细胞，一部分用于分子生物学鉴定，阳性继续扩大培养，命名为r lsd
‑
ibrv
‑
g b。
73.实施例3重组牛结节疹病毒的驯化
74.vero贴壁细胞复苏后在含血清培养基中培养，血清添加量为8％，连续传2
‑
3代后，待细胞增殖稳定后开始降低血清含量，每传一代降低2％血清，当血清浓度降至5％后，培养基中添加2％的酵母提取物，2％植物水解蛋白，若生长缓慢继续维持原有血清浓度培养，直至血清含量降至1％，细胞生长稳定后培养1
‑
2代之后，将vero贴壁细胞从方瓶中直接转入摇瓶进行悬浮培养。采用无血清悬浮培养基，培养基中添加1％的酵母提取物，1％植物水解蛋白，vero悬浮细胞在摇瓶中培养，以1.0
×
106cells/ml为起始接种密度，每日计算细胞活率和密度，倍增后传代(约68h)，培养条件为：37℃、含5.0％co2，湿度＞60％，80r/min120r/min(50mm orbital throw shaker)的培养摇床中培养。vero贴壁细胞转入悬浮培养基中添加适应于悬浮培养的维生素、氨基酸、无机盐等，其中l－谷氨酰胺(1mmol/l)、l－谷氨酸(1.5mmol/l)、l－亮氨酸(0.05mmol/l)、l－甲硫氨酸(1.5mmol/l)；维生素b6(1.5mg/l)、维生素b12(1.0mg/l)、烟酰胺(0.15mg/l)；硫酸镁(1.5mg/l)，进行培养。
75.待细胞稳定增殖后，接种上述扩增的r lsd
‑
ibrv
‑
g b以moi为0.1接种细胞后，待细胞活率接近60％时收获病毒，冻存后，测定毒价，继续在悬浮的vero上进行增殖，当病毒滴度达到10
7.5
tcid
50
/ml时，即认为驯化成功。
76.实施例4预防牛结节疹和牛传染性鼻气管炎的疫苗的制备
77.将上述测定病毒滴度的r lsd
‑
ibrv
‑
g b与冻干保护剂(2％海藻糖、3％右旋糖酐、1％甘露醇、1％聚乙二醇4000、2％冷水鱼明胶、0.1％tween 80和100nmol甘氨酸)混合后，冻干。随机抽取三瓶进行病毒含量测定，每头份免疫剂量约为10
6.5
tcid
50
/ml。
78.实施例5安全性验证
79.选取20头3
‑
5月龄的犊牛，15头作为免疫组，5头做对照，其中免疫组皮内注射1ml(含10
7.5
tcid
50
)，对照组皮内注射1ml稀释液，连续定点监测体温、观察采食和异常临床症状。结果显示：免疫组和对照组体温、采食无影响，亦无异常临床症状。
80.实施例6效力验证
81.选取20头3
‑
5月龄的犊牛，分为四组，分别lsd弱毒株、r lsd
‑
ibrv
‑
g b重组毒和ibrv全病毒灭活疫苗。分组见表1
82.表1三种不同疫苗效力检验分组
[0083][0084]
注：
“‑”
不适用。
[0085]
一免后21日二免后14日静脉采血分离血清进行中和抗体检测，血清进行1:2倍比稀释。结果显示：r lsd
‑
ibrv
‑
g b重组毒免疫后对lsd的中和能力显著高于lsd单苗免疫效力；r lsd
‑
ibrv
‑
g b重组毒免疫后免疫效力显著高于ibrv灭活疫苗效果，结果见表2。
[0086]
表2不同疫苗免疫后中和抗体滴度
[0087]
[0088][0089]
实施例7成本核算
[0090]
以100头份为单位计算，lsd弱毒每100头成本为3元、ibrv全病毒灭活疫苗为30元，而本发明制备的vero悬浮培养r lsd
‑
ibrv
‑
g b重组毒每100头份成本仅为1元钱，生产成本及其低，彰显了本发明的进步。结果见表3。
[0091]
表3成本核算
[0092][0093]
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。