一种抗H9N2亚型禽流感病毒的多肽及其应用的制作方法

一种抗h9n2亚型禽流感病毒的多肽及其应用
技术领域
1.本发明属于动物医学分子免疫学技术领域，尤其涉及一种抗h9n2亚型禽流感病毒的多肽及其应用。


背景技术：

2.禽流感（avian influenza，ai）是由a型流感病毒引起的一种发生于各种家禽和野鸟的禽类传染性疾病总称。根据a型流感病毒粒子表面的血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)抗原性的不同，又分为许多亚型。根据临床a型流感病毒致病性的强弱，禽流感可分为高致病性、低致病性和无致病性三种。h9n2 亚型禽流感虽然属于低致病性禽流感，却严重危害养鸡业生产，是造成商品肉仔鸡死淘率居高不下的重要原因，该病不仅引起商品肉鸡免疫力下降、呼吸道症状和继发大肠杆菌，还可导致种鸡和蛋鸡出现严重产蛋下降和蛋品质降低。
3.国内对h9n2禽流感的防控主要依靠疫苗，但由于病毒变异速度快，每2
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3年需要更换病毒株。疫病发生后使用中药进行治疗，但是中药的抗病毒活性普遍不强，主要通过清热解毒、免疫调节等作用进行综合调理，暂无兽用抗病毒化药和生物制品获批，缺乏有效的防治药物。
4.tkip是细胞因子信号抑制因子(suppressor of cytokine signaling，socs)蛋白的模拟物，为由12个氨基酸（wlvffvifyffr）组成的酪氨酸激酶抑制剂，具有抗炎的活性。2009年，ahmed, c. m. 等报道了tkip具有体外和小鼠体内抗痘病毒的活性。2012年，marlynne q. 等为了改变tkip（fp1）的水溶性、半衰期和稳定性，设计合成了tkip系列衍生肽fp2～fp9，对于a/wsn/33(h1n1)、pr8/eng09(h1n1)、pr8/vic(h3n2)及pr8/viet(h5n1)等亚型的流感病毒株均有一定的抑制作用。其中，fp4多肽（氨基酸序列：rrkkwlvffvifyffr）对上述4种病毒的ic
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分别为0.00004μm、0.0778μm、0.0535μm和0.1325μm，在细胞水平的抗病毒效果较好。但并未涉及关于h9n2亚型流感病毒的报道。


技术实现要素：

5.针对现阶段h9n2亚型禽流感疫情在我国的严峻形势及没有有效的防治药物的问题，本发明通过抗h9n2亚型禽流感病毒的多肽，其可以应用于制备治疗禽流感病毒的药物中，也可与抗病毒中药，干扰素，流感病毒抗体，转移因子等的一种或几种进行组方，制备抗h9n2亚型禽流感病毒的产品。
6.本发明的技术方案如下：一种抗h9n2亚型禽流感病毒的多肽，所述多肽的氨基酸序列如seq id no:1所示；氨基酸序列：rrkkwlvffvifyffr。
7.一种核苷酸编码上述抗原表位多肽；所述的核苷酸序列为seq id no:2；核苷酸序列：cgtcgtaaaaaatggctggttttttttgttattttttatttttttcgt。
8.一种重组表达载体，所述的重组表达载体携带有上述核苷酸。
9.上述多肽在制备治疗禽流感病毒的药物中的应用。
10.优选地，所述的禽流感病毒为鸡禽流感病毒。
11.本发明的有益效果1、进行了抗h9n2 aiv的鸡胚试验，发现fp4多肽与h9n2 aiv混合后，按每枚鸡胚分别接种fp4多肽0.001mg～0.016mg和200 eid50的病毒，鸡胚存活率最高可达100%。
12.2、在制备治疗禽流感病毒的药物中会有很大的应用前景，与抗病毒中药，干扰素，流感病毒抗体，转移因子等的一种或几种进行组方，制备抗h9n2亚型禽流感病毒的产品。
具体实施方式
13.实施例1一种抗h9n2亚型禽流感病毒的多肽，所述多肽的氨基酸序列如seq id no:1所示；氨基酸序列：rrkkwlvffvifyffr。
14.一种核苷酸编码上述抗原表位多肽；所述的核苷酸序列为seq id no:2；核苷酸序列：cgtcgtaaaaaatggctggttttttttgttattttttatttttttcgt。
15.一种重组表达载体，所述的重组表达载体携带有上述核苷酸。
16.实施效果例1在治疗鸡禽流感上的应用实施方案：1材料与方法1.1主要实验材料和实验动物h9n2亚型禽流感病毒分离株（编号：402，简称h9n2 aiv），由本实验室保存；10日龄spf鸡胚，由山东昊泰实验动物繁育有限公司提供；fp4多肽（氨基酸序列：rrkkwlvffvifyffr），委托华大基因合成。
17.主要试剂青链霉素双抗溶液（生工）。
18.病毒复苏与稀释h9n2 aiv分离株解冻，接种至10日龄鸡胚，37℃静置培养3天，收集尿囊液，用生理盐水稀释至200eid
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备用。
19.试验药品的配制1.4.1预实验精密称取fp4多肽1mg，用50μl乙醇溶解，再加入950μl无菌水稀释至1mg/ml的储备液，分装。取200μl储备液与300μl无菌水、500μl双抗溶液混匀，配制0.2mg/ml fp4溶液作为工作液，37℃放置1h。
20.1.4.2正式实验称取5mg fp4多肽，加入50μl乙醇溶解多肽，再加入950μl无菌水和1ml双抗稀释至2.5mg/ml的储备液，分装。
21.攻毒保护实验1.5.1试验鸡胚的分组与处置见表1、表2。
22.表1 预实验方案
表2正式实验方案 1.5.2死亡情况及血凝(ha)效价测定鸡胚37℃静置培养120d，每天观察死亡情况，弃去24h内死亡的鸡胚，接种病毒120h后收集各组鸡胚的尿囊液，分别测定各组的ha效价，记录并统计结果。
23.结果2.1预实验48h内阳性对照组、2组鸡胚最早出现死亡，72h内1组鸡胚出现死亡，96h时1组、2组、阳性对照组鸡胚全部死亡，120h时3组和阴性对照组存活率100%。病毒血凝(ha)效价结果显示（表3），混合接种组效价均为0，效果最好，其次是高剂量先接种组，后接种组与对照无明显差别。
24.表3预实验组鸡胚h9n2ha效价和存活率2.2正式实验48h内1组、2组、阳性对照组鸡胚最早出现死亡，72h内3组鸡胚出现死亡，96h时1组、2组、3组、阳性对照组鸡胚全部死亡，120h时5、6混合组和阴性对照组存活率100%。病毒血凝(ha)效价结果显示（表4），中、高剂量混合接种组效价均为0，效果最好，其次是低剂量混合组的1.3；高剂量预防（3组）效价降低1.1，死亡时间延迟，具有一定的抗病毒作用，低、中剂量预防组无明显抗病毒作用。
25.表4预实验组鸡胚h9n2ha效价和存活率
3结论3.1安全性fp4多肽对鸡胚安全。
26.有效性fp4多肽具有抑制病毒侵染鸡胚的作用，其最有效的作用方式是直接与病毒混合接触，有效剂量≥0.001mg/胚，鸡胚存活率达87.5%~100%，其作用机理可能是fp4多肽靶向结合h9n2 aiv的ha头部（ha1），使病毒丧失与宿主细胞受体结合的能力。单独接种0.016mg/胚的fp4，然后接种h9n2 aiv，不能提高存活率，但能总体降低抗体效价，抗病毒效果较弱。接种h9n2 aiv后，再单独接种0.016mg/胚的fp4多肽，无明显抗病毒效果。
27.应用前景fp4多肽具有显著地抗病毒作用，但多肽口服后易被动物体内的酶降解，因此，在养禽业应采用肌肉注射、皮下注射、鼻腔滴入等方式用药，并可与抗病毒中药，干扰素，流感病毒抗体，转移因子等的进行组方，制备抗h9n2 aiv兽药。
28.实施效果例2本发明的抗h9n2亚型禽流感病毒的多肽在预防h9n2禽流感上的应用1材料与方法1.1主要实验材料和实验动物h9n2亚型禽流感病毒分离株（编号：402，简称h9n2 aiv，eid
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为10
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/0.2ml），由本实验室保存；1日龄spf雏鸡，由山东家禽研究所提供；fp4多肽（氨基酸序列：rrkkwlvffvifyffr），委托华大基因合成。
29.试验药品的配制称取6mg fp4多肽，加入100μl乙醇溶解多肽，再加入适量无菌水稀释至3mg/ml的储备液，分装冷冻保存。临用前取0.1ml储备液稀释至0.03mg/ml作为工作液备用。
30.试验鸡分组将40只雏鸡随机分为5组，每组8只，分别为fp4低剂量组、fp4中剂量组、fp4高剂量组、阳性对照组、阴性对照组，具体分组与处理情况见表5。
31.表5 实验鸡的分组与处理
1.4 病料的采集与处理该试验持续14天，每日观察鸡的临床表现，对各实验组每天用棉拭子采取泄殖腔粘液，提取粘液中的病毒rna，进行rt
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pcr鉴定粘液中的h9n2病原。
32.2 结果2.1 试验鸡的临床症状阳性对照鸡接种h9n2 48h后表现为采食量减少，精神沉郁、呆立、炸毛，少数鸡鼻腔内有分泌物流出，所有分组实验全程无鸡死亡。低剂量组少数鸡有流泪、缩颈、呆立症状，中、高剂量组无明显症状。
33.2.2 rt
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pcr结果按1.4方法处理的粘液rna样品经rt
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pcr鉴定后，发现中、高剂量组攻毒后仅第1天检测到病毒rna，低剂量组攻毒后仅1、2、3天检测到病毒rna，阳性对照组攻毒后第1
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7天均检测到病毒rna，而阴性对照组均未检测到病毒，具体结果如表6。
34.表6 利用rt
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pcr检测泄殖腔拭子的结果3 结论在雏鸡感染h9n2病毒前通过点眼滴鼻方式用fp4溶液预处理，通过rt
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pcr方法检测泄殖腔拭子的病毒rna，结果发现fp4可以有效抑制h9n2病毒通过呼吸道黏膜进入鸡体，为其在临床上预防h9n2亚型低致病性禽流感提供了依据。