一种黄芩黄酮甲氧基转移酶基因及其重组载体和应用的制作方法

1.本发明涉及植物分子生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种黄芩黄酮甲氧基转移酶基因及其重组载体和应用。


背景技术：

2.黄芩，为唇形科黄芩属多年生草本植物，两千年来一直被作为传统的药用植物；主要用其治疗上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痢疾等症。现代医学研究表明，黄芩中主要的活性成分，为根中大量存在的甲基化黄酮类物质：汉黄芩素、黄芩黄酮i和韧黄芩素i。根据动物细胞实验发现，上述物质具有一定的抗癌活性。
3.随着黄芩的药理活性研究的广泛和深入，针对汉黄芩素、黄芩黄酮i和韧黄芩素i的合成途径，特别是在分子生物学水平及生化水平上的合成途径的研究逐渐成为研究的热点。黄芩根特异黄酮具有重要的药用价值，也是一类结构特殊的黄酮。它们缺少经典黄酮b环上的4'位羟基；而在a环上带有大多数黄酮没有的6或8位的羟基或甲氧基，且这类黄酮的药物学活性与它们这种特殊结构相关。黄芩从苯丙氨酸到黄芩素及去甲汉黄芩素的合成途径已经阐明。然而还有大量以黄芩黄酮i和韧黄芩素i为代表的甲氧基黄酮的合成途径还没完全阐明，负责这些反应的氧位甲基转移酶还没有发现。
4.黄酮的氧位甲基化是类黄酮基本结构形成后最主要的修饰反应之一，与酰基化、糖基化等修饰作用一起带来类黄酮结构及功能的多样性。类黄酮氧位甲基化可降低一些基团的化学活性；增加类黄酮的亲脂性，扩大了其在细胞内的分布范围，有利于其更好地和胞内膜结构结合从而发挥生物学活性。但目前鲜有报道关于从植物黄芩中克隆到编码参与黄芩黄酮i和韧黄芩素i及具有相似结构的黄酮甲基化合成途径的相关基因。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种黄芩黄酮甲氧基转移酶基因及其重组载体和应用。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的第一方面是提供一种黄芩黄酮甲氧基转移酶基因，包括sbfomt3、sbfomt5和sbfomt6基因中的至少一种；该黄芩黄酮甲氧基转移酶基因的序列选自：
8.1)如seq id no.1所示的dna序列；
9.2)由如seq id no.1所示的dna序列通过一个或几个核苷酸的添加、删除、取代而得到的序列，其编码与如氨基酸序列为seq id no.2的蛋白质功能相同的蛋白质；
10.3)如seq id no.3所示的dna序列；
11.4)由如seq id no.3所示的dna序列通过一个或几个核苷酸的添加、删除、取代而得到的序列，其编码与如氨基酸序列为seq id no.4的蛋白质功能相同的蛋白质；
12.5)如seq id no.5所示的dna序列；
13.6)由如seq id no.5所示的dna序列通过一个或几个核苷酸的添加、删除、取代而
得到的序列，其编码与如氨基酸序列为seq id no.6的蛋白质功能相同的蛋白质。
14.进一步地，上述sbfomt3基因的序列seq id no.1所示，上述sbfomt5基因的序列如seq id no.3所示，上述sbfomt6基因的序列如seq id no.5所示。
15.进一步地，上述sbfomt3基因的读码框位于1
‑
1095，上述sbfomt5基因的读码框位于1
‑
1113，上述sbfomt6基因的读码框位于1
‑
1077。
16.本发明的第二方面是提供一种扩增上述黄芩黄酮甲氧基转移酶基因的引物组合物。
17.进一步地，用于扩增sbfomt3基因的引物包括如seq id no.7～seq id no.8所示的序列，用于扩增sbfomt5基因的引物包括如seq id no.9～seq id no.10所示的序列，用于扩增sbfomt6基因的引物包括如seq id no.11～seq id no.12的所示序列。
18.进一步地，上述引物具有gateway重组位点。
19.本发明的第三方面是提供一种由上述黄芩黄酮甲氧基转移酶基因编码的蛋白。
20.进一步地，由sbfomt3基因编码的蛋白序列如seq id no.2所示，由sbfomt5基因编码的蛋白序列如seq id no.4所示，由sbfomt6基因编码的蛋白序列如seq id no.6所示。
21.本发明的第三方面是提供由上述黄芩黄酮甲氧基转移酶基因构建的重组载体、重组微生物、宿主细胞、转基因细胞系、转基因植物组织或转基因植物。
22.本发明的第四方面是提供上述黄芩黄酮甲氧基转移酶基因、重组载体、重组微生物、宿主细胞、转基因细胞系、转基因植物组织或转基因植物在合成甲氧基黄酮类化合物中的应用。
23.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
24.本发明首次从唇形科黄芩属药用植物黄芩中克隆到编码参千层纸素、7
‑
甲氧基黄芩素及具有相似结构的黄酮甲基化合成途径的sbfomt3、sbfomt5和sbfomt6的三条基因，其为来源于黄芩的黄酮7位，6位氧甲基转移酶的基因序列，其所编码的酶能够参与千层纸素、7
‑
甲氧基黄芩素的生物合成并催化具有相似结构黄酮类物质的氧位甲基化反应，在pfomt的协同作用下能够合成黄芩黄酮i和韧黄芩素i，为大规模生产黄芩黄酮i和韧黄芩素i及相似黄酮类甲基化提供理论基础，也为工业生产其他相关的甲基化黄酮类化合物奠定了坚实的基础。
附图说明
25.图1是本发明一实施例中酵母体系中sbfomt3、sbfomt5和sbfomt6基因能够催化黄芩素为7
‑
甲氧基黄芩素、千层纸素、5
‑
羟基
‑
6,7二甲氧基黄酮和6
‑
羟基
‑
5,7二甲氧基黄酮的结果验证示意图；其中，图a显示了sbfomt3和sbfomt6基因能够催化黄芩素为7
‑
甲氧基黄芩素；图b显示了sbfomt5能够催化黄芩素生成7
‑
甲氧基黄芩素、千层纸素、5
‑
羟基
‑
6,7二甲氧基黄酮和6
‑
羟基
‑
5,7二甲氧基黄酮；
26.图2是本发明一实施例中酵母体系中sbfomt5和sbfomt6基因能够催化去甲汉黄芩素生成异汉黄芩素的结果验证示意图；
27.图3是本发明一实施例中酵母体系中组合1、组合2和组合3能够催化黄芩素生成千层纸素、5
‑
羟基
‑
6,7二甲氧基黄酮和7
‑
甲氧基黄芩素的结果验证示意图；其中，图a显示了组合1和组合3能够催化黄芩素为千层纸素和7
‑
甲氧基黄芩素；图b显示了组合2能够催化黄
id no.9)；
42.sbfomt5
‑
r：ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttcatggaaaaacctcaataacag(seq id no.10)；
43.sbfomt6
‑
f：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatggcattgcctaaagcacttg(seq id no.11)；
44.sbpfomt5
‑
r：ggggaccactttgtacaagaaagctgggtttcatggaaaaacctcaatcac(seq id no.12)；
45.上述引物由上海生工合成。
46.(2)sbfomt3、sbfomt5和sbfomt6基因的克隆
47.以黄芩根为材料，按照rna提取试剂盒的说明书提取黄芩根部的总rna，使用反转录试剂盒进行反转录得到黄芩根部的cdna。
48.以cdna为模板，分别以sbfomt3
‑
f和sbfomt3
‑
r，sbfomt5
‑
f和sbfomt5
‑
r，sbfomt6
‑
f和sbfomt6
‑
r为引物进行扩增反应，获得sbfomt3、sbfomt5和sbfomt6基因；其中：
49.pcr反应体系：cdna 1μl，上游引物2.5μl，下游引物2.5μl，phusion hf buffer 10μl，dntp混合物1μl，phusion enzyme 0.5μl，ddh2o 32.5μl；
50.pcr的设定程序是：1)98℃，3min；2)98℃，10s；3)55℃，20s；4)72℃，1min；5)72℃，5min；循环从2)到4)，循环数40个。
51.pcr扩增结束后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得了1095bp的sbfomt3基因，1113bp的sbfomt5基因，1075bp的sbfomt6基因。
52.(3)构建pdonar207
‑
sbfomt3，pdonar207
‑
sbfomt3，pdonar207
‑
sbfomt6载体
53.将步骤(2)中的pcr产物使用天根切胶回收试剂盒回收特异性条带，测定回收产物的浓度，之后进行bp反应。
54.bp反应：pcr产物100
‑
200ng(3μl)，pdonar207 100ng(1μl)，1
×
te缓冲液0.5μl，bp clonase酶0.5μl；25℃温育5h，加入0.5μl蛋白酶k，37℃温育10min，终止bp反应。
55.将上述反应产物转化大肠杆菌dh5α，将菌液涂布在含有20mg/l的庆大霉素的lb固体培养基上，37℃培养箱中过夜培养。次日挑取单克隆进行菌落pcr验证，将阳性克隆送到生工公司测序。根据测序结果提取质粒，得到质粒pdonar207
‑
sbfomt3，pdonar207
‑
sbfomt3，pdonar207
‑
sbfomt6。
56.(4)构建sbfomt3、sbfomt5和sbfomt6基因的酵母表达载体。
57.针对sbfomt3、sbfomt5和sbfomt6基因酵母表达载体则均使用的是载体pagl423。将步骤(3)中的经bp反应得到的质粒测定浓度后，进行lr反应。
58.lr反应:bp反应质粒100
‑
200ng(3μl)，pagl423 100ng(1μl)，1
×
te缓冲液0.5μl，lr clonase酶0.5μl；25℃温育5h，加入0.5μl蛋白酶k，37℃温育10min，终止lr反应。将上述反应产物转化大肠杆菌dh5α，将菌液涂布在含有50mg/l的氨苄霉素(amp)的lb固体培养基上，37℃培养箱中过夜培养。次日挑取单克隆进行菌落pcr验证。得到的阳性克隆提取质粒即得到含有目的基因的酵母表达载体pagl423
‑
sbfomt3、pagl423
‑
sbfomt5和pagl423
‑
sbfomt6。
59.实施例2
60.本实施例在酵母体系中验证黄芩sbfomt3、sbfomt5和sbfomt6基因的蛋白功能，具
体的验证过程和结果如下：
61.在酵母中表达黄芩sbfomt3、sbfomt5和sbfomt6基因的蛋白：将酵母表达载体pagl423
‑
sbfomt3、pagl423
‑
sbfomt5和pagl423
‑
sbfomt6用化学转化的方法转入酿酒酵母by4742菌株中，得到含有目的基因的酵母菌株，同时转化含有pagl423空质粒作为阴性对照，在含有葡萄糖且缺失组氨酸(his)的sd固体培养基中28℃生长24
‑
48h。
62.然后挑取单克隆在10ml含有葡萄糖且缺失his的sd液体培养基中28℃，200rpm下生长24h至od
600
达到2
‑
3。收集菌体，用无菌水洗掉菌体中的葡萄糖。用20ml含有半乳糖且缺失his的sd液体培养基将菌体重悬，28℃、200rpm培养2h诱导目的蛋白表达。然后向培养基中添加100μm相应蛋白的反应底物。培养24h小时后收集菌体。
63.收集菌体后，用1ml的70％甲醇溶解菌体，超声破碎2h提取代谢产物。12000rpm离心5min取上清，用0.22μm的有机滤膜过滤，即得样品，用于hplc检测。
64.hplc检测条件：waters 2659高效液相色谱仪，rp
‑
waters c18(100
×
2mm，3μm)柱，检测波长280nm。流动相条件：流速0.26ml/min，流动相为0.1％甲酸水(a)和乙腈/甲醇(1:1)+0.1％甲酸(b)，柱温35℃，梯度洗脱：0
‑
3min，20％b；20min，50％b；20
‑
30min，50％b；36min，30％b；37min，20％b；37
‑
43min，20％b。
65.结果如图1和图2所示，该结果表明：在酵母体系中，黄芩甲氧基转移酶
‑
3(sbfomt3)和甲氧基转移酶
‑
6(sbfomt6)能将黄芩素催化为7
‑
甲氧基黄芩素，甲氧基转移酶
‑
5(sbfomt5)能催化黄芩素为7
‑
甲氧基黄芩素，同时还能生成千层纸素、5
‑
羟基
‑
6,7二甲氧基黄酮和6
‑
羟基
‑
5,7二甲氧基黄酮。在以去甲汉黄芩素为底物时，甲氧基转移酶
‑
5(sbfomt5)和甲氧基转移酶
‑
6(sbfomt6)能够催化产生异汉黄芩素即7
‑
甲氧基去甲汉黄芩素。根据上述结果可以判断，上述三个酶均具有7位甲氧基转移酶的活性，但是甲氧基转移酶
‑
5(sbfomt5)不仅具有6位和7位活性，在6位和7位甲基化的前提下还可以分别作用7位和5位。
66.实施例3
67.本实施例为在酵母体系中验证黄芩sbfomt3、sbfomt5和sbfomt6基因和sbpfomt5基因的协同作用，具体的验证过程和结果如下：
68.在酵母中表达分别组合表达sbfomt3+sbpfomt5、sbfomt5+sbpfomt5和sbfomt6+sbpfomt5蛋白：
69.将酵母表达载体pagl423
‑
sbfomt3+pyes
‑
dest52
‑
sbpfomt5，pagl423
‑
sbfomt5+pyes
‑
dest52
‑
sbpfomt5，pagl423
‑
sbfomt6+pyes
‑
dest52
‑
sbpfomt5用化学转化的方法转入酿酒酵母wat11菌株中，得到含有目的基因的酵母菌株，同时转化含有pagl423+pyes
‑
dest52空质粒作为阴性对照，在含有葡萄糖且缺失his和ura的sd固体培养基中28℃生长24
‑
48h。
70.然后挑取单克隆在10ml含有葡萄糖且缺失his+ura的sd液体培养基中28℃，200rpm下生长24h至od
600
达到2
‑
3。收集菌体，用无菌水洗掉菌体中的葡萄糖。用20ml含有半乳糖且缺失his+ura的sd液体培养基将菌体重悬，28℃、200rpm培养2h诱导目的蛋白表达。然后向培养基中添加100μm相应蛋白的反应底物。培养24h小时后收集菌体。
71.收集菌体后，用1ml的70％甲醇溶解菌体，超声破碎2h提取代谢产物。12000rpm离心5min取上清，用0.22μm的有机滤膜过滤，即得样品，用于hplc检测。
72.hplc检测条件：waters 2659高效液相色谱仪，rp
‑
waters c18(100
×
2mm，3μm)柱，检测波长280nm。流动相条件：流速0.26ml/min，流动相为0.1％甲酸水(a)和乙腈/甲醇(1:1)+0.1％甲酸(b)，柱温35℃，梯度洗脱：0
‑
3min，20％b；20min，50％b；20
‑
30min，50％b；36min，30％b；37min，20％b；37
‑
43min，20％b。
73.结果如图3和图4所示，该结果表明：酵母体系中以黄芩素为底物时，在黄芩甲氧基转移酶和苯丙素和类黄酮o
‑
甲基转移酶的协同作用下，组合1(c1)(sbfomt3+sbpfomt5)和组合3(c3)(sbfomt6+sbpfomt5)催化产生千层纸素和7
‑
甲氧基黄芩素；组合2(c2)(sbfomt5+sbpfomt5)生成千层纸素和5
‑
羟基
‑
6,7二甲氧基黄酮。当以去甲汉黄芩素为底物时，组合1(sbfomt3+sbpfomt5)仅生成汉黄芩素，组合2(sbfomt5+sbpfomt5)生成汉黄芩素和5,7,8三甲氧基黄酮，组合3(sbfomt6+sbpfomt5)生成5
‑
羟基
‑
7,8
‑
二甲氧基黄酮。
74.结果如图5和图6所示，该结果表明：在酵母体系中，添加底物2’,5,7,8
‑
四羟基黄酮时，组合3(sbfomt6+sbpfomt5)催化产生黄芩黄酮i；添加2’,5,6,7,8
‑
五羟基黄酮为底物时，在组合2(sbfomt5+sbpfomt5)的协同作用下生成韧黄芩素i。
75.以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。