一株氟喹诺酮类抗生素降解菌及其在堆肥中的应用

本发明涉及微生物
技术领域：
，特别是涉及一株氟喹诺酮类抗生素降解菌及其在堆肥中的应用。
背景技术：
：近年来，抗生素及抗性基因污染风险越来越受到关注。到2030年，全球畜禽养殖业中抗生素的消耗将达到100万吨。然而大部分抗生素很难被动物肠道吸收，约30％～90％的抗生素会随着动物粪便和尿液排出体外。调查发现抗生素在动物粪便、废水、粪肥和土壤中均有检出，且浓度可达mg/kg级水平。抗生素的残留也会导致环境中抗性细菌和抗性基因的富集及传播，加剧生态环境压力和人体健康的风险。堆肥是实现畜禽粪便无害化和资源化处理的主要手段，可有效去除部分抗生素。研究表明，堆肥可基本去除四环素类抗生素、磺胺类抗生素和大环内酯类抗生素，然而却较难去除环丙沙星和氧氟沙星等氟喹诺酮类抗生素。微生物降解是抗生素去除的一种有效方式，例如中国专利cn106929442a公开了一株苍白杆菌(ochrobacteriumsp.)job，最高可去除液体中30％的环丙沙星，菌株制成包埋剂可用于水体和土壤中氟喹诺酮类抗生素的去除。但是有关微生物菌剂在堆肥降解抗生素的报道较少，主要由于堆肥产生的高温会抑制抗生素降解菌的活性，导致其在实际应用中效果不佳。另外，抗生素的持续存在也会造成抗性基因的污染，同时抗生素降解菌株本身携带抗性基因，菌株在应用中也可能存在抗性基因污染的风险。因此，急需筛选一株高效降解氟喹诺酮类抗生素的菌株，同时提供其在堆肥中高效且安全利用的方法。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了一株氟喹诺酮类抗生素降解菌及其在堆肥中的应用。本发明提供的wxx-3菌株能够高效降解氟喹诺酮类抗生素，利用该菌株制备的堆肥安全性更高。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明提供了一株布鲁氏菌(brucellasp.)wxx-3菌株，所述菌株的保藏编号为cgmccno.22259。优选的，所述菌株的16srdna的核苷酸序列如seqidno：1所示。本发明还提供了一种发酵菌剂，所述发酵菌剂包括上述的菌株。优选的，每g或每ml发酵菌剂中菌株的活菌数为(1.5～2.6)×1010cfu。本发明还提供了上述发酵菌剂的制备方法，包括以下步骤：将上述的菌株接种于lb培养基中，培养24～40h，得到所述的发酵菌剂。优选的，所述培养的温度为20～40℃。本发明提供了上述的菌株或上述的发酵菌剂或利用上述制备方法制备得到的发酵菌剂在降解抗生素和/或降解抗生素抗性基因中的应用。优选的，所述抗生素包括氟喹诺酮类抗生素；所述氟喹诺酮类抗生素包括：氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星中的一种或多种。本发明还提供了一种降解氟喹诺酮类抗生素和/或降解氟喹诺酮类抗生素抗性基因的堆肥方法，包括以下步骤：将上述的发酵菌剂与粪便原料混合，在20～40℃下扩繁8～10天后，调节碳氮比，发酵30天，得到所述堆肥。优选的，发酵菌剂与粪便原料混合后的物料中权利要求1所述菌株的有效活菌数为(1.5～26)×109cfu/kg。有益效果：本发明提供了一株布鲁氏菌(brucellasp.)wxx-3菌株，所述菌株的保藏编号为cgmccno.22259。本发明提供的wxx-3菌株能够高效降解氟喹诺酮类抗生素，由实施例可知，将该菌株加入含有20mg/l环丙沙星的lb液体培养基中，避光培养后环丙沙星的最高降解率达44.7％；另外，将该菌株接种于畜禽粪便中扩繁8～10天，之后加入木屑、秸秆等调理剂进行常规堆肥30天，环丙沙星的降解率可达85.7％；同时利用该菌株制备的堆肥可以降解抗生素抗性基因，从而提高了堆肥产品的安全性，适于大范围推广应用。生物保藏说明布鲁氏菌(brucellasp.)wxx-3菌株，于2021年04月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.22259。附图说明图1为实施例1中wxx-3菌株的特征和溶血检验结果，其中a为菌株的宏观形态；b为菌株的微观形态；c为溶血反应结果，其中1为阴性对照菌：英诺克李斯特氏菌(listeriainnocua)；2为阳性对照菌：金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)；3为样品：wxx-3菌株；d为温度对菌株生长的影响柱状图；图2为实施例1中wxx-3菌株的系统发育树；图3为实施例2中液体环境下wxx-3菌株对环丙沙星的降解；图4为实施例3中wxx-3菌株在猪粪堆肥中对环丙沙星的降解图；图5为堆肥中氟喹诺酮类抗生素抗性基因丰度图。具体实施方式本发明提供了一株布鲁氏菌(brucellasp.)wxx-3菌株，所述菌株的保藏编号为cgmccno.22259。本发明所述的wxx-3菌株优选具有以下性质：(1)菌株的16srdna的核苷酸序列如seqidno：1所示：gagcgcgtagcaatacgagcggcagacgggtgagtaacgcgtgggaatctacccatcactagggaataactcagggaaacttgtgctaataccctatacgaccgagaggtgaaagatttatcggtgatggatgagcccgcgttggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatccatagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtgagtgatgaaggccctagggttgtaaagctctttcaccggtgaagataatgacggtaaccggagaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggggctagcgttgttcggatttactgggcgtaaagcgcacgtaggcgggctaataagtcaggggtgaaatcccggggctcaaccccggaactgcctttgatactgttagtcttgagtatggaagaggtgagtggaattccgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcggaggaacaccagtggcgaaggcggctcactggtccattactgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgttagccgttggggagtttactcttcggtggcgcagctaacgcattaaacattccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccagcccttgacatcccgatcgcggttagtggagacactttccttcagttcggctggatcggagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgcccttagttgccagcattcagttgggcactctaaggggactgccggtgataagccgagaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttacgggctgggctacacacgtgctacaatggtggtgacagtgggcagcgagcacgcgagtgtgagctaatctccaaaagccatctcagttcggattgcactctgcaactcgagtgcatgaagttggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggttttacccgaaggcgctgtgctaaccgcaa；(2)菌株在lb固体培养基上培养24h后，菌落呈浅黄色，表面湿润，不透明，边缘整齐；(3)光学显微镜下菌体呈杆状，大小为0.4～0.6μm×0.8～2.4μm，单个或成对排列，革兰氏染色阴性；(4)菌株的溶血反应阴性；(5)菌株适宜生长温度为20～40℃，温度超过50℃可使菌株灭活。本发明提供的wxx-3菌株能够高效降解氟喹诺酮类抗生素，同时利用该菌株制备的堆肥可以降解抗生素抗性基因，从而提高了堆肥产品的安全性，适于大范围推广应用。本发明还提供了一种发酵菌剂，所述发酵菌剂包括上述的菌株。在本发明中，每g或每ml发酵菌剂中上述菌株的活菌数优选为(1.5～2.6)×1010cfu，更优选为2×1010cfu。本发明还提供了上述发酵菌剂的制备方法，包括以下步骤：将上述菌株接种于lb培养基中，培养24～40h，得到所述的发酵菌剂。在本发明中，所述培养的温度优选为20～40℃，更优选为20～25℃；所述培养的方式优选还包括：在lb液体培养基中活化12h，然后将活化到对数期的菌液按照1％(v/v)接种量再次转接到新鲜lb液体培养基中，扩大培养24h。本发明对所述lb培养基的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品或采用本领技术人员所熟知的制备方法制备得到。本发明还提供了上述的菌株或上述的发酵菌剂或利用上述制备方法制备得到的发酵菌剂在降解抗生素和/或降解抗生素抗性基因中的应用。在本发明中，所述抗生素优选包括氟喹诺酮类抗生素；所述氟喹诺酮类抗生素优选包括：氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星中的一种或多种，更优选为环丙沙星。本发明所述的菌株及含有该菌株的发酵菌剂能够高效降解氟喹诺酮类抗生素，由实施例可知，将该菌株加入含有20mg/l环丙沙星的lb液体培养基中，避光培养后环丙沙星的最高降解率达44.7％；另外，将该菌株接种于畜禽粪便中扩繁8～10天，之后加入木屑、秸秆等调理剂进行常规堆肥30天，环丙沙星的降解率可达85.7％；另外利用该菌株制备的堆肥可以降解抗生素抗性基因，从而提高了堆肥产品的安全性，适于大范围推广应用。本发明还提供了一种降解氟喹诺酮类抗生素和/或降解氟喹诺酮类抗生素抗性基因的堆肥方法，包括以下步骤：将上述的发酵菌剂与粪便原料混合，在20～40℃下扩繁8～10天后，调节碳氮比，发酵30天，得到所述堆肥。在本发明中，发酵菌剂与粪便原料混合后的物料中上述菌株的有效活菌数优选为(1.5～26)×109cfu/kg，进一步优选为(7.5～13)×109cfu/kg，更优选为1×1010cfu/kg。在本发明中，所述碳氮比优选为(23～27):1，更优选为25:1；所述调解碳氮比的物质优选包括：木屑和/或秸秆。在本发明中，调节碳氮比的同时优选还包括：调节堆肥混合料的含水量为55％。本发明对所述发酵的方式没有特殊要求，优选采用条垛式堆肥发酵的方式进行发酵。本发明提供的堆肥制备方法操作简单，便于控制，在堆肥发酵的前期将发酵菌剂与粪便混合，扩繁培养8～10天，能够高效发挥该菌株降解氟喹诺酮类抗生素的潜力；扩繁培养后进行常规堆肥发酵(发酵温度为60～70℃)，通过高温杀灭发酵菌剂中的菌株，从而避免该菌株自身携带的抗生素抗性基因的污染，生产工艺不会造成二次污染，适合大范围推广应用。为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一株氟喹诺酮类抗生素降解菌及其在堆肥中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1菌株的分离、纯化和鉴定本发明使用培养基的配制如下：无机盐培养基：k2hpo45.8g，kh2po44.5g，(nh4)2so42.0g，mgcl20.16g，cacl20.02g，na2moo4·2h2o0.0024g，kno30.0012g，fecl30.0018g，mncl2·2h2o0.0015g，加超纯水至1000ml，调ph至7.0～7.5。分离培养基：每升无机盐培养基添加20g琼脂粉。lb液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，加超纯水至1000ml，调ph至7.0～7.5。lb固体培养基：每升lb液体培养基添加20g琼脂粉。菌株的驯化、分离和纯化：首先，取5g左右堆肥样品(江西正合生态农业有限公司的有机肥条跺)加入含有5mg/l环丙沙星的无机盐培养基中，放入恒温摇床中(30℃，180rpm)避光培养7天。培养物静置后，将上清液转接至含有10mg/l环丙沙星的无机盐培养基中，避光培养7天后将上清液再次转接至含有20mg/l环丙沙星的无机盐培养基中培养7天。取0.2ml培养物涂布于含有20mg/l环丙沙星分离培养基上，恒温培养48h。挑取单个菌落接种于无机盐培养基试管(含环丙沙星，20mg/l)中，恒温培养7天后，高效液相色谱法测抗生素浓度，从中挑选出抗生素降解能力高的纯菌株布鲁氏菌wxx-3。筛选菌株形态学和生理生化反应特征菌株wxx-3在lb固体培养基上培养24h后，菌落呈浅黄色，表面湿润，不透明，边缘整齐(见图1中的a)；光学显微镜下菌体呈杆状，大小为0.4～0.6μm×0.8～2.4μm，单个或成对排列，革兰氏染色阴性(见图1中的b)；菌株的溶血反应阴性(见图1中的c)；菌株适宜生长温度为20～40℃，温度超过50℃可使菌株灭活(见图1中的d)。利用vitek2gn革兰氏阴性细菌鉴定卡自动鉴定菌株生理生化特征，具体的鉴定结果见表1。表1菌株wxx-3生理生化特征注：“+”，阳性；“-”，阴性。筛选菌株的分子生物学鉴定：采用动物基因组dna提取试剂盒(北京擎科生物科技有限公司,tsp201-200)提取菌株wxx-3总dna，具体步骤为：细胞裂解、活化、洗脱和回收。之后用16srdna通用引物27f/1492r进行pcr扩增。扩增体系为上游引物1μl，下游引物1μl，dna模板1μl，金牌mix27μl，共计30ul，反应程序为98℃预变性3min，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，35个循环。然后将pcr扩增后片段进行16srdna测序，测序结果(如seqidno：1所示)在genbank对比性分析显示菌株wxx-3与brucellasp.高度相似，在分子系统发育分类学上属于布鲁氏菌(图2)。实施例2布鲁氏菌wxx-3对环丙沙星降解效果的研究布鲁氏菌wxx-3的扩大培养首先将实施例1筛选得到的wxx-3菌株在lb液体培养基中活化12h，然后将活化到对数期的菌液按照1％(体积浓度)接种量再次转接到新鲜lb液体培养基中，扩大培养24h后菌体数量达2×1010cfu/ml，得到发酵菌剂。液体环境下wxx-3菌株对环丙沙星的降解效果设置2个处理：1)cfc:含有20mg/l环丙沙星的lb液体培养基；2)cfc+wxx-3:将扩大培养后的菌株按1％(体积浓度)接种量接种至含有20mg/l环丙沙星的lb液体培养基中。将反应瓶用锡箔纸包上以避光，置于30℃、180r/min的恒温培养箱培养，取样时间分别为0、2、4、6、8、10和14天，测定环丙沙星浓度。结果见表2和图3。表2不同处理组环丙沙星的降解效果(单位：mg/l)天数/d024681014cfc19.619.219.819.819.819.319.2cfc+wxx-319.916.415.214.511.311.011.4由表2和图3可知，液体环境下wxx-3菌株能够有效降解环丙沙星，在第8～10天时降解率达43.2％～44.7％，之后环丙沙星浓度基本不再降低。实施例3wxx-3菌株在堆肥中的应用选用实施例2制备的发酵菌剂实验设置3个处理：1)ck:猪粪中不加菌；2)0.5‰wxx-3:按0.5‰(v/w,l/kg)接种量在猪粪中加入wxx-3菌剂；3)10％wxx-3:按10％(v/w,l/kg)接种量在猪粪中加入wxx-3菌剂。猪粪中含有环丙沙星20mg/l，含水量为75％。上述处理分别设置3个重复。菌株与猪粪混合均匀后于室温下静置8～10天，扩繁后有效活菌浓度达5.0×108cfu/g，之后加入木屑或秸秆，调节c/n为25/1，同时调节堆体初始含水量为55％，条垛式堆肥30天，结果见表3和图4。表3不同处理组堆肥中环丙沙星的降解效果由表3和图4可知，0.5‰wxx-3处理组的环丙沙星降解效率最高，达到85.7％，与ck相比提高了23.0％，且与10％wxx-3处理组无显著差异。综合考虑，有利于抗生素去除的堆肥方法为：将在lb液体培养基中扩大培养后的菌剂按0.1‰～1‰(v/w)添加量混入粪便原料中，静置8～10天扩繁菌株，之后添加木屑、秸秆等调理剂调节c/n正常堆肥。实施例4布鲁氏菌(brucellasp.)wxx-3和堆肥中抗性基因的测定用动物基因组dna提取试剂盒(北京擎科生物科技有限公司，tsp201-200)提取菌液dna，对22种氟喹诺酮类抗性基因进行荧光定量pcr，所需引物序列如表4所示，检测仪器为steponeplustm实时荧光定量pcr(thermo)。qpcr反应体系为tbgreen嵌合荧光染料5μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，rox参比染料0.2μl，dna模板1μl，无菌水3μl，共计10μl。反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火30s，60℃延伸30s，40个循环。结果显示，菌株中主要含有4种氟喹诺酮类抗性基因，即acrb-01、mexa、qepa和qnra。表4供试引物序列准确称取堆肥原料和堆肥发酵30天后的样品各0.1000g，用fastdnaspinkitforfaeces(mpbiomedicals)提取样品dna，详细操作步骤参考试剂盒说明书。提取的dna采用上述荧光定量pcr方法测定acrb-01、mexa、qepa和qnra这4种氟喹诺酮类抗性基因。结果见表5和图5。表5不同处理组不同抗性基因的绝对丰度结果(copies/g)注：表5中的#表示未检出。由表5和图5可知，堆肥原料和堆肥后主要存在的抗性基因为qepa，绝对丰度达1.5×1010～2.2×1010copies/g，另外三种抗性基因丰度较低。堆肥结束后，ck和0.5‰wxx-3处理中抗性基因丰度均显著降低，且0.5‰wxx-3处理中抗性基因丰度显著低于ck处理(p<0.05)，说明wxx-3菌株应用于堆肥能够显著降低抗性基因的污染风险。综上所述，本发明提供的wxx-3菌株能够高效降解氟喹诺酮类抗生素，同时利用该菌株制备的堆肥可以降解抗生素抗性基因，从而提高了堆肥产品的安全性；另外，本发明提供的堆肥制备方法操作简单，便于控制，生产工艺不会造成二次污染，适合大范围推广应用。虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。序列表<110>中国科学院南京土壤研究所<120>一株氟喹诺酮类抗生素降解菌及其在堆肥中的应用<160>43<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1333<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gagcgcgtagcaatacgagcggcagacgggtgagtaacgcgtgggaatctacccatcact60agggaataactcagggaaacttgtgctaataccctatacgaccgagaggtgaaagattta120tcggtgatggatgagcccgcgttggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggc180gacgatccatagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccag240actcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagcca300tgccgcgtgagtgatgaaggccctagggttgtaaagctctttcaccggtgaagataatga360cggtaaccggagaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaaggg420ggctagcgttgttcggatttactgggcgtaaagcgcacgtaggcgggctaataagtcagg480ggtgaaatcccggggctcaaccccggaactgcctttgatactgttagtcttgagtatgga540agaggtgagtggaattccgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcggaggaacaccag600tggcgaaggcggctcactggtccattactgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaa660caggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgttagccgttggggagtt720tactcttcggtggcgcagctaacgcattaaacattccgcctggggagtacggtcgcaaga780ttaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcg840aagcaacgcgcagaaccttaccagcccttgacatcccgatcgcggttagtggagacactt900tccttcagttcggctggatcggagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtg960agatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgcccttagttgccagcattcagt1020tgggcactctaaggggactgccggtgataagccgagaggaaggtggggatgacgtcaagt1080cctcatggcccttacgggctgggctacacacgtgctacaatggtggtgacagtgggcagc1140gagcacgcgagtgtgagctaatctccaaaagccatctcagttcggattgcactctgcaac1200tcgagtgcatgaagttggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgt1260tcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggttttacccgaaggcgct1320gtgctaaccgcaa1333<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ttgcgatgctctatgagtggcta23<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ctcgaatgcctggcgtgttt20<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4caacgatcggacgggtttc19<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tggcgatgccaccgtact18<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tactttgcgcgccatcttc19<210>7<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7cgtgcgcgaacgaacat17<210>8<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8cgtgcgcgaacgaaca16<210>9<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9actttgcgcgccatcttc18<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialse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