一种即时检测血清中MOG-IgG水平的冻存细胞模型构建及检测方法与流程

一种即时检测血清中mog
‑
igg水平的冻存细胞模型构建及检测方法
技术领域
1.本发明涉及血清生物标志物检测领域，涉及一种含gfp
‑
mog质粒的冻存细胞模型构建，以及用于即时检测人体血清中mog
‑
igg的方法。


背景技术：

2.髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,mog)是髓鞘膜和少突胶质细胞表面最外层的膜蛋白。机体由于免疫失调产生的抗mog抗体(mog
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igg)针对性地攻击mog是导致中枢神经系统炎症脱髓鞘疾病的关键因素。目前，mog
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igg的具体致病机制尚未完全阐明，基于血清学、免疫学、神经病理等多方面开展了相关研究，初步证实mog
‑
igg相关疾病很可能作为一个新的疾病实体。因此，2018年国际上发布了《mog
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igg相关疾病(mog
‑
igg associated disorders，mogad)的拟诊断指南》，而我国也于2020年发布了《抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白免疫球蛋白g抗体相关疾病诊断和治疗中国专家共识》。
3.早期的检测人体血清mog
‑
igg的方法多为酶联免疫吸附测定法(elisa)和免疫印迹法(western blot)，但其敏感性和特异性较差；mogad国际指南和中国专家共识中均推荐基于活细胞的检测方法(cba)用于人体血清mog
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igg检测。但是，当前临床检测中应用的各种cba法测定血清mog
‑
igg前大多需要提前重新构建质粒转染细胞模型，无法即时、准确地定量检测血清中mog
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igg水平，降低了检测结果对临床指导的时效性。
4.因此，迫切需要一种即时、快速、高效、准确定量的检测血清中mog
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igg水平的方法，该方法具有十分重要的研究意义和临床应用价值。


技术实现要素：

5.针对现有的技术问题，本发明提供一种即时检测人体血清中mog
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igg水平的冻存细胞模型构建及检测方法，以解决目前检测中存在的检测耗时长、准确定量差等问题。
6.本发明提供一种用于即时检测人体血清中mog
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igg水平的冻存细胞模型构建方法，含有如下步骤：
7.步骤1.重组gfp
‑
mog质粒构建；
8.步骤2.将gfp
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mog质粒转染至hek293细胞中，建立gfp
‑
mog
‑
hek293细胞；
9.步骤3.将gfp
‑
mog
‑
hek293细胞分装、冻存，即获得一种可即时检测血清mog
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igg水平的冻存细胞模型。
10.其中，步骤1含有如下步骤：
①
在mog目的基因两端加设ecori/nhei酶切位点；
②
在pires2
‑
acgfp1载体中插入ecori/nhei酶切位点；
③
通过dna ligation kit将
①
中两端加设ecori/nhei酶切位点的mog目的基因，插入到
②
中插入了ecori/nhei酶切位点的pires2
‑
acgfp1载体中，获得gfp
‑
mog质粒。
④
使用限制性内切酶hindⅲ，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒。
11.其中，步骤2所述转染选自应用neon电转染系统将gfp
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mog质粒转染至hek293细胞
中，建立gfp
‑
mog
‑
hek293细胞。
12.其中，上述neon电转染系统条件为脉冲电压(voltage)1100v,脉冲时间(width)20ms,脉冲数(pluse number)2pulses。
13.其中，步骤3含有如下步骤：
①
将gfp
‑
mog
‑
hek293细胞重悬于细胞冻存液，置于容器中，冷冻；
②
将
①
中的容器移至液氮中长期储存，获得一种可即时检测血清mog
‑
igg水平的冻存细胞模型。
14.其中，上述
①
中将gfp
‑
mog
‑
hek293细胞以(1
‑
5)
×
106cells/ml的密度重悬于细胞冻存液。
15.其中，上述
①
中所述容器为可控制冷却速率的冻存盒。
16.其中，上述冻存盒的盒内冷却速率为
‑
1℃/minute
17.其中，上述
①
中冷冻条件是
‑
80℃冰箱12小时。
18.本发明还提供一种利用上述冻存细胞模型即时检测人体血清中mog
‑
igg水平的检测方法，含有如下步骤：
19.将上述冻存细胞模型复苏后与待测样品混合，进行第一次孵育，洗涤后加入apc标记的抗人igg荧光抗体(miltenyi biotec，order no.130
‑
093
‑
189)，进行第二次孵育。
20.其中，所述复苏是将冻存的gfp
‑
mog
‑
hek293细胞融化后，迅速加入到试管中，再加入缓冲液10ml，离心，洗涤。
21.其中，所述复苏是将冻存的gfp
‑
mog
‑
hek293细胞通过水浴恒温恒速振荡器(37℃，5转/s)融化后，迅速加入到15ml容量的试管中，再加入37℃预热的0.01m磷酸盐缓冲盐溶液(0.01m pbs)缓冲液10ml，离心(1200rpm/8min)，即完成一次洗涤，洗涤三次后完成细胞复苏。
22.其中，所述第一次孵育是将待测血清样品按1：5，用pbs
‑
2缓冲液(0.01m pbs，15mm edta，2％bsa，0.05％nan3，10％normal goat serum)稀释，将装有50μl稀释后的血清样品和gfp
‑
mog
‑
hek293细胞的试管置于旋转培养器中孵育，孵育条件4℃，300rpm，30min。
23.其中，所述第二次孵育是将荧光抗体按1：20，用pbs
‑
2缓冲液稀释，将装有100μl稀释后的荧光抗体和gfp
‑
mog
‑
hek293细胞的试管置于旋转培养器中孵育，孵育条件4℃，300rpm，30min。
24.本发明的有益效果有以下几方面：
25.1、本发明制备方法可以获得分装、冻存的gfp
‑
mog
‑
hek293细胞模型用于人体血清mog
‑
igg的检测。本发明的检测材料较以往elisa法和western blot法，对人体血清mog
‑
igg检测的灵敏性和特异性均提高至90％以上，还可依据需求复苏冻存细胞模型实现对血清样品的即时检测，显著缩短了检测时间。
26.2、本发明制备的检测材料gfp
‑
mog
‑
hek293细胞模型最长冻存时间长达5个月，仍可以准确定量检测血清中mog
‑
igg水平。
27.3、本发明制备的检测材料gfp
‑
mog
‑
hek293细胞模型可用于流式细胞术检测，定性、准确定量分析血清中mog
‑
igg水平。
附图说明
28.图1是本发明重组质粒的电泳鉴定结果。
29.图2a和2b利用当日新鲜制备的gfp
‑
mog
‑
hek293细胞(非冻存的gfp
‑
mog
‑
hek293细胞)检测人体血清中mog
‑
igg的结果，2a为阴性结果，2b为阳性结果；
30.图2c和2d利用冻存136天后复苏的gfp
‑
mog
‑
hek293细胞模型检测人体血清中mog
‑
igg的结果，2c为阴性结果，2d为阳性结果。
31.图3实施例2和3的检测结果的一致性分析结果。
具体实施方式
32.以下是具体实施方式，不应对本发明范围构成限制。
33.实施例1冻存细胞模型构建
34.冻存细胞模型构建含有如下步骤：
35.步骤1：重组gfp
‑
mog质粒
36.mog目的基因购自genscript公司；pires2
‑
acgfp1载体购自clontech公司；将带有ecori/nhei酶切位点的mog目的基因插入到pires2
‑
acgfp1载体中，获得重组的全长gfp
‑
mog质粒。经过琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒后，该质粒可以重复使用。
37.步骤2：建立gfp
‑
mog
‑
hek293细胞
38.①
培养hek293细胞：dmem低糖培养基与56℃灭活的fetal bovine serum(fbs)按照9：1的配比，再加入0.2ml硫酸卡那霉素(kanamycin)，配制成dmem(10％fbs+kanamycin)培养基；每次通过pet(0.01m pbs，0.02％edta，0.1％trypsin)进行细胞传代，细胞接种于含有dmem(10％fbs+kanamycin)培养基10ml的100mm细胞培养皿中，细胞数量约1.5
×
106cells/ml；培养箱条件：37℃、5％co2、湿度45％
‑
65％。
39.②
计算hek293细胞数量：通过显微镜观察，待100mm细胞培养皿中hek293细胞面积达70％
‑
80％时，清除dmem(10％fbs+kanamycin)培养基，加入pet 6ml轻度清洗2次后，放入37℃、5％co2、湿度45％
‑
65％的培养箱中10min；加入dmem(10％fbs+kanamycin)培养基6ml后回收细胞至15ml试管中，离心3min，25℃，3000rpm；去上清，加入opti
‑
mem(1x)reduced serum medium培养基6ml；应用细胞计数仪器计数，细胞数量保持1.5
×
106cells/ml。
40.③
根据hek293细胞数1
×
106cells需要gfp
‑
mog质粒5μg的配比方式，将gfp
‑
mog质粒通过neon电转染系统处理后加入到hek293细胞中，并置于37℃，5％co2、湿度45％
‑
65％的培养箱中培养48h，即获得gfp
‑
mog
‑
hek293细胞。neon电转染系统条件：脉冲电压(voltage)1100v,脉冲时间(width)20ms,脉冲数(pluse number)2pulses。
41.步骤3：gfp
‑
mog
‑
hek293细胞分装、冻存：
42.48h后，将gfp
‑
mog
‑
hek293细胞以(1
‑
5)
×
106cells/ml的密度重悬于细胞冻存液(fbs：二甲亚砜(dmso)＝9：1)中，进一步分装入细胞储存管。将细胞储存管移至预先装好异丙醇的冻存盒中，并将该冻存盒放置于
‑
80℃冰箱12h后(冻存盒内冷却速率为
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1℃/minute)，将细胞储存管从冻存盒中取出并置于液氮中长期储存。
43.实施例2人体血清中mog
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igg的检测1
44.人体血清中mog
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igg的检测含有如下步骤：
45.将实施例1得到的分装冻存gfp
‑
mog
‑
hek293细胞模型的储存管(已经在液氮中保存136天)从液氮中取出后迅速置于37℃预热的振荡水浴箱中30s，振荡速度为5转/s。待细胞悬液融化后迅速将其置于清洁干燥的15ml试管内并加入37℃预热的0.01m pbs缓冲液
10ml洗涤，1200rpm离心8min，去除上清液。重复上述步骤洗涤细胞3次后即完成细胞复苏。
46.将pbs
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1缓冲液(0.01m pbs，2mm edta，0.5％bsa，0.02％nan3)1ml加入到每个gfp
‑
mog
‑
hek293细胞试管中孵育，孵育条件：4℃，300rpm，10min。
47.离心(4℃，3000rpm，3min)后去除上清液，加入0.01m pbs缓冲液1ml后进行再次离心(4℃，3000rpm，3min)，之后去除上清液，即完成一次洗涤，共洗涤一次。
48.将血清样品按1：5，用pbs
‑
2缓冲液(0.01m pbs，15mm edta，2％bsa，0.05％nan3，10％normal goat serum)稀释，将稀释后的血清样品50μl加入到gfp
‑
mog
‑
hek293细胞试管中后置于旋转培养器中孵育，孵育条件：4℃，300rpm，30min。
49.直接加入0.01m pbs缓冲液后进行离心(4℃，3000rpm，3min)，之后去除上清液，即完成一次洗涤，共洗涤三次。
50.将荧光抗体按1：20，用pbs
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2缓冲液稀释，将稀释后的荧光抗体100μl加入到gfp
‑
mog
‑
hek293细胞试管中后置于旋转培养器中孵育，4℃，300rpm，30min
51.再次直接加入0.01m pbs缓冲液后进行离心(4℃，3000rpm，3min)，之后去除上清液，即完成一次洗涤，共洗涤三次。
52.将4％多聚甲醛300μl加入到gfp
‑
mog
‑
hek293细胞试管后，应用cantoii流式细胞仪检测，并分析结果。
53.实施例3人体血清中mog
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igg的检测2
54.将实施例2中步骤1的液氮中保存136天的gfp
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mog
‑
hek293细胞替换为非冻存的gfp
‑
mog
‑
hek293细胞，其余步骤及操作均与实施例2一致。
55.实施例4检测结果判读如下：
56.阳性结果的判读，本发明制备检测人体血清mog
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igg水平的冻存细胞模型，用于即时检测mogad患者及健康者血清中mog
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igg水平，通过计算q2象限的mog
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igg阳性细胞百分比对血清mog
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igg水平进行准确定量。其中图2a和2b是应用当日制备gfp
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mog
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hek293细胞模型(非冻存gfp
‑
mog
‑
hek293细胞，对应实施例3)检测人体血清mog
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igg水平的结果图例，2a为阴性结果，2b为阳性结果；图2c和2d是应用冻存136天后复苏的gfp
‑
mog
‑
hek293细胞模型检测人体血清mog
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igg水平的结果图例(对应实施例2)，2c为阴性结果，2d为阳性结果。
57.实施例2和3，二者的最终检测结果的具有较高的一致性，结果见图3。其中，横坐标：基于冻存136天后复苏的gfp
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mog
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hek293细胞的检测结果(阳性细胞％)；纵坐标：基于非冻存的gfp
‑
mog
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hek293细胞的检测结果(阳性细胞％)；r2＝0.9611，具有较高的拟合度。
58.发明人还考察了本发明制备的检测材料gfp
‑
mog
‑
hek293细胞模型在冻存时间长达5个月后，发现仍可以准确定量检测血清中mog
‑
igg水平。