一种DNA反转系统及其应用以及一种目标DNA反转方法

一种dna反转系统及其应用以及一种目标dna反转方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体的说是涉及一种dna反转系统及其应用以及一种目标dna反转方法。


背景技术：

2.由位点特异性重组介导的dna重排在创建生物多样性中发挥重要作用。这样的天然系统包括：在发育中的淋巴细胞中，由rag重组酶介导的v(d)j重组，产生不同的抗原受体；在大肠杆菌15t
‑
中，由min转化酶介导的p15bmin系统，导致多种尾纤维基因的选择性表达。同时也开发了多种dna重排的人工系统，例如，在合成酵母基因组(sc2.0)中通过loxpsym介导进化的scramble系统可进行合成染色体重排和修饰；以及cre重组酶介导的多个loxp位点条形码系统(brainbow系统和polylox系统)，可随机产生染色体结构变异的多样性，并产生巨大的条形码库。
3.上述dna重排系统可以通过位点特异性重组介导删除，反转和其他结构变异而产生多样性。但是，dna重排系统中的删除可能会发挥负面作用。例如，由scramble介导的染色体大片段的删除通常会导致发生scramble的细胞具有高致死率。对于cre重组酶介导的条形码方法，cre本质上倾向于删除而不是反转，从而导致条形码多样性降低。位点特异性dna反转系统，只介导两个反向排列的位点之间发生反转反应，而在两个同向排列的位点之间几乎不发生删除反应。位点特异性dna反转系统可以有效解决由删除引起的不良影响。到目前为止，位点特异性dna反转系统仅在细菌和噬菌体中存在。因此，亟待在真核生物中开发一种类似的位点特异性dna反转系统。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种dna反转系统，其属于rci酶/sfxa101位点组合物，可应用在介导目标dna反转中，也可实现改变多个dna元件的顺序和方向，而保证长度不变，生成反转文库；
5.本发明的另外一个目的在于提供基于rci/sfxa101系统使目标dna高比率发生反转的方法以及提供生成dna反转文库的方法。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.一种dna反转系统，包含sfxa101位点序列，以及rci酶和/或其编码序列；所述sfxa101位点序列为其中一条链的序列如seq id no.1所示的双链核苷酸序列，所述rci酶序列为seq id no.2或seq id no.3所示的氨基酸序列，所述rci酶的编码序列为能够编码seq id no.2或seq id no.3所示氨基酸序列的核苷酸序列。
8.sfxa101位点的31bp序列由一个7bp的间隔序列，一个12bp的右臂序列，和一个12bp的左臂序列组成，seq id no.1所示的核苷酸序列为其其中一条链，相反方向的sfxa101位点序列的一条链序列如seq id no.5所示，两个方向不同的sfxa101位点序列参见附图1。同时，本发明对rci酶不断定向进化，在seq id no.2所示氨基酸序列的rci8酶作
用下，该系统所呈现的反转效率和删除效率的比值极高，而即便是在两个同向排列的sfxa101位点序列之间也几乎不发生删除反应，实现了在这个酶催化下反转比例显著高于删除比例的目的，在实际应用中如果只设置方向相反的sfxa101位点序列则可以只介导反转的发生。同时，在seq id no.3所示氨基酸序列的rci26酶催化下的反转效率和删除效率的比值也表现较高。
9.在本发明具体实施方式中，所述能够编码seq id no.2所示氨基酸序列的核苷酸序列如seq id no.4所示。
10.作为优选，所述sfxa101位点序列和rci酶的编码序列还可以以表达载体的形式存在，例如目标dna、sfxa101位点序列以及rci酶的编码序列插入到载体质粒上，然后转化到受体细胞(酵母细胞、hek
‑
293t细胞等真核细胞)。
11.为了验证本发明dna反转系统的效果，本发明借助筛选标签和荧光蛋白的指示作用，分别在质粒载体和染色体上验证真核细胞内的目标dna反转，结果显示，以质粒载体方式在酵母细胞中表达rci8酶/rci26酶，目标dna反转效率和删除效率的比值分别约为4320和1195，体现了良好的反转特异性，证明成功在酵母质粒上构建了位点特异性dna反转系统；
12.而直接在酵母染色体上的目标dna反转结果显示，在rci8酶催化下反转效率和删除效率的比值约为960，同样体现了良好的反转特异性，证明成功在酵母染色体上构建了位点特异性dna反转系统；
13.为了证明其他真核细胞同样可以使用所述反转系统，本发明在动物细胞hek
‑
293t中导入质粒载体，以荧光蛋白作为指示，结果显示，许多实验组的转染细胞变为绿色(表示发生反转)，而对照组中几乎没有观察到绿色细胞，证明细胞内发生了反转反应。通过流式细胞仪定量分析，结果显示约21.8％的293t细胞转为绿色，而约0.24％的细胞转为红色(表示发生删除)，并且通过pcr和sanger测序验证。这些结果表明，rci/sfxa101系统可以介导具有强烈方向性偏向的dna重组，导致哺乳动物细胞中反向sfxa101位点之间的反转占主导地位，成功在动物细胞中构建了位点特异性dna反转系统。
14.基于上述技术效果，本发明提出了所述dna反转系统在介导目标dna反转中的应用，以及在构建dna反转文库中的应用。
15.依据应用，本发明还提供了一种目标dna反转方法，包括：
16.步骤1、将方向相反的两个sfxa101位点序列分别插入到目标dna两端；
17.步骤2、向目标dna所在的受体细胞中转入能够表达rci酶的载体，表达的rci酶作用于两个方向相反的sfxa101位点之间的目标dna发生反转。
18.同时，本发明也提供了一种构建dna反转文库的方法，包括：
19.步骤1、多个需要反转的目标dna两端均插入方向相反的两个sfxa101位点序列；
20.步骤2、向目标dna所在的受体细胞中转入能够表达rci酶的载体，表达的rci8酶作用于两个方向相反的sfxa101位点之间的目标dna发生反转。
21.为了只介导dna反生反转而避免发生删除，相邻两个sfxa101位点序列的方向相反。
22.其中，上述两个方法中目标dna可以是在受体细胞的染色体上，也可以是通过插入载体形式导入到受体细胞中，采用后者的方式通常是对构建的多功能片段进行片段上目标
dna的反转。
23.由以上技术方案可知，本发明提供了一种基于rci酶/sfxa101位点的dna反转系统，在本发明提供的不断定向突变的rci酶作用下，介导两个反向排列的sfxa101位点之间的目标dna只发生反转反应，避免发生删除反应，即便是存在同向的sfxa101位点，这种删除反应的发生效率相对于反转反应的发生效率也是微乎其微的。本发明的dna反转系统以及反转方法可以实现位点之间dna片段的反转而几乎不删除，可以避免由删除造成的不良影响，并可以进一步生成反转文库，实现改变多个dna元件的顺序和方向，而保证长度不变。
附图说明
24.图1所示为方向相反的两个sfxa101位点序列示意图；
25.图2所示为质粒phpy004图谱示意图以及质粒上的验证单元；直角箭头表示启动子，三角表示sfxa101位点序列及其方向性，t型符号表示终止子，ura3δatg表示反向的敲除起始密码子atg的ura3标签序列，his3δatg表示敲除起始密码子atg的his3标签序列；
26.图3所示为质粒phpy004上验证单元发生反转和删除的示意图；
27.图4所示为利用rci8/sfxa101系统在酿酒酵母染色体上反转目标dna(即反向ura3)的示意图；直角箭头表示启动子，三角表示sfxa101位点序列及其方向性，t型符号表示终止子，clover表示绿色荧光蛋白编码序列，clover+表示细胞呈绿色发生反转；mirfp670表示红色荧光蛋白编码序列，mirfp670+表示细胞呈红色，发生删除；
28.图5所示为在hek
‑
293t细胞的pcep4质粒上利用荧光蛋白验证dna反转的示意图；
29.图6所示为质粒phpy007图谱示意图，属于表达rci8酶的表达载体；
30.图7所示为质粒phpy004导入酿酒酵母反转/删除后不同类型培养基上菌落数目的示意图；
31.图8所示为随机挑选的24个反转后的酿酒酵母菌株pcr结果图；
32.图9所示为酿酒酵母染色体上从phpy004克隆的验证单元反转/删除后不同类型培养基上菌落数目的示意图；
33.图10所示为随机挑选的12个反转后的酿酒酵母菌株pcr结果图；
34.图11所示为反转/删除后hek
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293t细胞颜色变化的显微图像；
35.图12所示为hek
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293t细胞颜色变化的流式细胞仪分析图；绿色(右下象限)表示发生反转；橙色(右上象限)表示，细胞发生翻转表达绿色荧光蛋白clover，后发生删除表达mirfp670，此时clover蛋白存在于细胞中，红色与绿色两者叠加为橙色，因是评估删除比例，只看单通道mirfp+，计算为发生删除；红色(左上象限)表示发生删除；灰色(左下象限)表示未发生反转和删除，由于rci酶表达时间问题，78％的细胞没有发生反转和删除。
具体实施方式
36.本发明实施例公开了一种dna反转系统及其应用以及一种目标dna反转方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述dna反转系统及其应用以及目标dna反转方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的dna反转系统及其应用以及目标dna
反转方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
37.在本发明中共提供了两种rci酶，即seq id no.2所示氨基酸序列的rci8酶和seq id no.3所示氨基酸序列的rci26酶；相比较rci26酶，rci8酶进行了定向突变优化，在其催化下目标dna反转效率和删除效率的比值有了极大的提升；本发明具体实施方式中基本采用最优的rci8酶进行相关验证。
38.在本发明具体实施方式中，本发明以ura3和his3筛选标签(敲除atg起始密码子)构建验证反转dna效果的质粒载体，导入到酵母细胞中验证，示意图见图2；在该质粒载体上，ura3反向插入且其两端插入了方向相反的sfxa101位点序列，启动子pcyc1和atg起始密码子设立在反向ura3标签上游的sfxa101位点序列前；只在his3筛选标签的上游设立一个sfxa101位点序列，其方向与反向ura3标签上游的sfxa101位点序列相同，并在该sfxa101位点序列和反向ura3标签下游的sfxa101位点序列之间设置终止子；
39.上述质粒载体的构建方式可以借助sc
‑
ura和sc
‑
his培养基来直观反映作为目标dna的ura3标签的反转效率以及删除效率，当两个反向sfxa101位点序列间发生dna反转时，ura3标签得以正常表达，而his3标签无法表达，可以在sc
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ura培养基上长出菌落；而当两个同向sfxa101位点序列间发生dna删除时，反向ura3标签删除，his3标签得以正常表达，可以在sc
‑
his培养基上长出菌落，示意图见图3。
40.按照同样的方式，将上述验证单元插入到酵母染色体上，也可以进行相同的反转效率验证，示意图见图4。
41.此外，本发明还通过荧光蛋白构建验证反转dna效果的质粒载体，导入到动物细胞hek
‑
293t中验证；与前述在酵母细胞中的验证单元类似，以反向绿色荧光蛋白序列替换反向ura3标签，以红色荧光蛋白序列替换his3标签，其他保持相同，同时为了简便性，rci8酶的表达系统也插入到该质粒载体上，而在之前的酵母细胞验证中则是单独转化一个表达rci8酶的载体质粒；当两个反向sfxa101位点序列间发生dna反转时，绿色荧光蛋白得以正常表达，而红色荧光蛋白无法表达，可以通过荧光显微镜对转染的细胞成像以及流式细胞仪检测；而当两个同向sfxa101位点序列间发生dna删除时，反向绿色荧光蛋白序列删除，红色荧光蛋白得以正常表达，可以通过荧光显微镜对转染的细胞成像以及流式细胞仪检测，示意图见图5。
42.本发明所涉及的质粒phpy004和phpy007均是在市售质粒prs416和prs415上改造获得；例如phpy004以敲掉ura3标签的prs416质粒为基础质粒引入图3中的验证单元，筛选标签可根据实际情形选择替换、增加或保留prs416质粒原有筛选标签，质粒图谱示意图见图2；phpy007以prs415质粒为基础质粒引入rci8酶的表达系统，使用gal诱导型启动子可以方便控制rci8酶的表达，筛选标签可根据实际情形选择替换、增加或保留prs415质粒原有筛选标签，质粒图谱示意图见图6。
43.以下就本发明所提供的一种dna反转系统的应用以及一种目标dna反转方法做进一步说明。
44.实施例1：利用rci8/sfxa101系统在酿酒酵母质粒上构建一种真核位点特异性dna反转系统
45.1、通过酵母转化将phpy004质粒和phpy007质粒导入by4741出发菌株中。其步骤如下：
46.a)挑取by4741酿酒酵母单菌落于5mlypd液体培养基中，30℃过夜培养；
47.b)测量过夜培养的酿酒酵母培养液od600，接种过夜培养液到5mlypd中(0.125od
600
/ml)，30℃、220rpm条件下培养至od600达到0.5(约需要3.5
–
4.5hrs)；
48.c)吸取1ml酿酒酵母培养液至1.5ml ep管内，4000rpm离心2min，收集细胞；用1ml无菌水重悬细胞，同上离心，收集细胞；用1ml 0.1m lioac重悬细胞，同上离心，收集细胞；用移液器吸除900μl上清，剩余的100μl lioac重悬细胞，置于冰上，得到感受态细胞。
49.d)准备转化体系：
[0050][0051]
将该体系充分混合均匀，待用。
[0052]
e)向100μl 酵母感受态细胞中加入phpy004质粒和phpy007质粒各2μl吹吸均匀后加入转化体系中，上下翻转混合均匀；30℃培养箱中孵育30min；加入90μldmso，上下翻转混合均匀；42℃热激15min；3600rpm离心30s，收集细胞；吸出上请，加入400μl5mmcacl2，重悬细胞，静置5min；3600rpm离心30s，吸出上请，在无菌水中重悬后涂sc+hyg(潮霉素)筛选培养基筛选。
[0053]
待酵母在筛选培养基上生长2天，将单菌落接于sc
‑
leu+hyg液体培养基中，于30℃，220rpm培养至饱和。
[0054]
2、取1ml酵母菌，菌体用ddh2o洗两次以洗去葡萄糖，然后转接到半乳糖培养基中诱导培养12小时。将诱导的酵母细胞以合适的稀释倍数涂布到sc
‑
ura和sc
‑
his培养基上，在30℃培养箱中，培养3天；结果见图7，图7结果显示在sc
‑
ura培养基上有大量菌落长出，而在sc
‑
his培养基上基本没有菌落长出，说明本发明的反转系统实现位点之间dna片段的反转而几乎不删除。
[0055]
3、rci8/sfxa101系统表达，随机选择sc
‑
ura培养基上的24个菌落，通过pcr来测试新连接的产生，通过sanger测序分析反转后生成的新连接，结果见图8；反转区域sanger测序结果如下：
[0056]
cattaggacctttgcagcataaattactatacttctatagacacacaaacacaaatacacacactaaattaataatgaaggcaatactttcgtgccaatccggtacgtggtcgaaagctacatataaggaacgtgctgctactcatcctagtcctgttgctgccaagctatttaatatcatgcacgaaaagcaaacaaacttgtgtgc
[0057]
结果显示反转效率和删除效率的比值约为4320，体现了良好的反转特异性，证明成功在酿酒酵母质粒上构建了位点特异性dna反转系统。
[0058]
此外，本实施例选择rci26酶(定向优化前)替换rci8酶进行同样的实验，结果显示反转效率和删除效率的比值约为1195。
[0059]
实施例2：利用rci8/sfxa101系统在酿酒酵母染色体上构建一种真核位点特异性dna反转系统。
[0060]
1、通过酵母同源重组将从phpy004克隆的系统的片段(即图3所示的验证单元，长度为4202bp)插入到酿酒酵母中的x染色体上(639678bp的位置)，同时导入phpy007质粒。
[0061]
2、取1ml酵母菌，菌体用ddh2o洗两次以洗去葡萄糖，然后转接到半乳糖培养基中诱导培养12小时。将诱导的酵母细胞以合适的稀释倍数涂布到sc
‑
ura和sc
‑
his培养基上，在30℃培养箱中，培养3天；结果见图9，图9结果显示在sc
‑
ura培养基上有大量菌落长出，而在sc
‑
his培养基上基本没有菌落长出，说明本发明的反转系统实现位点之间dna片段的反转而几乎不删除。
[0062]
3、rci8/sfxa101系统表达，随机选择sc
‑
ura培养基上的12个菌落，通过pcr来测试新连接的产生，通过sanger测序分析反转后生成的新连接。结果见图10；反转区域sanger测序结果如下：
[0063]
ttgcagcataaattactatacttctatagacacacaaacacaaatacacacactaaattaataatgaaggcaatactttcgtgccaatccggtacgtggtcgaaagctacatataaggaacgtgctgctactcatcctagtcctgttgctgccaagctatttaatatcatgcacgaaaagcaaacaaacttgtgtgcttcattggatgttcgtaccaccaaggaattactggagttagttgaag(注：与实施例1中测序结果部分不同是由于所用引物不同，中间序列是相同的)
[0064]
结果显示反转效率和删除效率的比值约为960，体现了良好的反转特异性，证明成功在酿酒酵母染色体上构建了位点特异性dna反转系统。
[0065]
实施例3：利用rci8/sfxa101系统在动物细胞hek
‑
293t中构建一种真核位点特异性dna反转系统
[0066]
1、在hek
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293t细胞的pcep4质粒上设计构建表征系统，两个反向排列的sfxa101位点之间dna片段的反转，使得表达绿色荧光蛋白，细胞变为绿色；两个同向排列的sfxa101位点之间dna片段的删除，使得表达红色荧光蛋白，细胞变为红色。
[0067]
2、将表征系统质粒和rci8质粒(phpy007)转染到hek
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293t细胞中，只含表征系统质粒的细胞作为对照。培养72小时后，通过荧光显微镜对转染的细胞成像，图11结果显示许多实验组的转染细胞变为绿色，而对照组中几乎没有观察到绿色细胞，证明细胞内发生了反转反应。
[0068]
通过流式细胞仪定量分析，图12结果显示约21.8％的293t细胞转为绿色，而约0.24％的细胞转为红色，并且通过pcr和sanger测序验证。这些结果表明，rci8/sfxa101可以介导具有强烈方向性偏向的dna重组，导致哺乳动物细胞中反向sfxa101位点之间的反转占主导地位，成功在动物细胞中构建了位点特异性dna反转系统。
[0069]
反转区域sanger测序结果如下：
[0070]
ggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggcaatactttcgtgccaatccggtacgtggaccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtccgcggcgag
[0071]
以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。