一种R-硫辛酸的合成方法与流程

一种r
‑
硫辛酸的合成方法
技术领域
1.本发明属于药物化学合成技术领域，具体涉及一种r
‑
硫辛酸的合成方法。


背景技术：

2.α
‑
硫辛酸是一种能消除加速老化和致病的自由基、类似维他命的化合物，兼具水溶性又具脂溶性的特性，可协助辅酶进行有利于机体免疫力的生理代谢，是一种万能抗氧化剂药物。α
‑
硫辛酸对肝脏疾病、糖尿病、hiv病毒、肿瘤、神经系统退化、放射性伤害症、砷、汞、镉等重金属中毒等许多疾病的治疗都有一定的效果，例如可以辅助治疗ii型糖尿病改善胰岛功能葡萄糖代谢，保护神经细胞，可预防白内障，可预防肌肉损伤等等。
3.如下化学结构式所示，在α
‑
硫辛酸的分子结构中，二硫戊环的位置3中有一个手性碳，具有旋光性，产生了两种相应的右旋(r)和左旋(s)对映异构体。研究表明，α
‑
硫辛酸的这两种对映异构体显示出不同的生物活性和药理学性质，其中r
‑
型生物活性远高于s
‑
型，s
‑
型基本无活性，但亦无毒副作用，这可能是由于在硫辛酸的代谢过程中，大量的r
‑
型硫辛酸可透过细胞膜及线粒体膜进入细胞和线粒体中被还原成二氢硫辛酸，而s
‑
型仅有少量进入细胞被还原。二氢硫辛酸具有比硫辛酸更强的抗氧化能力，内源性抗氧化剂的再生和氧化性损伤的修复均需通过二氢硫辛酸的形式才能实现。r
‑
硫辛酸是人体内硫辛酸的天然形式，作为维生素类药物，疗效优于外消旋的α
‑
硫辛酸，在治疗ii型糖尿病促进骨骼肌摄取葡萄糖、减少血浆胰岛素和游离脂肪酸水平、改善胰岛素作用下的糖原合成以及葡萄糖氧化作用、增加动物血流含氧量等方面，r
‑
硫辛酸比外消旋体α
‑
硫辛酸更具有活性，在预防和治疗心脏病、糖尿病、肝病及老年痴呆症等疾病方面具有更广泛的前景，r
‑
硫辛酸已经越来越多的代替并且最终将全部代替消旋的α
‑
硫辛酸，成为普遍使用的药品和营养补充品。
[0004][0005]
r
‑
硫辛酸的合成方法很多，但主要有以下三类：一是目前工业化生产r
‑
硫辛酸的方法，以6,8
‑
二氯辛酸乙酯为起始原料，经硫代、环合、水解，得到外消旋体α
‑
硫辛酸，再用拆分剂多次拆分，精制得到r
‑
硫辛酸，这一步的收率不超过50％。虽然人们已经开发了s
‑
硫辛酸消旋方法，但是将s型硫辛酸转化成混旋硫辛酸对实际生产条件要求比较苛刻，对设备具有腐蚀性，并且收率较低，造成生产成本昂贵；二是以6,8
‑
二羟基辛酸甲酯或6
‑
羟基
‑8‑
氯辛酸甲酯为起始原料，制成甲磺酸酯，然后立体选择性成r
‑
硫辛酸，此法工艺比较复杂，尤其不易得到纯品；三是将外消旋6,8
‑
二氯辛酸乙酯水解成(
±
)二氯辛酸，再依次用拆分
剂拆分、再硫代和环合，该方法基本可以节省成本，但由于仍有约50％的s
‑
(
‑
)
‑
6,8
‑
二氯辛酸没有利用，因而成本较高。
[0006]
包括上面提及的三种方法在内的已有技术中r
‑
硫辛酸的合成方法均存在成本高、收率低和原料消耗大而并不能满足工业化放大生产的要求，并且由于废物排放高而不符合绿色环保生产要求的缺憾。
[0007]
鉴于上述已有技术，有必要继续探索而得以弥补前述不足的r
‑
硫辛酸的合成方法，下面将要介绍的技术方案便是在这种背景下产生的。


技术实现要素：

[0008]
本发明的任务在于提供一种r
‑
硫辛酸的合成方法，该方法工艺条件温和、有助于降低制备成本、有利于提高产物纯度和收率以及光学纯度并且有益于体现高效绿色环保而得以满足工业化放大生产要求。
[0009]
本发明的任务是这样来完成的，一种r
‑
硫辛酸的合成方法，包括如下步骤：
[0010]
a)制备中间体
‑
1，将n
‑
(5
‑
溴戊基)酞亚胺与锌粉、氯化锂、三甲基氯硅烷、1,2
‑
二溴乙烷和四氢呋喃混合，反应生成锌溴化物中间体，并且控制反应生成锌溴化物中间体的反应温度和反应时间，接着将3
‑
{[2
‑
(三甲基硅烷基)乙氧基]甲氧基}丙酰氯与所述的锌溴化物中间体在四(三苯基膦)钯和四氢呋喃体系中进行取代反应，得到中间体
‑
1(式int
‑
1)，反应式为：
[0011][0012]
b)制备中间体
‑
2，将步骤a)得到的中间体
‑
1与水合肼在水体系中进行肼解反应，得到中间体
‑
2(式int
‑
2)，反应式为：
[0013][0014]
c)制备中间体
‑
3，将由步骤b)得到的中间体
‑
2在催化剂氯羰基氢化[4,5
‑
双
‑
(二
‑
异丙基膦基)吖啶]钌(ii)的作用下，在氢氧化钠、水和1,4
‑
二氧六环的体系中，进行催化氧化反应，得到中间体
‑
3(式int
‑
3)，反应式为：
[0015]
[0016]
d)制备中间体
‑
4，将由步骤c)得到的中间体
‑
3在催化剂浓硫酸的作用下，在乙醇溶液中，加热回流进行酯化反应，得到中间体
‑
4(式int
‑
4)，反应式为：
[0017][0018]
e)制备中间体
‑
5，将近平滑假丝酵母菌引入发酵培养基中进行扩增培养，离心分离，得到静息细胞，将该静息细胞悬浮于缓冲水溶液中，加入由步骤d)得到的中间体
‑
4、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，进行酶催化的手性还原反应，得到中间体
‑
5(式int
‑
5)，反应式为：
[0019][0020]
f)制备中间体
‑
6，将由步骤e)得到的中间体
‑
5在四丁基氟化铵和溶剂体系中进行脱保护反应，得到中间体
‑
6(式int
‑
6)，反应式为：
[0021][0022]
g)制备中间体
‑
7，将由步骤f)得到的中间体
‑
6与氯化试剂、催化剂及溶剂相混合，进行氯化反应，得到中间体
‑
7(式int
‑
7)，反应式为：
[0023][0024]
h)制备中间体
‑
8，将由步骤g)得到的中间体
‑
7加入到硫化钠、硫磺、相转移催化剂和水的体系中，进行环合反应，得到中间体
‑
8(式int
‑
8)，反应式为：
[0025][0026]
i)制备成品，将由步骤h)得到的中间体
‑
8在碱性条件下进行水解反应，得到r
‑
硫辛酸，反应式为：
[0027][0028]
在本发明的一个具体的实施例中，步骤a)中所述的n
‑
(5
‑
溴戊基)酞亚胺、3
‑
{[2
‑
(三甲基硅烷基)乙氧基]甲氧基}丙酰氯、锌粉、氯化锂、三甲基氯硅烷以及四(三苯基膦)钯的投料摩尔比为1.0∶1.0∶3.0～6.0∶1.5～2.5∶0.05～0.1∶0.05～0.1；所述控制反应生成锌溴化物中间体的反应温度和反应时间是将反应温度和反应时间分别控制为40～60℃以及1～3h；所述的取代反应的温度为20～35℃，反应时间为2～6h。
[0029]
在本发明的另一个具体的实施例中，步骤b)中所述的中间体
‑
1与水合肼的投料摩尔比为1.0∶1.0～1.3；所述的肼解反应的温度为80～100℃，反应时间为1～3h。
[0030]
在本发明的又一个具体的实施例中，步骤c)中所述的中间体
‑
2、催化剂氯羰基氢化[4,5
‑
双
‑
(二
‑
异丙基膦基)吖啶]钌(ii)、氢氧化钠的投料摩尔比为1.0∶0.01～0.05：0.5～1.0；所述的催化氧化反应是在敞开大气中进行，反应的温度为100～120℃，反应时间为10～20h。
[0031]
在本发明的再一个具体的实施例中，步骤e)中所述的发酵培养基的ph值为3～8，该发酵培养基由以下按重量计的原料构成：葡萄糖10～50g、蛋白胨1～20g、磷酸二氢钾1～10g、磷酸氢二钾1～10g、氯化钠0.1～2g、硫酸镁0.1～2g和水1000g；所述扩增培养的温度为20～50℃，扩增培养的时间为24～48h；所述的静息细胞、中间体
‑
4、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的投料重量比为1～300∶0.22～66∶0.01～0.5∶0.3～90∶0.06～0.66；所述酶催化的手性还原反应的温度为20～35℃，反应时间为6～12h，反应体系的ph为5.5～7.0。
[0032]
在本发明的还有一个具体的实施例中，步骤f)中所述的溶剂为四氢呋喃、甲基叔丁基醚或1,4
‑
二氧六环；所述的中间体
‑
5与四丁基氟化铵的投料摩尔比为1.0∶2.0～4.5；所述的脱保护反应的温度为50～100℃，反应时间为2～6h。
[0033]
在本发明的更而一个具体的实施例中，步骤g)中所述的中间体
‑
6、氯化试剂和催化剂的投料摩尔比为1.0∶3.5～6.0∶0.5～1.5；所述的氯化反应的温度为50～80℃，反应时间为2～6h。
[0034]
在本发明的进而一个具体的实施例中，所述的氯化试剂为氯化亚砜、三氯氧磷、磺酰氯、三氯化磷、五氯化磷、草酰氯、乙酰氯或氯甲酸异丁酯；所述的催化剂为三乙胺、n,n
‑
二异丙基乙胺、二乙胺、乙二胺、吡啶、4
‑
二甲氨基吡啶、2,6
‑
二甲基吡啶、四甲基胍、n
‑
甲基吡咯烷酮、n
‑
甲基吗啡啉、n
‑
乙基吗啡啉、1,8
‑
二氮杂双环[5.4.0]十一碳
‑7‑
烯、1,5
‑
二氮杂二环[4.3.0]
‑
壬
‑5‑
烯或1,4
‑
二氮杂二环[2.2.2]辛烷；所述的溶剂为二氯甲烷、1,2
‑
二氯乙烷、氯仿、四氢呋喃、甲基叔丁基醚、1,4
‑
二氧六环或乙腈。
[0035]
在本发明的又更而一个具体的实施例中，步骤h)中所述的中间体
‑
7、硫化钠、硫磺和相转移催化剂的投料摩尔比为1.0∶1.2～2.0∶1.2～2.0∶0.01～0.1；所述环合反应的温度为75～90℃，反应时间为1.5～3h；所述的相转移催化剂为苄基三乙基氯化铵、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵、四丁基碘化铵、四丁基氟化铵、四丁基硫酸氢铵、四甲基氟化铵、四甲基氯化铵、四甲基溴化铵、三辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵或十四烷基三甲基氯化铵。
[0036]
在本发明的又进而一个具体的实施例中，步骤i)所述水解反应的温度45～55℃，水解反应的时间为1.5～2.5h。
[0037]
本发明提供的技术方案具有以下技术效果：其一，工艺条件温和，手性中间体和终产品的光学纯度高(hplc含量达98.9
‑
99.5％；ee值为98.9
‑
99.1％)，有利于终产品原料药
的质量控制和提高；其二，本发明的工艺路线所用试剂原料易得，并且收率达95
‑
96％，技术方案合理并且对环境友好，可以大量生产来满足使用需求，适用于工业化生产。
具体实施方式
[0038]
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步阐述，显然，本发明的保护范围并不限于实施例，本领域技术人员所做的本发明的其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0039]
起始原料3
‑
{[2
‑
(三甲基硅烷基)乙氧基]甲氧基}丙酰氯，可通过由3
‑
羟基丙酸甲酯与2
‑
(三甲基硅烷基)乙氧甲基氯进行醚合成、水解和酰氯化制备得到。
[0040]
催化剂氯羰基氢化[4,5
‑
双
‑
(二
‑
异丙基膦基)吖啶]钌(ii)，可通过由4,5
‑
二
‑
(二
‑
异丙基膦基甲基)吖啶与(tb
‑5‑
24)
‑
羰基氯氢双(三苯基膦)钌，或与三(三苯基膦)羰基氢氯化钌(ii)的配体取代反应制备得到，参见专利wo2020141520a1或wo2010018570a1对相同化合物的制备方法。
[0041]
此外，在下面的实施例中，对提及中间体
‑
1同时采用式int
‑
1示意、中间体
‑
2同时采用式int
‑
2示意、中间体
‑
3同时采用式int
‑
3示意、中间体
‑
4同时采用式int
‑
4示意、中间体
‑
5同时采用式int
‑
5示意、中间体
‑
6同时采用式int
‑
6示意、中间体
‑
7同时采用式int
‑
7示意以及中间体
‑
8同时采用式int
‑
8示意。
[0042]
实施例1：
[0043]
a)制备中间体
‑
1：
[0044]
在5l反应瓶中，加入无水四氢呋喃(100ml)，在氮气保护和常温搅拌下，加入无水氯化锂(14.0g,0.33mol)、锌粉(44.0g,0.67mol)，搅拌10min，加入1,2
‑
二溴乙烷(10ml)和无水四氢呋喃(100ml)的混合溶剂，加入三甲基氯硅烷(1.2g,11mmol)，升温至40℃搅拌30min，降温至常温，加入n
‑
(5
‑
溴戊基)酞亚胺(65.0g,0.22mol)，反应混合液升温至40℃反应3h，降至常温，抽滤除去不溶物，收集滤液，加入四(三苯基膦)钯(12.7g,11.0mol)，常温搅拌30min，加入3
‑
{[2
‑
(三甲基硅烷基)乙氧基]甲氧基}丙酰氯(52.4g,0.22mol)的无水四氢呋喃溶液(100ml)，保温20℃反应6h，反应完毕，滴加入搅拌中的10％氯化铵水溶液，加入二氯甲烷萃取，分层，收集有机相，用食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸至干，粗品经层析柱纯化，得到中间体
‑
1(82.5g)，收率90％，本实施例(即“本步骤”，以下同)的反应式如下：
[0045][0046]
b)制备中间体
‑
2：
[0047]
中间体
‑
1(82.0g,0.20mol)与80％水合肼(12.2g,0.20mol)混合，加入水(50ml)，升温80℃反应3h，反应完毕，降至室温，滴加稀醋酸溶液酸化至ph＝6～7，降至10℃，过滤除去不溶物，收集滤液，加入氨水调ph＝10，加入二氯甲烷萃取，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸至干，得到中间体
‑
2(51.0g)，收率90％，本实施例的反应式如下：
[0048]
c)制备中间体
‑
3：
[0049]
中间体
‑
2(50.0g,0.17mol)与水(600ml)、1,4
‑
二氧六环(600ml)相混合，溶解均匀，加入氢氧化钠(3.5g,0.09mol)，加入氯羰基氢化[4,5
‑
双
‑
(二
‑
异丙基膦基)吖啶]钌(ii)(1.1g,1.8mmol)，敞开反应体系在大气中，升温100℃反应20h，反应完毕，减压浓缩除去有机溶剂，滴加稀盐酸酸化，加入二氯甲烷萃取，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸至干，得到中间体
‑
3(50.3g)，收率96％，本实施例的反应式如下：
[0050][0051]
d)制备中间体
‑
4：
[0052]
在5l反应瓶中加入中间体
‑
3(50.0g,0.16mol)和乙醇(100ml)，搅拌溶解，加入浓硫酸(0.5ml)，加热回流5h，反应完全后，降至室温，滴加碳酸氢钠饱和溶液调至中性，减压旋蒸浓缩至干，加入二氯甲烷萃取，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸浓缩至干，得到中间体
‑
4(53.0g)，收率97％，本实施例的反应式如下：
[0053][0054]
e)制备中间体
‑
5：
[0055]
将近平滑假丝酵母菌引入发酵培养基中，在30℃并且在180rpm的搅拌下进行扩增培养48h，近平滑假丝酵母菌与发酵培养基的体积比为1∶10，扩增培养结束后进行离心分离，得到静息细胞，在本步骤中，所述的近平滑假丝酵母菌(candida parapsilosis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmcc no.9630。本步骤中的所述发酵培养基由以下按重量称取的原料构成：葡萄糖(15.0g)、蛋白胨(5.0g)、磷酸二氢钾(5.0g)、磷酸氢二钾(1.0g)、氯化钠(1.0g)、硫酸镁(0.5g)和水(1000g)，ph值为5。另外配制富集培养基，组成如下：(nh4)2so4(1.0g/l)，kh2po4(3.0g/l)，k2hpo4(6.0g/l)，mgso4(0.5g/l)，cacl2(0.05g/l)。
[0056]
本步骤所述的扩增培养分离的具体过程如下：
[0057]
在250ml锥形瓶内加入富集培养基(50ml)和中间体
‑
4(0.40g)作为碳源，加入土样后，于30℃，180rpm培养1～6天。之后将该培养液涂布于丰富培养基平板上，30℃培养1～3
天，长出的单菌落进行平板划线分离纯化，将得到的单菌落接种到液体丰富培养基中，在30℃，180rpm培养2天后，离心分离得到静息细胞(65.7g)。
[0058]
在5l反应瓶中，加入1l磷酸钠缓冲溶液(0.1m，ph 6.0)、由上述得到的静息细胞(10.0g)、中间体
‑
4(52.0g,0.16mol)、葡萄糖脱氢酶液(5u)、葡萄糖(3.0g)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(0.65g)，在30℃下，通过ph仪自动滴加0.5m naoh溶液使反应体系的ph控制在6.5，反应10h，反应结束后过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋蒸至干得到中间体
‑
5(51.0g)，gc含量98.1％，收率97％，旋光值
‑
19.0
°
，ee值99.4％，本实施例的反应式如下：
[0059][0060]
手性气相色谱分析条件：色谱柱为手性毛细管柱cp
‑
chirasil
‑
dexcb，以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，反应产物乙酰化后进行分析，柱温160℃，测定产物ee值；
[0061]
f)制备中间体
‑
6：
[0062]
在5l反应瓶中，加入中间体
‑
5(51.0g,0.15mol)和四氢呋喃(100ml)，搅拌溶解，加入四丁基氟化铵(80.0g,0.31mol)，升温100℃反应2h，反应完毕，降至室温，抽滤过硅藻土，收集滤液，减压浓缩除去有机溶剂，加入二氯甲烷萃取，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸至干，粗品经层析柱纯化，得到中间体
‑
6(28.0g)，收率90％，本实施例的反应式如下：
[0063][0064]
g)制备中间体
‑
7：
[0065]
中间体
‑
6(28.0g,0.14mol)、三乙胺(7.0g,69mmol)溶于二氯甲烷(400ml)，降温至0℃，滴加氯化亚砜(58.0g,0.49mol)的二氯甲烷(90ml)溶液，升温50℃反应6h，反应完毕，滴加水淬灭反应液，减压浓缩除去有机溶剂，加入二氯甲烷萃取，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸至干，粗品经甲醇重结晶，真空干燥，得到中间体
‑
7(30.0g)，收率91％，本实施例的反应式如下：
[0066][0067]
h)制备中间体
‑
8：
[0068]
在2l反应瓶中，加入中间体
‑
7(30.0g,0.12mol)、硫磺(5.4g,0.17mol)、四丁基溴化铵(1.7g,5mmol)和水(25ml)，搅拌，升温至85℃，滴加硫化钠水溶液(硫化钠13.8g(0.177mol)，水12ml，即11.5g硫化钠溶于12ml水中得到的硫化钠水溶液，下同)，滴加完毕，在85℃下搅拌2h，降温至60℃，静置分层，油层用甲苯萃取，精制、干燥得中间体
‑
8(26.5g)，
hplc含量98.8％，收率91％，旋光值+112.0
°
，ee值99.2％，本实施例的反应式如下：
[0069][0070]
i)制备成品即制备r
‑
硫辛酸：
[0071]
在2l反应瓶中，加入中间体
‑
8(26.0g,0.11mol)、氢氧化钠(8.3g,0.21mol)、乙醇(100ml)和水(60ml)，搅拌，升温至50℃反应2h，降温至室温，50℃减压旋蒸除去有机溶剂，冰浴冷却至10℃，滴加浓盐酸至ph＝1，抽滤，干燥，得r
‑
硫辛酸(22.0g)，hplc含量99.5％，收率96％，旋光值+112.0
°
，ee值99.1％，本实施例的反应式如下：
[0072][0073][0074]
实施例2：
[0075]
a)制备中间体
‑
1：
[0076]
在5l反应瓶中，加入无水四氢呋喃(60ml)，在氮气保护和常温搅拌下，加入无水氯化锂(16.0g,0.38mol)、锌粉(55.0g,0.84mol)，搅拌10min，加入1,2
‑
二溴乙烷(5ml)和无水四氢呋喃(50ml)的混合溶剂，加入三甲基氯硅烷(1.5g,14mmol)，升温至50℃搅拌30min，降温至常温，加入n
‑
(5
‑
溴戊基)酞亚胺(55.0g,0.19mol)，反应混合液升温至50℃反应2h，降至常温，抽滤除去不溶物，收集滤液，加入四(三苯基膦)钯(16.0g,14mmol)，常温搅拌30min，加入3
‑
{[2
‑
(三甲基硅烷基)乙氧基]甲氧基}丙酰氯(44.3g,0.19mol)的无水四氢呋喃溶液(50ml)，保温30℃反应4h，反应完毕，滴加入搅拌中的10％氯化铵水溶液，加入二氯甲烷萃取，分层，收集有机相，用食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸至干，粗品经层析柱纯化，得到中间体
‑
1(73.0g)，收率94％，反应式同实施例1；
[0077]
b)制备中间体
‑
2：
[0078]
中间体
‑
1(72.0g,0.17mol)与80％水合肼(12.0g,0.19mol)混合，加入水(80ml)，升温90℃反应2h，反应完毕，降至室温，滴加稀醋酸溶液酸化至ph＝6～7，降至10℃，过滤除去不溶物，收集滤液，加入氨水调ph＝10，加入二氯甲烷萃取，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸至干，得到中间体
‑
2(45.0g)，收率91％，反应式同实施例1；
[0079]
c)制备中间体
‑
3：
[0080]
中间体
‑
2(45.0g,0.16mol)与水(500ml)、1,4
‑
二氧六环(500ml)相混合，溶解均匀，加入氢氧化钠(5.0g,0.13mol)，加入氯羰基氢化[4,5
‑
双
‑
(二
‑
异丙基膦基)吖啶]钌(ii)(2.4g,4mmol)，敞开反应体系在大气中，升温110℃反应15h，反应完毕，减压浓缩除去有机溶剂，滴加稀盐酸酸化，加入二氯甲烷萃取，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸至干，得到中间体
‑
3(44.5g)，收率94％，反应式同实施例1；
[0081]
d)制备中间体
‑
4：
[0082]
在5l反应瓶中加入中间体
‑
3(44.0g,0.14mol)和乙醇(80ml)，搅拌溶解，加入浓硫酸(0.5ml)，加热回流5h，反应完全后，降至室温，滴加碳酸氢钠饱和溶液调至中性，减压旋
蒸浓缩至干，加入二氯甲烷萃取，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸浓缩至干，得到中间体
‑
4(46.5g)，收率97％，反应式同实施例1；
[0083]
e)制备中间体
‑
5：
[0084]
将近平滑假丝酵母菌引入发酵培养基中，在20℃并且在180rpm的搅拌下进行扩增培养36h，近平滑假丝酵母菌与发酵培养基的体积比为1∶40，扩增培养结束后进行离心分离，得到静息细胞，在本步骤中，所述的近平滑假丝酵母菌(candida parapsilosis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmcc no.9630。本步骤中的所述发酵培养基由以下按重量称取的原料构成：葡萄糖(10.0g)、蛋白胨(1.0g)、磷酸二氢钾(1.0g)、磷酸氢二钾(10.0g)、氯化钠(0.1g)、硫酸镁(0.1g)和水(1000g)，ph值为8。另外配制富集培养基，组成如下：(nh4)2so4(1.0g/l)，kh2po4(3.0g/l)，k2hpo4(6.0g/l)，mgso4(0.5g/l)，cacl2(0.05g/l)。
[0085]
本步骤所述的扩增培养分离的具体过程如下：
[0086]
在250ml锥形瓶内加入富集培养基(50ml)和中间体
‑
4(0.40g)作为碳源，加入土样后，于30℃，180rpm培养1～6天。之后将该培养液涂布于丰富培养基平板上，30℃培养1～3天，长出的单菌落进行平板划线分离纯化，将得到的单菌落接种到液体丰富培养基中，在30℃，180rpm培养2天后，离心分离得到静息细胞(71.5g)。
[0087]
在5l反应瓶中，加入1l磷酸钠缓冲溶液(0.1m，ph 6.0)、由上述得到的静息细胞(50.0g)、中间体
‑
4(46.0g,0.14mol)、葡萄糖脱氢酶液(5u)、葡萄糖(1.0g)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(0.10g)，在20℃下，通过ph仪自动滴加0.5m naoh溶液使反应体系的ph控制在5.5，反应6h，反应结束后过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋蒸至干得到中间体
‑
5(44.0g)，gc含量97.5％，收率95％，旋光值
‑
19.6
°
，ee值99.3％，反应式及手性气相色谱分析条件同实施例1；
[0088]
f)制备中间体
‑
6：
[0089]
在5l反应瓶中，加入中间体
‑
5(44.0g,0.13mol)和四氢呋喃(100ml)，搅拌溶解，加入四丁基氟化铵(98.0g,0.37mol)，升温70℃反应4h，反应完毕，降至室温，抽滤过硅藻土，收集滤液，减压浓缩除去有机溶剂，加入二氯甲烷萃取，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸至干，粗品经层析柱纯化，得到中间体
‑
6(24.5g)，收率91％，反应式同实施例1；
[0090]
g)制备中间体
‑
7：
[0091]
中间体
‑
6(24.0g,0.12mol)、n,n
‑
二异丙基乙胺(15.0g,0.12mol)溶于1,2
‑
二氯乙烷(500ml)，降温至0℃，滴加三氯氧磷(90.0g,0.59mol)的1,2
‑
二氯乙烷(90ml)溶液，升温60℃反应4h，反应完毕，滴加水淬灭反应液，减压浓缩除去有机溶剂，加入二氯甲烷萃取，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸至干，粗品经乙醇重结晶，真空干燥，得到中间体
‑
7(26.0g)，收率92％，反应式同实施例1；
[0092]
h)制备中间体
‑
8：
[0093]
在2l反应瓶中，加入中间体
‑
7(26.0g,0.11mol)、硫磺(5.6g,0.17mol)、苄基三乙基氯化铵(1.8g,8mmol)和水(30ml)，搅拌，升温至85℃，滴加硫化钠水溶液(硫化钠12.0g(0.15mol)，水15ml)，滴加完毕，在75℃下搅拌1.5h，降温至60℃，静置分层，油层用甲苯萃取，精制、干燥得中间体
‑
8(23.5g)，hplc含量98.7％，收率93％，旋光值+113.0
°
，ee值98.7％，反应式同实施例1；
[0094]
i)制备成品即制备r
‑
硫辛酸：
[0095]
在2l反应瓶中，加入中间体
‑
8(23.0g,0.10mol)、氢氧化钠(8.0g,0.20mol)、甲醇(80ml)和水(60ml)，搅拌，升温至45℃反应2.5h，降温至室温，50℃减压旋蒸除去有机溶剂，冰浴冷却至10℃，滴加浓盐酸至ph＝1，抽滤，干燥，得r
‑
硫辛酸(19.2g)，hplc含量99.5％，收率95％，旋光值+112.2
°
，ee值98.9％，反应式同实施例1。
[0096]
实施例3：
[0097]
a)制备中间体
‑
1：
[0098]
在5l反应瓶中，加入无水四氢呋喃(100ml)，在氮气保护和常温搅拌下，加入无水氯化锂(37.0g,0.87mol)、锌粉(138.0g,2.11mol)，搅拌10min，加入1,2
‑
二溴乙烷(10ml)和无水四氢呋喃(100ml)的混合溶剂，加入三甲基氯硅烷(3.5g,32mmol)，升温至60℃搅拌30min，降温至常温，加入n
‑
(5
‑
溴戊基)酞亚胺(105.0g,0.35mol)，反应混合液升温至60℃反应1h，降至常温，抽滤除去不溶物，收集滤液，加入四(三苯基膦)钯(40.0g,35mmol)，常温搅拌30min，加入3
‑
{[2
‑
(三甲基硅烷基)乙氧基]甲氧基}丙酰氯(84.7g,0.35mol)的无水四氢呋喃溶液(100ml)，保温35℃反应2h，反应完毕，滴加入搅拌中的10％氯化铵水溶液，加入二氯甲烷萃取，分层，收集有机相，用食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸至干，粗品经层析柱纯化，得到中间体
‑
1(136.4g)，收率92％，反应式同实施例1；
[0099]
b)制备中间体
‑
2：
[0100]
中间体
‑
1(136.0g,0.32mol)与80％水合肼(26.0g,0.42mol)混合，加入水(150ml)，升温100℃反应1h，反应完毕，降至室温，滴加稀醋酸溶液酸化至ph＝6～7，降至10℃，过滤除去不溶物，收集滤液，加入氨水调ph＝10，加入二氯甲烷萃取，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸至干，得到中间体
‑
2(87.0g)，收率93％，反应式同实施例1；
[0101]
c)制备中间体
‑
3：
[0102]
中间体
‑
2(87.0g,0.30mol)与水(1200ml)、1,4
‑
二氧六环(1200ml)相混合，溶解均匀，加入氢氧化钠(12.0g,0.30mol)，加入氯羰基氢化[4,5
‑
双
‑
(二
‑
异丙基膦基)吖啶]钌(ii)(9.0g,15mmol)，敞开反应体系在大气中，升温120℃反应10h，反应完毕，减压浓缩除去有机溶剂，滴加稀盐酸酸化，加入二氯甲烷萃取，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸至干，得到中间体
‑
3(85.0g)，收率93％，反应式同实施例1；
[0103]
d)制备中间体
‑
4：
[0104]
在5l反应瓶中加入中间体
‑
3(85.0g,0.28mol)和乙醇(100ml)，搅拌溶解，加入浓硫酸(0.5ml)，加热回流5h，反应完全后，降至室温，滴加碳酸氢钠饱和溶液调至中性，减压旋蒸浓缩至干，加入二氯甲烷萃取，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸浓缩至干，得到中间体
‑
4(90.0g)，收率97％，反应式同实施例1；
[0105]
e)制备中间体
‑
5：
[0106]
将近平滑假丝酵母菌引入发酵培养基中，在50℃并且在180rpm的搅拌下进行扩增培养24h，近平滑假丝酵母菌与发酵培养基的体积比为1∶100，扩增培养结束后进行离心分离，得到静息细胞，在本步骤中，所述的近平滑假丝酵母菌(candida parapsilosis)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为cgmcc no.9630。本步骤中的所述发酵培养基由以下按重量称取的原料构成：葡萄糖(50.0g)、蛋白胨(20.0g)、磷酸二氢钾(10.0g)、磷酸氢二钾(6.0g)、氯化钠(2.0g)、
硫酸镁(2.0g)和水(1000g)，ph值为3。另外配制富集培养基，组成如下：(nh4)2so4(1.0g/l)，kh2po4(3.0g/l)，k2hpo4(6.0g/l)，mgso4(0.5g/l)，cacl2(0.05g/l)。
[0107]
本步骤所述的扩增培养分离的具体过程如下：
[0108]
在250ml锥形瓶内加入富集培养基(50ml)和中间体
‑
4(0.40g)作为碳源，加入土样后，于30℃，180rpm培养1～6天。之后将该培养液涂布于丰富培养基平板上，30℃培养1～3天，长出的单菌落进行平板划线分离纯化，将得到的单菌落接种到液体丰富培养基中，在30℃，180rpm培养2天后，离心分离得到静息细胞(68.0g)。
[0109]
在5l反应瓶中，加入1l磷酸钠缓冲溶液(0.1m，ph 6.0)、由上述得到的静息细胞(42.0g)、中间体
‑
4(90.0g,0.27mol)、葡萄糖脱氢酶液(5u)、葡萄糖(30.0g)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(0.33g)，在35℃下，通过ph仪自动滴加0.5m naoh溶液使反应体系的ph控制在7.0，反应12h，反应结束后过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋蒸至干得到中间体
‑
5(85.0g)，gc含量97.5％，收率94％，旋光值
‑
19.5
°
，ee值99.1％，反应式及手性气相色谱分析条件同实施例1；
[0110]
f)制备中间体
‑
6：
[0111]
在5l反应瓶中，加入中间体
‑
5(85.0g,0.25mol)和四氢呋喃(200ml)，搅拌溶解，加入四丁基氟化铵(296.5g,1.13mol)，升温50℃反应6h，反应完毕，降至室温，抽滤过硅藻土，收集滤液，减压浓缩除去有机溶剂，加入二氯甲烷萃取，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸至干，粗品经层析柱纯化，得到中间体
‑
6(48.0g)，收率93％，反应式同实施例1；
[0112]
g)制备中间体
‑
7：
[0113]
中间体
‑
6(48.0g,0.23mol)、2,6
‑
二甲基吡啶(37.0g,0.35mol)溶于氯仿(1000ml)，降温至10℃，滴加三氯化磷(190g,1.38mol)的氯仿(200ml)溶液，升温80℃反应2h，反应完毕，滴加水淬灭反应液，减压浓缩除去有机溶剂，加入二氯甲烷萃取，食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸至干，粗品经乙丙醇重结晶，真空干燥，得到中间体
‑
7(52.5g)，收率93％，反应式同实施例1；
[0114]
h)制备中间体
‑
8：
[0115]
在2l反应瓶中，加入中间体
‑
7(52.0g,0.22mol)、硫磺(10.0g,0.31mol)、四丁基硫酸氢铵(3.5g,10mmol)和水(30ml)，搅拌，升温至85℃，滴加硫化钠水溶液(硫化钠26.0g(0.33mol)，水17ml)，滴加完毕，在90℃下搅拌3h，降温至60℃，静置分层，油层用甲苯萃取，精制、干燥得中间体
‑
8(45.0g)，hplc含量98.9％，收率89％，旋光值+114.0
°
，ee值98.9％，反应式同实施例1；
[0116]
i)制备成品即制备r
‑
硫辛酸：
[0117]
在2l反应瓶中，加入中间体
‑
8(45.0g,0.19mol)、氢氧化钠(15.0g,0.38mol)、异丙醇(80ml)和水(50ml)，搅拌，升温至55℃反应1.5h，降温至室温，50℃减压旋蒸除去有机溶剂，冰浴冷却至10℃，滴加浓盐酸至ph＝1，抽滤，干燥，得r
‑
硫辛酸(38.0g)，hplc含量99.5％，收率96％，旋光值+112.0
°
，ee值98.9％，反应式同实施例1。