非洲猪瘟LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

非洲猪瘟lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
技术领域
1.本发明属于非洲猪瘟病毒检测技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟lamp检测引物组、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.非洲猪瘟(asf)是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、热性、高接触传染性疾病，其临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，表现高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血，致死率高达100％，我国已将此病规定为一类动物疾病，世界动物卫生组织将其列为a类动物疾病，该疾病已受到各国的高度重视，并作为动物外来疾病进行研究。非洲猪瘟在全球肆虐，对养殖业造成了巨大的威胁。在没有商用疫苗的情况下，快速可靠的实验室诊断对于疾病的预防和控制至关重要。
3.环介导等温扩增技术(lamp)是一种新型核酸扩增技术，因其简便、快捷、特异性强、灵敏度高等特点已经成功应用于对部分病原体、病毒、真菌的检测。
4.现有的非洲猪瘟病毒应用lamp检测举例：
5.申请号为cn201610023649.4的专利申请文件中提供了一种快速检测非洲猪瘟病毒的环介导等温扩增的方法，针对非洲猪瘟病毒k205r基因序列进行lamp引物设计，没有环引物，效率大大降低；
6.申请号为cn201910592331.1的专利申请文件中提供了一种特异性检测非洲猪瘟病毒的lamp方法，其引物组合针对保守基因b646设计，所谓的保守基因在实际序列比对后会发现在多株非洲猪瘟中存在突变，检出率大大降低，极易漏检。


技术实现要素：

7.本发明提供一种非洲猪瘟的lamp检测引物组，其靶序列为非洲猪瘟p54基因的相对保守区，其中部分引物引入简并碱基，检出率和特异性大大提高，能检出国内和国际的变异株。
8.具体的，本发明的非洲猪瘟lamp检测引物组的序列如下：
9.(1)引物组p1；
10.f3的序列如seq id no：1所示；
11.b3的序列如seq id no：2所示；
12.fip的序列如seq id no：3所示；
13.bip的序列如seq id no：4所示；
14.lf的序列如seq id no：5所示；
15.lb的序列如seq id no：6所示；
16.(2)引物组p2；
17.f3的序列如seq id no：7所示；
18.b3的序列如seq id no：8所示；
buffer 2.5μl，10mm dntps 3.5μl,100mm mgso4，1.5μl,10
×
primers 2.5μl,bst2.0 1μl,猪脾脏dna(含asfv)1μl，h2o 13μl；
58.所述的试剂盒中的反应程序为65℃反应40min，95℃灭活1min结束反应。lamp primer mix的配制方法为100μmol/l的fip/bip引物16μl，100μmol/l的f3/b3引物2μl，100μmol/l的lf/lb引物4μl，加ddh2o补足至100μl；
59.(3)根据反应结果绘制核酸扩增曲线。
60.有益效果如下：
61.本发明根据ncbi中非洲猪瘟序列，将国内外共60株非洲猪瘟序列进行比对，在非洲猪瘟全基因组范围内寻找保守序列，最后在p54基因的相对保守区作为asfv检测的靶基因设计6组引物组p1
‑
p6，其中部分引物引入简并碱基，检出率和特异性大大提高，能检出国内和国际的变异株。
附图说明
62.图1是本发明提供的引物组p1的lamp基因扩增曲线；
63.图2是本发明提供的引物组p2的lamp基因扩增曲线；
64.图3是本发明提供的引物组p3的lamp基因扩增曲线；
65.图4是本发明提供的引物组p4的lamp基因扩增曲线；
66.图5是本发明提供的引物组p5的lamp基因扩增曲线；
67.图6是本发明提供的引物组p6的lamp基因扩增曲线；
68.图7是本发明提供的引物组p1的灵敏性实验结果图；
69.图8是本发明提供的引物组p2的灵敏性实验结果图；
70.图9是本发明提供的引物组p3的灵敏性实验结果图；
71.图10是本发明提供的引物组p4的灵敏性实验结果图；
72.图11是本发明提供的引物组p5的灵敏性实验结果图；
73.图12是本发明提供的引物组p6的灵敏性实验结果图；
74.图13是本发明提供的lamp检测(引物组p1
‑
p6)含asfv病毒的样本实验结果图。
具体实施方式
75.本领域技术人员可以借鉴本发明内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
76.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
77.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
78.下述实施例中所用的猪伪狂犬病毒(prv)，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(又称蓝耳病，prrsv)，猪圆环病毒2型(pcv
‑
2)，猪瘟病毒(csfv)和猪细小病毒(ppv)均由军事医学科学院赠送。
79.实施例1、lamp引物的设计与合成：
80.根据60株非洲猪瘟病毒的比对结构，确定p54基因区域为相对保守和设计筛选lamp引物区域(genbank登录号为mt358378)。利用lamp primerexplorer在线网页(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计多套lamp扩增引物，每套引物分别针对p54基因的8个相对保守区域，每套引物包括一对编号为f3/b3的内引物，一对编号为fip/bip的外引物以及一对编号为lf/lb的环引物，采用lamp方法扩增验筛选出高灵敏性和特异性的6套引物组p1
‑
p6，如表1所示。
81.表1
82.83.[0084][0085]
实施例2、引物组p1特异性实验：
[0086]
采用实施例13中的lamp检测方法，所述的lamp检测方法使用引物组p1，分别采用猪基因组(含asfv)，猪基因组，猪伪狂犬病毒(prv)，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(又称蓝耳病，prrsv)，猪圆环病毒2型(pcv
‑
2)，猪瘟病毒(csfv)和猪细小病毒(ppv)的基因组dna作为模板，进行lamp基因扩增，绘制基因扩增曲线如图1所示，可知只有非洲猪瘟病毒有扩增曲线，其他样品无扩增，说明引物组具有较好的特异性。
[0087]
引物组p1中的f3为简并引物，简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基序列可能性引物的混合物，简并碱基y表示c或t。
[0088]
实施例3、引物组p2特异性实验：
[0089]
本实施例和实施例2的区别在于：lamp基因扩增使用引物组p2，绘制基因扩增曲线如图2所示，可知只有非洲猪瘟病毒有扩增曲线，其他样品无扩增，说明本发明的lamp引物具有较好的特异性。
[0090]
引物组p2中的lf为简并引物，简并碱基y表示c或t。
[0091]
实施例4、引物组p3特异性实验：
[0092]
本实施例和实施例2的区别在于：lamp基因扩增使用引物组p3，绘制基因扩增曲线如图3所示，可知只有非洲猪瘟病毒有扩增曲线，其他样品无扩21增，说明本发明的lamp引物具有较好的特异性。
[0093]
引物组p3中的b3、lf和lb为简并引物，简并碱基y表示c或t。
[0094]
实施例5、引物组p4特异性实验：
[0095]
本实施例和实施例2的区别在于：lamp基因扩增使用引物组p4，绘制基因扩增曲线如图4所示，可知只有非洲猪瘟病毒有扩增曲线，其他样品无扩增，说明本发明的lamp引物具有较好的特异性。
[0096]
实施例6、引物组p5特异性实验：
[0097]
本实施例和实施例2的区别在于：lamp基因扩增使用引物组p5，绘制基因扩增曲线如图5所示，可知只有非洲猪瘟病毒有扩增曲线，其他样品无扩增，说明本发明的lamp引物具有较好的特异性。
[0098]
实施例7、引物组p6特异性实验：
[0099]
本实施例和实施例2的区别在于：lamp基因扩增使用引物组p6，绘制基因扩增曲线如图6所示，可知只有非洲猪瘟病毒有扩增曲线，其他样品无扩增，说明本发明的lamp引物具有较好的特异性。
[0100]
实施例8、引物组p1灵敏性实验：
[0101]
(1)绘制标准曲线：合成实时荧光定量引物和质粒模板，将质粒进行梯度稀释，获得109，108，107，106，105，104，103，102，101拷贝的模板，进行荧光定量pcr，绘制标准曲线；
[0102]
(2)确定asfv拷贝数，使用荧光定量引物，进行asfv扩增，并将结果与标准曲线对应，获得asfv拷贝数，并对其进行梯度稀释，获得104,103,102,101拷贝asfv模板；
[0103]
(3)对104,103,102,101拷贝的asfv进行lamp扩增，其中104,103,102均有较理想的扩增曲线如图7所示，引物组p1具有良好的灵敏性。
[0104]
实施例9、引物组p2灵敏性实验：
[0105]
本实施例与实施例8的区别在于：灵敏性实验使用引物组p2，由扩增曲线如图8所知：引物组p2具有良好的灵敏性。
[0106]
实施例10、引物组p3灵敏性实验：
[0107]
本实施例与实施例8的区别在于：灵敏性实验使用引物组p3，由扩增曲线如图9所知：引物组p3具有良好的灵敏性。
[0108]
实施例11、引物组p4灵敏性实验：
[0109]
本实施例与实施例8的区别在于：灵敏性实验使用引物组p4，由扩增曲线如图10所知：引物组p4具有良好的灵敏性。
[0110]
实施例12、引物组p5灵敏性实验：
[0111]
本实施例与实施例8的区别在于：灵敏性实验使用引物组p5，由扩增曲线如图11所知：引物组p5具有良好的灵敏性。
[0112]
实施例13、引物组p6灵敏性实验：
[0113]
本实施例与实施例8的区别在于：灵敏性实验使用引物组p6，由扩增曲线如图12所知：引物组p6具有良好的灵敏性。
[0114]
实施例14、采用lamp技术检测(引物组p1
‑
p6)含asfv病毒的样本。
[0115]
lamp反应体系为25μl，其中，10
×
isothermal amplification buffer 2.5μl，10mm dntps 3.5μl,100mm mgso4，1.5μl,10
×
primers 2.5μl,bst2.0 1μl,猪脾脏dna(含asfv)1μl，h2o 13μl。lamp反应程序为65℃反应40min，95℃灭活1min结束反应。lamp primer mix的配制方法为100μmol/l的fip/bip引物16μl，100μmol/l的f3/b3引物2μl，100μmol/l的lf/lb引物4μl，加ddh2o补足至100μl。
[0116]
以含102拷贝asfv的猪脾脏裂解液dna为模板，采用上述体系进行lamp扩增，扩增结果如下图13所示，p1
‑
p3对102拷贝asfv均有很好的扩增。以含102拷贝的asfv，用引物p1
‑
p3扩增，循环数在20
‑
25ct，而p4
‑
p6虽然也比较好，但循环数略大，约25
‑
30ct。
[0117]
本发明筛选获得6套高灵敏度和特异性的lamp引物，对于非洲猪瘟病毒的早期检测和早期预防具有很好的应用价值，所述的检测方法具有操作简单、成本低廉和反应周期短等优点。
[0118]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。