异二聚免疫球蛋白的制作方法

异二聚免疫球蛋白1.本技术是申请日为2013年11月21日、申请号为201380066334.2、发明名称为“异二聚免疫球蛋白”的发明专利申请的分案申请。2.相关申请的交叉引用3.本技术要求2012年11月21日提交的美国临时申请号61/729,148和2013年3月13日提交的美国临时申请号61/779,439的优先权益，所述临时申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。4.发明
技术领域：
：5.本发明大体上涉及制备和使用用于治疗与低骨矿物质密度相关的病症的异二聚抗体的方法。6.以引用的方式并入电子提交材料7.以引用的方式整体并入本文的是与此同时提交，并且如下识别的电脑可读核苷酸/氨基酸序列表：2013年11月13日创建的名为“47233b_seqlisting.txt”的具有960,666个字节的ascii(文本)文件。8.以引用方式的并入9.以下申请据此以引用的方式整体并入：2012年8月2日提交的pct/us2012/049331，其要求2011年8月4日提交的美国临时专利申请号61/515,191的优先权；2006年4月25日提交的美国专利申请号11/410,540，其要求2006年4月17日提交的美国临时专利申请号60/792,645、2006年3月13日提交的美国临时专利申请号60/782,244、2006年2月24日提交的美国临时专利申请号60/776,847和2005年5月3日提交的美国临时专利申请号60/677,583的优先权；以及2006年4月25日提交的美国专利申请号11/411,003(以美国专利号7,592,429授予)，其要求2006年4月17日提交的美国临时专利申请号60/792,645、2006年3月13日提交的美国临时专利申请号60/782,244、2006年2月24日提交的美国临时专利申请号60/776,847和2005年5月3日提交的美国临时专利申请号60/677,583的优先权。以下申请据此也以引用的方式并入：2008年9月17日提交的美国专利申请号12/212,327，其要求2007年9月17日提交的美国临时专利申请号60/973,024的优先权；以及2010年6月29日提交的美国专利申请号12/811,171，其根据美国法典第35篇第371条是2008年12月15日提交的国际专利申请号pct/us08/86864的美国国家阶段申请，其要求2007年12月14日提交的美国临时专利申请号61/013,917的优先权。10.发明背景11.开发作为人疾病的治疗剂的双特异性抗体具有巨大临床潜力。双特异性抗体可同时识别两种不同抗原，中和不同病原性介体，募集不同类型的效应细胞，并且调节信号路径。然而，产生双特异性抗体已极具挑战性。广泛应用双特异性抗体已因难以开发用于产生展现有利半衰期、高稳定性、缺乏免疫原性以及大规模制造和纯化的可行性的双特异性抗体的平台而受阻。如dvd‑ig(双可变结构域ig)(naturebiotechnology25,1290‑1297(2007))；交叉ig[schaeferw等(2011)pnas108(27):11187‑11192]；二合一ig(science2009,323,1610)；抗体[pnas92(15):7021‑7025；1995]的有前途的双特异性抗体形式允许产生双特异性抗体，但它们具有不同种类的缺点。[0012]发明概述[0013]本文描述自两种不同先前存在抗体产生异二聚抗体的方法。[0014]在一个方面，本文描述一种在以下各结构域中包含一个或多个取代的异二聚抗体或其片段：第一ch3结构域、第二ch3结构域、ch1结构域、cl结构域、vh结构域和vl结构域，其中所述一个或多个取代引入在静电方面不利于同二聚体形成，并且在静电方面有利于异二聚体形成的带电荷氨基酸。[0015]在一些变化形式中，第一ch3结构域或第二ch3结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型人igg氨基酸序列中在ch3结构域中的相应位置处的一个或多个带正电荷氨基酸(例如赖氨酸、组氨酸和精氨酸)被一个或多个带负电荷氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)置换。或者，第一ch3结构域或第二ch3结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型人igg氨基酸序列中在ch3结构域中的相应位置处的一个或多个带负电荷氨基酸被一个或多个带正电荷氨基酸置换。[0016]在一些变化形式中，ch1结构域或cl结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型igg氨基酸序列中的一个或多个带正电荷氨基酸被一个或多个带负电荷氨基酸置换。或者，ch1结构域或cl结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型igg氨基酸序列中的一个或多个带负电荷氨基酸被一个或多个带正电荷氨基酸置换。[0017]在一些变化形式中，本文所述的异二聚抗体的vh结构域或vl结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型igg氨基酸序列中的一个或多个带正电荷氨基酸被一个或多个带负电荷氨基酸置换。或者，vh结构域或vl结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型igg氨基酸序列中的一个或多个带负电荷氨基酸被一个或多个带正电荷氨基酸置换。[0018]在另一方面，本文描述一种包含重链的异二聚抗体或其片段，所述重链包含(a)在选自由aho位置42‑50组成的组的aho位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第一氨基酸取代，(b)在选自由位置126‑213(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第二氨基酸取代，(c)在选自由位置352‑360(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第三氨基酸取代，以及(d)在选自由位置395‑403(eu编号)组成的组的位置处的引入带电荷氨基酸的第四氨基酸取代，其中(a)的所述带电荷氨基酸与(b)的所述带电荷氨基酸具有相同电荷，并且其中(c)和(d)的所述带电荷氨基酸具有(a)和(b)的所述带电荷氨基酸的相反电荷。[0019]在一些实施方案中，第一氨基酸取代在aho位置46处，第二氨基酸取代在eu位置183处，第三氨基酸取代在eu位置356处，并且第四氨基酸取代在eu位置399处。在一些实施方案中，aho位置46处的谷氨酰胺被谷氨酸置换，eu位置183处的丝氨酸被谷氨酸置换，eu位置356处的谷氨酸被赖氨酸置换，并且eu位置399处的天冬氨酸被赖氨酸置换。[0020]在另一方面，本文描述一种包含重链的抗体或其片段，所述重链包含(a)在选自由aho位置35‑43组成的组的aho位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第一氨基酸取代，(b)在选自由位置126‑213(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第二氨基酸取代，(c)在选自由位置388‑398(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第三氨基酸取代，以及(d)在选自由位置404‑413(eu编号)组成的组的位置处的引入带电荷氨基酸的第四氨基酸取代，其中(c)和(d)的所述带电荷氨基酸具有(a)和(b)的所述带电荷氨基酸的相反电荷。在一些实施方案中，aho位置46处的谷氨酰胺被赖氨酸置换，eu位置183处的丝氨酸被赖氨酸置换，eu位置392处的赖氨酸被天冬氨酸置换，并且eu位置409处的赖氨酸被天冬氨酸置换。[0021]在另一方面，本文描述一种包含轻链的抗体或片段，所述轻链包含(a)在选自由aho位置42‑50组成的组的aho位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第一氨基酸取代，以及(b)在选自由位置126‑213(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第二氨基酸取代。在一些实施方案中，aho位置46处的谷氨酰胺被谷氨酸置换，并且eu位置176处的丝氨酸被谷氨酸置换。[0022]在另一方面，本文描述一种包含重链的抗体，所述重链包含(a)在选自由aho位置42‑50组成的组的aho位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第一氨基酸取代，(b)在选自由位置126‑213(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第二氨基酸取代，(c)在选自由位置352‑360(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第三氨基酸取代，以及(d)在选自由位置395‑403(eu编号)组成的组的位置处的引入带电荷氨基酸的第四氨基酸取代，其中(a)和(b)的所述带电荷氨基酸具有负电荷，并且(c)和(d)的所述带电荷氨基酸具有正电荷。在一些实施方案中，第一氨基酸取代在aho位置46处，第二氨基酸取代在eu位置183处，第三氨基酸取代在eu位置356处，并且第四氨基酸取代在eu位置399处。在一些实施方案中，抗体包含在aho位置46和eu位置176处包含带正电荷氨基酸的轻链。[0023]在另一方面，本文描述一种包含第一重链和第二重链以及第一轻链和第二轻链的异二聚抗体，其中所述第一重链在aho位置46以及eu位置183、356和399处包含氨基酸取代，其中所述第二重链在aho位置46以及eu位置183、392和409处包含氨基酸取代，并且其中所述第一轻链和所述第二轻链在aho位置46和eu位置176处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在所述位置处引入带电荷氨基酸。在一些实施方案中，第一重链的aho位置46处的谷氨酰胺被谷氨酸置换，第二重链的aho位置46处的谷氨酰胺被赖氨酸置换，第一轻链的aho位置46处的谷氨酰胺被赖氨酸置换，第二轻链的aho位置46处的谷氨酰胺被谷氨酸置换，第一重链的eu位置183处的丝氨酸被谷氨酸置换，第一重链的eu位置356处的谷氨酸被赖氨酸置换，第一重链的eu位置399处的谷氨酸被赖氨酸置换，第二重链的eu位置183处的丝氨酸被赖氨酸置换，第二重链的eu位置392处的赖氨酸被天冬氨酸置换，并且第二重链的eu位置409处的赖氨酸被天冬氨酸置换。[0024]在本文所述的一些或任何实施方案中，抗体结合硬化蛋白(sclerostin)的包含seqidno:1的氨基酸86‑111的区域。[0025]本文也描述一种结合硬化蛋白的包含seqidno:1的氨基酸86‑111的区域的异二聚抗体，其中所述抗体包含含有硬化蛋白结合部分的第一重链和第一轻链以及包含dkk1结合部分的第二重链和第二轻链，其中所述第一重链在aho位置46以及eu位置183、356和399处包含氨基酸取代，其中所述第二重链在aho位置46以及eu位置183、392和409处包含氨基酸取代，其中所述第一轻链和所述第二轻链在aho位置46和eu位置176处包含氨基酸取代，并且其中所述氨基酸取代在所述位置处引入带电荷氨基酸。[0026]在另一方面，本文描述一种结合硬化蛋白的包含seqidno:1的氨基酸86‑111的区域的异二聚抗体，所述抗体包含含有硬化蛋白结合部分的第一重链和第一轻链以及含有dkk1结合部分的第二重链和第二轻链，其中所述第一重链在eu位置183、356和399处包含氨基酸取代，其中所述第二重链在eu位置183、392和409处包含氨基酸取代，并且其中所述第一轻链和所述第二轻链在eu位置176处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在所述位置处引入带电荷氨基酸。[0027]本发明的另一方面涉及一种结合硬化蛋白和dkk‑1的异二聚抗体，其包含第一重链，所述第一重链包含本文所述的任一硬化蛋白抗体的重链可变区氨基酸序列，并且在所述第一重链的eu位置183、356和399处包含氨基酸取代；第二重链，所述第二重链包含本文所述的任一dkk‑1抗体的重链可变区氨基酸序列，并且在所述第二重链的eu位置183、392和409处包含氨基酸取代；第一轻链，所述第一轻链包含本文所述的任一硬化蛋白抗体的轻链可变区氨基酸序列，并且在所述第一轻链的eu位置176处包含氨基酸取代；以及第二轻链，所述第二轻链包含本文所述的任何dkk‑1抗体的轻链可变区氨基酸序列，并且在所述第二轻链的eu位置176处包含氨基酸取代；其中所述氨基酸取代在所述位置处引入带电荷氨基酸。[0028]本发明的另一方面涉及一种结合硬化蛋白和dkk‑1的异二聚抗体，其包含第一重链，所述第一重链包含选自由seqidno:378和366组成的组的可变区氨基酸序列，并且在所述第一重链的eu位置183、356和399处包含氨基酸取代；第二重链，所述第二重链包含选自由seqidno:1003和974组成的组的可变区氨基酸序列，并且在所述第二重链的eu位置183、392和409处包含氨基酸取代；第一轻链，所述第一轻链包含选自由seqidno:376和364组成的组的可变区氨基酸序列，并且在所述第一轻链的eu位置176处包含氨基酸取代；以及第二轻链，所述第二轻链包含选自由seqidno:1002和978组成的组的可变区氨基酸序列，并且在所述第二轻链的eu位置176处包含氨基酸取代；其中所述氨基酸取代在所述位置处引入带电荷氨基酸。[0029]在一些实施方案中，结合硬化蛋白和dkk1的异二聚抗体包含含有seqidno:1038中所述的氨基酸序列的第一重链；含有seqidno:1034中所述的氨基酸序列的第二重链；含有seqidno:1039中所述的氨基酸序列的第一轻链以及含有seqidno:1035中所述的氨基酸序列的第二轻链。[0030]在一些实施方案中，结合硬化蛋白和dkk1的异二聚抗体包含含有seqidno:1038中所述的氨基酸序列的第一重链；含有seqidno:1036中所述的氨基酸序列的第二重链；含有seqidno:1039中所述的氨基酸序列的第一轻链以及含有seqidno:1037中所述的氨基酸序列的第二轻链。[0031]在一些实施方案中，结合硬化蛋白和dkk1的异二聚抗体包含含有seqidno:1040中所述的氨基酸序列的第一重链；含有seqidno:1034中所述的氨基酸序列的第二重链；含有seqidno:1041中所述的氨基酸序列的第一轻链以及含有seqidno:1035中所述的氨基酸序列的第二轻链。[0032]在一些实施方案中，结合硬化蛋白和dkk1的异二聚抗体包含含有seqidno:1040中所述的氨基酸序列的第一重链；含有seqidno:1036中所述的氨基酸序列的第二重链；含有seqidno:1041中所述的氨基酸序列的第一轻链以及含有seqidno:1037中所述的氨基酸序列的第二轻链。[0033]在一些实施方案中，结合硬化蛋白和dkk1的异二聚抗体包含含有seqidno:1046中所述的氨基酸序列的第一重链；含有seqidno:1042中所述的氨基酸序列的第二重链；含有seqidno:1047中所述的氨基酸序列的第一轻链以及含有seqidno:1043中所述的氨基酸序列的第二轻链。[0034]在一些实施方案中，结合硬化蛋白和dkk1的异二聚抗体包含含有seqidno:1046中所述的氨基酸序列的第一重链；含有seqidno:1044中所述的氨基酸序列的第二重链；含有seqidno:1047中所述的氨基酸序列的第一轻链以及含有seqidno:1045中所述的氨基酸序列的第二轻链。[0035]在一些实施方案中，结合硬化蛋白和dkk1的异二聚抗体包含含有seqidno:1048中所述的氨基酸序列的第一重链；含有seqidno:1042中所述的氨基酸序列的第二重链；含有seqidno:1049中所述的氨基酸序列的第一轻链以及含有seqidno:1043中所述的氨基酸序列的第二轻链。[0036]在一些实施方案中，结合硬化蛋白和dkk1的异二聚抗体包含含有seqidno:1048中所述的氨基酸序列的第一重链；含有seqidno:1044中所述的氨基酸序列的第二重链；含有seqidno:1049中所述的氨基酸序列的第一轻链以及含有seqidno:1045中所述的氨基酸序列的第二轻链。[0037]本发明也涵盖一种包含重链的异二聚抗体，所述重链包含选自由seqidno:1038、seqidno:1046、seqidno:1040和seqidno:1048组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，异二聚抗体任选包含选自由seqidno:1039、seqidno:1047、seqidno:1041和seqidno:1049组成的组的轻链氨基酸序列。[0038]本发明也涵盖一种包含重链的异二聚抗体，所述重链包含选自由seqidno:1034、seqidno:1042、seqidno:1036和seqidno:1044组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，异二聚抗体任选包含选自由seqidno:1035、seqidno:1043、seqidno:1037和seqidno:1045组成的组的轻链氨基酸序列。[0039]在另一方面，本文描述一种结合硬化蛋白的包含seqidno:1的氨基酸86‑111的区域的抗体，其中所述抗体在以下各结构域中包含取代：第一ch3结构域、第二ch3结构域、ch1结构域和cl结构域，其中所述一个或多个取代引入在静电方面不利于同二聚体形成，并且在静电方面有利于异二聚体形成的带电荷氨基酸。[0040]本文也描述一种结合硬化蛋白的包含seqidno:1的氨基酸86‑111的区域的抗体，其中所述抗体包含具有包含一个或多个氨基酸取代的ch3结构域的重链，其中所述一个或多个取代引入在静电方面不利于同二聚体形成，并且在静电方面有利于异二聚体形成的带电荷氨基酸。在一些实施方案中，ch3结构域中的带负电荷氨基酸(例如在eu位置d399、e356或e357处)被带正电荷氨基酸取代。在一些实施方案中，eu位置d399、e356和e357处的氨基酸被带正电荷氨基酸(例如赖氨酸)取代。[0041]在替代性实施方案中，ch3结构域中的带正电荷氨基酸(例如在eu位置k370、k392或k409处)被带负电荷氨基酸取代。在一些实施方案中，如eu位置k370、k392和k409的氨基酸被带负电荷氨基酸(例如天冬氨酸)取代。[0042]在一些实施方案中，异二聚抗体是抗体、双特异性抗体、单特异性单价抗体、双特异性大抗体、单域抗体、肽体、双特异性肽体、单价肽体或受体融合蛋白。[0043]也提供包含编码本文所述的任何异二聚抗体的核苷酸序列的核酸以及包含核酸的载体和包含核酸(或载体)的宿主细胞。[0044]本发明的另一方面涉及增加哺乳动物受试者中的骨矿物质密度的方法，其包括以有效增加所述受试者中的骨矿物质密度的量向所述受试者施用本文所述的异二聚抗体。本发明也包括使用本文所述的异二聚抗体增加骨矿物质密度的方法。如本文所述的使用方法可或者表征为异二聚抗体增加骨矿物质密度的用途。[0045]本发明也包括包含本文所述的异二聚抗体和药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂的组合物。在一些实施方案中，在约4℃下储存两周之后，组合物中小于5％(或小于4％、或小于3％、或小于2％或小于1％或1％以下)的抗体呈聚集体形式。可例如通过粒径排阻色谱法(sec)或动态光散射(dls)测定组合物中的抗体聚集量。[0046]在另一方面，本文描述一种包含异二聚抗体或其片段和药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂的组合物，所述异二聚抗体或其片段在以下各结构域中包含一个或多个取代：第一ch3结构域、第二ch3结构域、ch1结构域、cl结构域、vh结构域和vl结构域，其中所述一个或多个取代引入在静电方面不利于同二聚体形成，并且在静电方面有利于异二聚体形成的带电荷氨基酸；其中在约4℃下储存两周之后，所述组合物中小于5％的所述抗体或片段呈聚集体形式。[0047]在另一方面，本文描述一种包含结合硬化蛋白的包含seqidno:1的氨基酸86‑111的区域的异二聚抗体和药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂的组合物，所述抗体在以下各结构域中包含取代：第一ch3结构域、第二ch3结构域、ch1结构域和cl结构域，其中所述一个或多个取代引入在静电方面不利于同二聚体形成，并且在静电方面有利于异二聚体形成的带电荷氨基酸；其中在约4℃下储存两周之后，所述组合物中小于5％的所述抗体呈聚集体形式。[0048]本文所用的章节标题仅出于组织目的，并且不应解释为限制所述主题。本说明书的主体内引用的所有参考文献都以引用的方式明确整体并入本文。[0049]标准技术可用于重组dna、寡核苷酸合成、组织培养和转化、蛋白质纯化等。可根据制造商说明书或如本领域中通常所达成或如本文所述来执行酶促反应和纯化技术。以下程序和技术可通常根据本领域中熟知以及如本说明书整篇引用和论述的各种一般性和更特定参考文献中所述的常规方法来执行。参见例如sambrook等,2001,molecularcloning:alaboratorymanuel,第3版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.，其出于任何目的以引用的方式并入本文。除非提供明确定义，否则关联本文所述的分析化学、有机化学以及医学和药物化学使用的命名法和本文所述的分析化学、有机化学以及医学和药物化学的实验室程序和技术是本领域中熟知，并且通常使用的那些。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及治疗患者。[0050]附图简述[0051]图1说明以下异二聚抗体的体内研究设计：(1)ab23‑ab6.147v2，(2)ab5‑ab6.37.5v1，以及(3)ab5‑ab6.147。[0052]图2比较单特异性ig(ab5)、双特异性dvd(6.147‑ab23)和异二聚抗体(1、2和3)之间的在第3周在小鼠的腰椎和腿中达成的骨物质密度(bmd)增加百分比。[0053]图3显示四种硬化蛋白‑dkk1异二聚抗体(即ab23‑6.37.5v1、ab5‑6.37.5v1、ab5‑6.147v2和ab23‑6.147v2)的药物动力学(pk)分布。[0054]图4：使用不同方法的双特异性抗体变体的构造，(a)结合抗原a的可变区中的一对带电荷残基k/d与ch1/cl中的一对带电荷残基d/k组合以增强lc与它的同源hc配对；结合抗原b的可变区中的一对带电荷残基d/k与ch1/cl中的一对带电荷残基k/d组合以增强lc与它的同源hc配对。也指示ch3结构域中的异二聚化电荷残基。(b)结合抗原a的可变区中的一对带电荷残基d/k与ch1/cl中的两对带电荷残基kk/dd组合以增强lc与它的同源hc配对；结合抗原b的可变区中的一对带电荷残基k/d与ch1/cl中的两对带电荷残基dd/kk组合以增强lc与它的同源hc配对。也指示ch3结构域中的用于异二聚化的电荷残基。(c)结合抗原a的可变区中的两对带电荷残基kk/dd与ch1/cl中的一对带电荷残基d/k组合以增强lc与它的同源hc配对；结合抗原b的可变区中的两对带电荷残基dd/kk与ch1/cl中的一对带电荷残基k/d组合以增强lc与它的同源hc配对。也指示ch3结构域中的用于异二聚化的电荷残基。(d)结合抗原a的可变区中的两对带电荷残基kk/dd与ch1/cl中的两对带电荷残基dd/kk组合以增强lc与它的同源hc配对；结合抗原b的可变区中的两对带电荷残基dd/kk与ch1/cl中的两对带电荷残基kk/dd组合以增强lc与它的同源hc配对。也指示ch3结构域中的用于异二聚化的电荷残基。(e)结合抗原a的可变区中的一对带电荷残基k/d和一对半胱氨酸残基与ch1/cl中的一对带电荷残基d/k组合以增强lc与它的同源hc配对；结合抗原b的可变区中的一对半胱氨酸残基和一对带电荷残基d/k与ch1/cl中的一对带电荷残基k/d组合以增强lc与它的同源hc配对。也指示ch3结构域中的用于异二聚化的电荷残基。表示半胱氨酸残基，在两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键可以正确lc/hc配对使fab区稳定。(f)结合抗原a的可变区中的一对带电荷残基k/d和一对小/大残基与ch1/cl中的一对带电荷残基d/k组合以增强lc与它的同源hc配对；结合抗原b的可变区中的一对带电荷残基残基d/k和一对大/小残基与ch1/cl中的一对带电荷残基k/d组合以增强lc与它的同源hc配对。也指示ch3结构域中的用于异二聚化的电荷残基。突出三角表示大残基；退缩三角表示小残基。钮入孔效应可与静电操纵效应合作起作用以指导和稳定化正确lc/hc配对。[0055]图5：人重链v区和j区的比对。编号是基于aho系统。加亮界面残基。[0056]图6：人κ链v区和j区的比对。编号是基于aho系统。加亮界面残基。[0057]图7：人λ链v区和j区的比对。编号是基于aho系统。加亮界面残基。[0058]图8是关联dkk1mrna表达(y轴)与向食蟹猕猴施用的ab‑5的剂量(mg/kg)(x轴)的图。说明的数据显示硬化蛋白抗体治疗诱导食蟹猕猴的肱骨中段和腰椎中的dkk1mrna表达。[0059]图9是描绘在第1天(iv)、第15天(iv)和第43天(sc)接受25mg/kgab‑5、dvd抗体6.147‑abl‑ab23、异二聚抗体ab23‑6.37.5.v.1、异二聚抗体ab5‑6.37.5.v.1和异二聚抗体ab5‑6.147.v.1的食蟹猕猴中绝对血清酒石酸抗性酸性磷酸酶5b(tracp5b)浓度(y轴)随时间(x轴)的变化百分比的图。[0060]图10是描绘在第1天(iv)、第15天(iv)和第43天(sc)接受25mg/kgab‑5、dvd抗体6.147‑abl‑ab23、异二聚抗体ab23‑6.37.5.v.1、异二聚抗体ab5‑6.37.5.v.1和异二聚抗体ab5‑6.147.v.1的食蟹猕猴中血清骨钙蛋白(oc)浓度(y轴)随时间(x轴)的变化百分比的图。[0061]图11是描绘在第1天(iv)、第15天(iv)和第43天(sc)接受25mg/kgab‑5、dvd抗体6.147‑abl‑ab23、异二聚抗体ab23‑6.37.5.v.1、异二聚抗体ab5‑6.37.5.v.1和异二聚抗体ab5‑6.147.v.1的食蟹猕猴中血清骨碱性磷酸酶(bap)浓度(y轴)随时间(x轴)的变化百分比的图[0062]图12是描绘在第1天(iv)、第15天(iv)和第43天(sc)接受ab‑5、dvd抗体6.147‑abl‑ab23、异二聚抗体ab23‑6.37.5.v.1、异二聚抗体ab5‑6.37.5.v.1和异二聚抗体ab5‑6.147.v.1的食蟹猕猴中血清c1cp浓度(y轴)随时间(x轴)的变化百分比的图。[0063]图13是描绘在iv和sc注射之后，ab‑5、dvd抗体6.147‑abl‑ab23、异二聚抗体ab23‑6.37.5.v.1、异二聚抗体ab5‑6.37.5.v.1和异二聚抗体ab5‑6.147.v.1的药物动力学分布(浓度(nm)(y轴)对时间(小时)(x轴))的图。[0064]图14是描绘接受异二聚抗体(具有垂直条纹和斜条纹的棒条)、硬化蛋白抗体单药疗法(打点棒条)、dkk1抗体单药疗法(中空棒条)或组合硬化蛋白抗体和dkk1抗体(具有水平条纹的棒条)的小鼠的腰椎中骨物质相较于基线的变化百分比(y轴)的图。[0065]发明详述[0066]本技术是基于发现可通过以可在不存在其它污染物质的情况下仅使两种不同抗体的重链和轻链装配至异二聚抗体中的方式工程改造两种不同抗体的重链和轻链来产生异二聚igg。在一个方面，通过工程改造两个重链的ch3区以使它仅形成异二聚体来达成异二聚配对。此外，通过工程改造轻链(lc)与重链(hc)之间的界面残基达成的静电操纵防止当两对不同重链和轻链装配以形成所需四链异二聚抗体时，轻链与非同源重链错配。如本文所述，一示例性策略包括在lc1/hc1界面处在第一轻链(lc1)中引入一个或多个带负电荷残基(例如asp或glu)，并且在相伴重链(hc1)中引入一个或多个带正电荷残基(例如lys、his或arg)，同时在lc2/hc2界面处在第二轻链(lc2)中引入一个或多个带正电荷残基(例如lys、his或arg)，并且在相伴重链(hc2)中引入一个或多个带负电荷残基(例如asp或glu)。静电操纵效应引导lc1与hc1配对，并且引导lc2与hc2配对，因为在界面处的相反带电荷残基(极性)吸引，而在界面处的相同类型的带电荷残基(极性)产生排斥，从而使非所要hc/lc配对受抑制。[0067]使选择用于工程改造的lc/hc界面残基包埋在vl/vh和cl/ch1界面内，并且在空间上接近。在不同抗体家族之中，靶标残基充分保守。工程改造轻链和重链以形成特定异二聚体的其它方式包括用一对半胱氨酸残基置换vl/vh界面中的一对带电荷残基以形成二硫键来稳定fab区，用疏水性残基(例如谷氨酰胺)置换vl/vh界面中的一个或多个亲水性残基(例如甘氨酸)，或工程改造vl/vh界面处的一对大/小残基以施加钮入孔效应来容纳正确lc/hc配对。本文所述的策略可用于在不使用人工接头下自两种先前存在抗体高效产生全长异二聚抗体。所得异二聚抗体稳定且可经受商业制造而不过度聚集或损失产率。因为这个新型的异二聚抗体可同时靶向两种不同抗原或同一抗原上的两种不同表位，所以它可具有独特治疗许多疾病的重大潜力。[0068]如本文所用的术语“界面”是指由第一抗体结构域中的一个或多个氨基酸与第二抗体结构域的一个或多个氨基酸相互作用产生的缔合表面。示例性界面包括ch1/cl、vh/vl和ch3/ch3。在一些实施方案中，界面包括例如形成界面的氨基酸之间的氢键、静电相互作用或盐桥。[0069]在一个方面，本文描述一种在以下各结构域中包含一个或多个取代的异二聚抗体或其片段：第一ch3结构域、第二ch3结构域、ch1结构域、cl结构域、vh结构域和vl结构域，其中所述一个或多个取代引入在静电方面不利于同二聚体形成，并且在静电方面有利于异二聚体形成的带电荷氨基酸。[0070]本文所述的异二聚抗体可包含任何恒定区。轻链恒定区可为例如κ或λ型轻链恒定区，例如人κ或λ型轻链恒定区。重链恒定区可为例如α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区，例如人α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区。在一个实施方案中，轻链或重链恒定区是天然存在的恒定区的片段、衍生物、变体或突变蛋白质。[0071]在一些变化形式中，第一ch3结构域或第二ch3结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型人igg氨基酸序列中在ch3结构域中的相应位置处的一个或多个带正电荷氨基酸(例如赖氨酸、组氨酸和精氨酸)被一个或多个带负电荷氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)置换。或者，第一ch3结构域或第二ch3结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型人igg氨基酸序列中在ch3结构域中的相应位置处的一个或多个带负电荷氨基酸被一个或多个带正电荷氨基酸置换。[0072]在一些变化形式中，ch1结构域或cl结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型igg氨基酸序列中的一个或多个带正电荷氨基酸被一个或多个带负电荷氨基酸置换。或者，ch1结构域或cl结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型igg氨基酸序列中的一个或多个带负电荷氨基酸被一个或多个带正电荷氨基酸置换。[0073]在一些变化形式中，本文所述的异二聚抗体的vh结构域或vl结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型igg氨基酸序列中的一个或多个带正电荷氨基酸被一个或多个带负电荷氨基酸置换。或者，vh结构域或vl结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型igg氨基酸序列中的一个或多个带负电荷氨基酸被一个或多个带正电荷氨基酸置换。[0074]在另一方面，本文描述一种包含重链的异二聚抗体或其片段，所述重链包含(a)在选自由aho位置42‑50组成的组的aho位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第一氨基酸取代，(b)在选自由位置126‑213(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第二氨基酸取代，(c)在选自由位置352‑360(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第三氨基酸取代，以及(d)在选自由位置395‑403(eu编号)组成的组的位置处的引入带电荷氨基酸的第四氨基酸取代，其中(a)的所述带电荷氨基酸与(b)的所述带电荷氨基酸具有相同电荷，并且其中(c)和(d)的所述带电荷氨基酸具有(a)和(b)的所述带电荷氨基酸的相反电荷。[0075]在本文中，使用aho编号系统描述可变结构域的框架区(下述)内的特定氨基酸的位置。因为抗体cdr氨基酸序列长度在抗体与抗体之间不同，所以基于线性序列(假定第一残基为位置1)对残基编号会导致在各抗体之间，框架残基具有不同位置编号。使用kabat或eu编号流程可避免这个冲突，并且使得能够在抗体间比较框架位置。然而，结构等效位置可具有不同kabat或eu编号。类似地，具有相同kabat编号的残基可存在于结构上的两个不同位置处。annemariehonegger和andreaspluckthun开发在cdr区中引入间隙以使与所比对结构域的平均结构的偏差最小的结构基编号流程(aho)。(honegger,a.和plückthun,a.(2001).j.mol.biol.309,657‑670)这导致当比较两种不同抗体时，结构等效位置具有相同残基编号。这使得能够在抗体之间比较可变结构域框架区中的取代的影响。图5‑7分别提供人重链、κ和λ可变结构域区域的aho编号。[0076]如本文所用，术语“框架”或“框架序列”是指可变区减去cdr的区域或序列。因为cdr序列的精确界定可通过不同系统来确定，所以框架序列的含义易受相应不同解释。六个cdr(轻链的cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3以及重链的cdr‑h1、cdr‑h2和cdr‑h3)也将轻链和重链上的框架区分成各链上的四个子区域(fr1、fr2、fr3和fr4)，其中cdr1位于fr1与fr2之间，cdr2位于fr2与fr3之间，并且cdr3位于fr3与fr4之间。在不将特定子区域指定为fr1、fr2、fr3或fr4的情况下，框架区代表单一天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合fr。如本文所用，fr代表四个子区域中的一个，并且frs代表构成框架区的四个子区域中的两个或更多个。[0077]“取代”氨基酸或氨基酸“的取代”是指将原始氨基酸残基取代成一个或多个其它氨基酸残基。[0078]重链修饰[0079]为使特定重链接合它的同源轻链的效率最大，重链与轻链两者均含有互补氨基酸取代。就“互补氨基酸取代”而言，其是指对重链中的正电荷氨基酸的取代与对轻链中的与重链残基缔合的氨基酸的带负电荷氨基酸取代配对。同样，对重链中的负电荷氨基酸的取代与对轻链中的与重链残基缔合的氨基酸的带正电荷氨基酸取代配对。[0080]在一些实施方案中，工程改造抗体重链可变区。图5是人重链可变结构域v区和j区的生殖系比对。在一些实施方案中，异二聚抗体包含与人生殖系重链可变区至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的重链可变区。[0081]vh结构域内的v区界面残基(即介导vh结构域和vl结构域的装配的氨基酸残基)包括aho位置1(kabat位置1)、3(kabat位置3)、42(kabat位置35)、44(kabat位置37)、46(kabat位置39)、50(kabat位置43)、51(kabat位置44)、52(kabat位置45)、53(kabat位置46)、54(kabat位置47)、57(kabat位置50)、70(kabat位置59)、103(kabat位置89)、105(kabat位置91)和107(kabat位置93)。内部的j区界面残基包括aho位置139(kabat位置103)、140(kabat位置104)、141(kabat位置105)和142(kabat位置106)。在一些实施方案中，一个或多个界面残基被带电荷(带正电荷或带负电荷)氨基酸取代。[0082]在一些实施方案中，vh结构域的aho位置46(kabat位置39)处的氨基酸被带正电荷氨基酸置换。在替代性实施方案中，vh结构域的aho位置46(kabat位置39)处的氨基酸被带负电荷氨基酸置换。[0083]在一些实施方案中，vh结构域的aho位置51(kabat位置44)和/或aho位置141(kabat位置105)处的氨基酸被带电荷氨基酸置换。在一些实施方案中，aho位置51处的氨基酸被取代成带正电荷氨基酸，例如赖氨酸。在替代性实施方案中，aho位置51处的氨基酸被取代成带负电荷氨基酸，例如天冬氨酸。在一些实施方案中，aho位置141处的氨基酸被取代成带正电荷氨基酸，例如赖氨酸。在替代性实施方案中，aho位置141处的氨基酸被取代成带负电荷氨基酸，例如天冬氨酸。在一些实施方案中，aho位置51和aho位置141处的氨基酸被取代成带正电荷氨基酸(例如赖氨酸)或带负电荷氨基酸(例如天冬氨酸)。所述实施方案可还包括在aho位置46处取代成带正电荷或带负电荷氨基酸。[0084]重链的ch1区也与轻链复合，并且这个区域可被工程改造来增加特定重链与它的同源轻链配对的效率。可通过以下手段来促进装配：在或接近界面处将半胱氨酸残基引入重链和轻链中以允许形成二硫键，改变氨基酸以产生钮入孔效应，以及与本文对于可变区所述的静电工程改造类似的静电工程改造。[0085]在一些实施方案中，异二聚抗体包含与人生殖系重链ch1区至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的重链ch1区。[0086]在一些实施方案中，异二聚抗体的ch1结构域中的在选自由f126、p127、l128、a141、l145、k147、d148、h168、f170、p171、v173、q175、s176、s183、v185和k213组成的组的eu位置处的一个或多个氨基酸被带电荷氨基酸置换。就此而言，供用带负电荷或带正电荷氨基酸取代的一特别优选残基是s183(eu编号系统)。在一些实施方案中，s183被带正电荷氨基酸取代。在替代性实施方案中，s183被带负电荷氨基酸取代。[0087]本文所述的异二聚抗体任选还包含两个ch3结构域，其中至少一个含有将非天然带电荷氨基酸引入结构域中的一个或多个取代。在一些实施方案中，各ch3结构域在ch3结构域中包含一个或多个氨基酸取代以不利于同二聚化，并且更优选地，有利于与相应ch3结构域的异二聚化。国际公布号wo2009/089004(以引用的方式整体并入本文)描述用于工程改造ch3结构域界面以在两个含有ch3结构域的分子之间降低同二聚化，并且增加异二聚化的组合物和方法。在一些实施方案中，ch3结构域的一个或多个选自由399、356和357(eu编号系统)组成的组的位置处的氨基酸被带负电荷氨基酸置换。在一些实施方案中，一个或多个选自由370、392和409(eu编号系统)组成的组的位置处的氨基酸被带正电荷氨基酸置换。在替代性实施方案中，ch3结构域的一个或多个选自由399、356和357(eu编号系统)组成的组的位置处的氨基酸被带正电荷氨基酸置换。在其它实施方案中，一个或多个选自370、392和409(eu编号系统)的组的位置处的氨基酸被带负电荷氨基酸置换。在一些实施方案中，异二聚抗体包含在位置399和356处包含带正电荷氨基酸(例如d399k和e356k)的第一重链、以及在位置392和409处包含带负电荷氨基酸(例如k392d和k409d)的第二重链。[0088]在一个方面，本文所述的异二聚抗体包含(a)在选自由aho位置42‑50组成的组的aho位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第一氨基酸取代，(b)在选自由eu位置126‑213组成的组的eu位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第二氨基酸取代，(c)在选自由eu位置352‑360组成的组的eu位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第三氨基酸取代，以及(d)在选自由eu位置395‑403组成的组的eu位置处的引入带电荷氨基酸的第四氨基酸取代，其中(a)的所述带电荷氨基酸与(b)的所述带电荷氨基酸具有相同电荷，并且其中(c)和(d)的所述带电荷氨基酸具有(a)和(b)的所述带电荷氨基酸的相反电荷。举例来说，在一些实施方案中，(a)和(b)的带电荷氨基酸具有正电荷，并且(c)和(d)的带电荷氨基酸具有负电荷。在替代性实施方案中，(a)和(b)的带电荷氨基酸具有负电荷，并且(c)和(d)的带电荷氨基酸具有正电荷。在一些实施方案中，第一氨基酸取代在aho位置46处，第二氨基酸取代在eu位置183处，第三氨基酸取代在eu位置356处，并且第四氨基酸取代在eu位置399处。[0089]在另一方面，本文所述的异二聚抗体包含重链，所述重链包含(a)在选自由aho位置42‑50组成的组的aho位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第一氨基酸取代，(b)在选自由eu位置126‑213组成的组的eu位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第二氨基酸取代，(c)在选自由eu位置388‑397组成的组的eu位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第三氨基酸取代，以及(d)在选自由eu位置404‑413组成的组的eu位置处的引入带电荷氨基酸的第四氨基酸取代，其中(a)的所述带电荷氨基酸与(b)的所述带电荷氨基酸具有相同电荷，并且其中(c)和(d)的所述带电荷氨基酸具有(a)和(b)的所述带电荷氨基酸的相反电荷。举例来说，在一些实施方案中，(a)和(b)的带电荷氨基酸具有正电荷，并且(c)和(d)的带电荷氨基酸具有负电荷。在替代性实施方案中，(a)和(b)的带电荷氨基酸具有负电荷，并且(c)和(d)的带电荷氨基酸具有正电荷。在一些实施方案中，第一氨基酸取代在aho位置46处，第二氨基酸取代在eu位置183处，第三氨基酸取代在eu位置392处，并且第四氨基酸取代在eu位置409处。[0090]本文也提供一种包含第一重链和第二重链以及第一轻链和第二轻链的异二聚抗体，其中所述第一重链在位置46(aho，kabat39)、183(eu)、356(eu)和399(eu)处包含氨基酸取代，其中所述第二重链在位置46(aho)、183(eu)、392(eu)和409(eu)处包含氨基酸取代，并且其中所述第一轻链和所述第二轻链在位置46(aho，kabat38)和176(eu)处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在所述位置处引入带电荷氨基酸。在一些实施方案中，第一重链的aho位置46(kabat39)处的谷氨酰胺被谷氨酸置换，第二重链的aho位置46(kabat39)处的谷氨酰胺被赖氨酸置换，第一轻链的aho位置46(kabat38)处的谷氨酰胺被赖氨酸置换，第二轻链的aho位置46(kabat38)处的谷氨酰胺被谷氨酸置换，第一重链的位置183(eu)处的丝氨酸被谷氨酸置换，第一重链的位置356(eu)处的谷氨酸被赖氨酸置换，第一重链的位置399(eu)处的谷氨酸被赖氨酸置换，第二重链的位置183(eu)处的丝氨酸被赖氨酸置换，第二重链的位置392(eu)处的赖氨酸被天冬氨酸置换，和/或第二重链的位置409(eu)处的赖氨酸被天冬氨酸置换。[0091]在另一方面，本文描述一种结合硬化蛋白的包含seqidno:1的氨基酸86‑111的区域的抗体，其中所述抗体包含具有包含一个或多个氨基酸取代的ch3结构域的重链，其中所述一个或多个取代引入在静电方面不利于同二聚体形成，并且在静电方面有利于异二聚体形成的带电荷氨基酸。在一些实施方案中，ch3结构域中的带负电荷氨基酸(例如在eu位置d399、e356或e357处)被带正电荷氨基酸取代。在一些实施方案中，eu位置d399、e356和e357处的氨基酸被带正电荷氨基酸(例如赖氨酸)取代。国际公布号wo2009/089004(以引用的方式整体并入本文)描述用于工程改造ch3结构域界面以在两个含有ch3结构域的分子之间降低同二聚化且增加异二聚化的组合物和方法。[0092]轻链修饰[0093]如上所论述，为使特定重链与它的同源轻链的结合最大，重链与轻链两者均优选含有互补氨基酸取代以静电操纵链装配。因此，在各种实施方案中，轻链包含一个或多个互补于以上论述的重链取代的氨基酸取代。[0094]在一些实施方案中，轻链为κ轻链。图6是人κ轻链可变结构域v区和j区的生殖系比对。在一些实施方案中，异二聚抗体包含与人生殖系κ链可变区至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的κ链可变区。[0095]vl结构域内的v区界面残基(即介导vh结构域和vl结构域的装配的氨基酸残基)包括aho位置40(kabat32)、42(kabat34)、43(kabat35)、44(kabat36)、46(kabat38)、49(kabat41)、50(kabat42)、51(kabat43)、52(kabat44)、53(kabat45)、54(kabat46)、56(kabat48)、57(kabat49)、58(kabat50)、67(kabat51)、69(kabat53)、70(kabat54)、71(kabat55)、72(kabat56)、73(kabat57)、74(kabat58)、103(kabat85)、105(kabat87)、107(kabat89)、108(kabat90)和109(kabat91)。j区残基包括aho位置116、117和118。在一些实施方案中，vl结构域中的一个或多个界面残基被优选与引入同源重链可变结构域(即vh结构域)中的带电荷氨基酸具有相反电荷的带电荷氨基酸取代。在一些实施方案中，vl结构域的aho位置46(kabat38)处的氨基酸被带正电荷氨基酸置换。在一些实施方案中，如当vh结构域中的aho位置46(kabat39)处的氨基酸被带正电荷氨基酸取代时，vl结构域的aho位置46(kabat38)处的氨基酸被带负电荷氨基酸置换。[0096]在一些实施方案中，aho位置51(kabat43)和/或aho位置141(kabat100)处的氨基酸被取代成带正电荷或带负电荷氨基酸。所述实施方案可还包括使aho位置46处的氨基酸被取代成带正电荷或带负电荷氨基酸。在一些实施方案中，aho位置51处的氨基酸被取代成带正电荷氨基酸，例如赖氨酸。在替代性实施方案中，aho位置51处的氨基酸被取代成带负电荷氨基酸，例如天冬氨酸。在一些实施方案中，aho位置141处的氨基酸被取代成带正电荷氨基酸，例如赖氨酸。在替代性实施方案中，aho位置141处的氨基酸被取代成带负电荷氨基酸，例如天冬氨酸。在一些实施方案中，aho位置51和aho位置141处的氨基酸被取代成带正电荷氨基酸(例如赖氨酸)或带负电荷氨基酸(例如天冬氨酸)。所述实施方案可还包括在aho位置46(kabat38)处取代成带正电荷或带负电荷氨基酸。[0097]轻链的恒定区(即cl结构域)也与重链复合，并且这个区域可被工程改造来增加特定轻链与它的同源重链配对的效率。可通过以下手段来促进装配：在或接近界面处将半胱氨酸残基引入重链和轻链中以允许形成二硫键，改变氨基酸以产生钮入孔效应，以及与本文对于可变区所述的静电工程改造类似的静电工程改造。[0098]在轻链是κ轻链的实施方案中，异二聚抗体的cl结构域中的在选自由f116、f118、s121、d122、e123、q124、s131、v133、l135、n137、n138、q160、s162、t164、s174和s176组成的组的位置(κ轻链中的eu和kabat编号)处的一个或多个氨基酸被带电荷氨基酸置换。在一些实施方案中，供用带负电荷或带正电荷氨基酸取代的一示例性残基是cl结构域的位置176(eu和kabat编号系统)处的氨基酸。在一些实施方案中，cl结构域的位置176处的氨基酸被带正电荷氨基酸置换。在替代性实施方案中，cl结构域的位置176处的氨基酸被带负电荷氨基酸，例如天冬氨酸置换。[0099]在一些实施方案中，轻链是λ轻链。在一些实施方案中，异二聚抗体的cl结构域中的在选自由t116、f118、s121、e123、e124、k129、t131、v133、l135、s137、e160、t162、s165、q167、a174、s176和y178组成的组的位置(λ链中的kabat编号)处的一个或多个氨基酸被带电荷氨基酸置换。在一些实施方案中，供用带负电荷或带正电荷氨基酸取代的一示例性残基是cl结构域的位置176(eu和kabat编号系统)处的氨基酸。在一些实施方案中，cl结构域的位置176处的氨基酸被带正电荷氨基酸置换。在替代性实施方案中，cl结构域的位置176处的氨基酸被带负电荷氨基酸，例如天冬氨酸置换。[0100]图7是人λ轻链可变结构域v区和j区的生殖系比对。在一些实施方案中，抗原结合蛋白或抗体包含与人生殖系λ链可变区至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％相同的轻链可变区。[0101]cl结构域中的人生殖系λ链可变区的v区界面残基包括aho位置40(kabat32)、42(kabat34)、43(kabat35)、44(kabat36)、46(kabat38)、49(kabat41)、50(kabat42)、51(kabat43)、52(kabat44)、53(kabat45)、54(kabat46)、56(kabat48)、57(kabat49)、58(kabat50)、67(kabat51)、69(kabat53)、70(kabat54)、71(kabat55)、72(kabat56)、73(kabat57)、74(kabat58)、103(kabat85)、105(kabat87)、107(kabat89)、108(kabat90)和109(kabat91)。j区残基包括aho位置139和140。涵盖用带电荷氨基酸取代在这些位置处的一个或多个氨基酸。在优选实施方案中，一个或多个氨基酸被电荷与引入同源重链可变结构域中的带电荷氨基酸相反的带正电荷或带负电荷氨基酸取代。[0102]在一些实施方案中，λ可变区的aho位置51(kabat43)和/或aho位置141(kabat100)处的氨基酸被取代成带正电荷或带负电荷氨基酸。所述实施方案可还包括使aho位置46处的氨基酸被取代成带正电荷或带负电荷氨基酸。在一些实施方案中，aho位置51处的氨基酸被取代成带正电荷氨基酸，例如赖氨酸。在替代性实施方案中，aho位置51处的氨基酸被取代成带负电荷氨基酸，例如天冬氨酸。在一些实施方案中，aho位置141处的氨基酸被取代成带正电荷氨基酸，例如赖氨酸。在替代性实施方案中，aho位置141处的氨基酸被取代成带负电荷氨基酸，例如天冬氨酸。在一些实施方案中，aho位置51和aho位置141处的氨基酸被取代成带正电荷氨基酸(例如赖氨酸)或带负电荷氨基酸(例如天冬氨酸)。所述实施方案可还包括在aho位置46处取代成带正电荷或带负电荷氨基酸。[0103]任选的其它修饰[0104]本文所述的异二聚抗体的重链可还包含一个或多个影响含有重链的抗体结合一种或多种fc受体的突变。抗体的fc部分的一个功能在于当抗体结合它的靶标时与免疫系统通讯。这通常称为“效应物功能”。通讯会产生抗体依赖性细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬(adcp)和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)。adcc和adcp是通过fc与免疫系统的细胞的表面上的fc受体结合来介导。cdc是通过fc与补体系统的蛋白质(例如c1q)结合来介导。[0105]此外，本文所述的异二聚抗体可在恒定区中具有氨基酸修饰以改进抗体的效应物功能，包括半衰期或清除率、adcc和/或cdc活性。所述修饰可增强药物动力学或增强例如抗体的治疗有效性。参见shields等，j.biol.chem.，276(9)：6591‑6604(2001)，其以引用的方式整体并入本文。[0106]igg子类介导效应物功能的能力不同。举例来说，igg1在介导adcc和cdc方面优于igg2和igg4。可通过将一个或多个突变引入fc中来增加或降低抗体的效应物功能。本发明的实施方案包括具有被工程改造来增加效应物功能的fc的异二聚抗体(u.s.7,317,091以及strohl，curr.opin.biotech.，20：685‑691，2009；两者均以引用的方式整体并入本文)。效应物功能增加的示例性igg1fc分子包括具有一个或多个以下取代的那些[编号基于eu编号流程]：[0107]s239d/i332e[0108]s239d/a330s/i332e[0109]s239d/a330l/i332e[0110]s298a/d333a/k334a[0111]p247i/a339d[0112]p247i/a339q[0113]d280h/k290s[0114]d280h/k290s/s298d[0115]d280h/k290s/s298v[0116]f243l/r292p/y300l[0117]f243l/r292p/y300l/p396l[0118]f243l/r292p/y300l/v305i/p396l[0119]g236a/s239d/i332e[0120]k326a/e333a[0121]k326w/e333s[0122]k290e/s298g/t299a[0123]k290n/s298g/t299a[0124]k290e/s298g/t299a/k326e[0125]k290n/s298g/t299a/k326e[0126]k334v[0127]l235s+s239d+k334v[0128]q311m+k334v[0129]s239d+k334v[0130]f243v+k334v[0131]e294l+k334v[0132]s298t+k334v[0133]e233l+q311m+k334v[0134]l234i+q311m+k334v[0135]s298t+k334v[0136]a330m+k334v[0137]a330f+k334v[0138]q311m+a330m+k334v[0139]q311m+a330f+k334v[0140]s298t+a330m+k334v[0141]s298t+a330f+k334v[0142]s239d+a330m+k334v[0143]s239d+s298t+k334v[0144]l234y+k290y+y296w[0145]l234y+f243v+y296w[0146]l234y+e294l+y296w[0147]l234y+y296w[0148]k290y+y296w[0149]本发明的其它实施方案包括具有被工程改造来降低效应物功能的fc的异二聚抗体。效应物功能降低的示例性fc分子包括具有一个或多个以下取代的那些[编号基于eu编号流程]：[0150]n297a(igg1)[0151]l234a/l235a(igg1)[0152]v234a/g237a(igg2)[0153]l235a/g237a/e318a(igg4)[0154]h268q/v309l/a330s/a331s(igg2)[0155]c220s/c226s/c229s/p238s(igg1)[0156]c226s/c229s/e233p/l234v/l235a(igg1)[0157]l234f/l235e/p331s(igg1)[0158]s267e/l328f(igg1)[0159]增加含有iggfc的蛋白质的效应物功能的另一方法是通过降低fc的海藻糖基化。自连接于fc的双触角复合型寡糖移除核心海藻糖极大增加adcc效应物功能而不改变抗原结合或cdc效应物功能。已知用于降低或消除含有fc的分子(例如抗体)的海藻糖基化的若干方法。这些方法包括在某些哺乳动物细胞系中进行重组表达，所述细胞系包括fut8基因剔除细胞系、变异cho株系lec13、大鼠杂交瘤细胞系yb2/0、包含特异性针对fut8基因的小干扰rna的细胞系、以及共表达β‑1，4‑n‑乙酰基氨基葡萄糖转移酶iii和高尔基体β‑甘露糖苷酶ii的细胞系。或者，含有fc的分子可在非哺乳动物细胞，如植物细胞、酵母或原核细胞(例如大肠杆菌(e.coli))中表达。因此，在某些实施方案中，组合物包含海藻糖基化降低或完全缺乏海藻糖基化的抗体。[0160]预期基本上任何抗体可变结构域都可并入本文所述的异二聚抗体形式中。示例性抗体可变结构域(和它们特异性结合的抗原)包括但不限于以下中所述的那些：美国专利号7947809和美国专利申请公布号20090041784(升糖素(glucagon)受体)、美国专利号7939070、美国专利号7833527、美国专利号7767206和美国专利号7786284(il‑17受体a)、美国专利号7872106和美国专利号7592429(硬化蛋白)、美国专利号7871611、美国专利号7815907、美国专利号7037498、美国专利号7700742和美国专利申请公布号20100255538(igf‑1受体)、美国专利号7868140(b7rp1)、美国专利号7807159和美国专利申请公布号20110091455(肌抑素(myostatin))、美国专利号7736644、美国专利号7628986、美国专利号7524496和美国专利申请公布号20100111979(表皮生长因子受体的缺失突变体)、美国专利号7728110(sars冠状病毒)、美国专利号7718776和美国专利申请公布号20100209435(opgl)、美国专利号7658924和美国专利号7521053(促血管生成素‑2(angiopoietin‑2))、美国专利号7601818、美国专利号7795413、美国专利申请公布号20090155274、美国专利申请公布号20110040076(ngf)、美国专利号7579186(tgf‑βii型受体)、美国专利号7541438(结缔组织生长因子)、美国专利号7438910(il1‑r1)、美国专利号7423128(备解素(properdin))、美国专利号7411057、美国专利号7824679、美国专利号7109003、美国专利号6682736、美国专利号7132281和美国专利号7807797(ctla‑4)、美国专利号7084257、美国专利号7790859、美国专利号7335743、美国专利号7084257和美国专利申请公布号20110045537(干扰素‑γ)、美国专利号7932372(madcam)、美国专利号7906625、美国专利申请公布号20080292639和美国专利申请公布号20110044986(淀粉状蛋白(amyloid))、美国专利号7815907和美国专利号7700742(胰岛素样生长因子)、美国专利号7566772和美国专利号7964193(白介素‑1β(interleukin‑1β))、美国专利号7563442、美国专利号7288251、美国专利号7338660、美国专利号7626012、美国专利号7618633和美国专利申请公布号20100098694(cd40)、美国专利号7498420(c‑met)、美国专利号7326414、美国专利号7592430和美国专利号7728113(m‑csf)、美国专利号6924360、美国专利号7067131和美国专利号7090844(muc18)、美国专利号6235883、美国专利号7807798和美国专利申请公布号20100305307(表皮生长因子受体)、美国专利号6716587、美国专利号7872113、美国专利号7465450、美国专利号7186809、美国专利号7317090和美国专利号7638606(白介素‑4受体)、美国专利申请公布号20110135657(β‑klotho)、美国专利号7887799和美国专利号7879323(成纤维细胞生长因子样多肽)、美国专利号7867494(ige)、美国专利申请公布号20100254975(α‑4β‑7)、美国专利申请公布号20100197005和美国专利号7537762(活化素(activin)受体样激酶‑1)、美国专利号7585500和美国专利申请公布号20100047253(il‑13)、美国专利申请公布号20090263383和美国专利号7449555(cd148)、美国专利申请公布号20090234106(活化素a)、美国专利申请公布号20090226447(促血管生成素‑1和促血管生成素‑2)、美国专利申请公布号20090191212(促血管生成素‑2)、美国专利申请公布号20090155164(c‑fms)、美国专利号7537762(活化素受体样激酶‑1)、美国专利号7371381(甘丙肽(galanin))、美国专利申请公布号20070196376(胰岛素样生长因子)、美国专利号7267960和美国专利号7741115(ldcam)、us7265212(cd45rb)、美国专利号7709611、美国专利申请公布号20060127393和美国专利申请公布号20100040619(dkk1)、美国专利号7807795、美国专利申请公布号20030103978和美国专利号7923008(骨保护素(osteoprotegerin))、美国专利申请公布号20090208489(ov064)、美国专利申请公布号20080286284(psma)、美国专利号7888482、美国专利申请公布号20110165171和美国专利申请公布号20110059063(par2)、美国专利申请公布号20110150888(铁调素(hepcidin))、美国专利号7939640(b7l‑1)、美国专利号7915391(c‑kit)、美国专利号7807796、美国专利号7193058和美国专利号7427669(ulbp)、美国专利号7786271、美国专利号7304144和美国专利申请公布号20090238823(tslp)、美国专利号7767793(sigirr)、美国专利号7705130(her‑3)、美国专利号7704501(共济失调蛋白(ataxin)‑1样多肽)、美国专利号7695948和美国专利号7199224(tnf‑α转化酶)、美国专利申请公布号20090234106(活化素a)、美国专利申请公布号20090214559和美国专利号7438910(il1‑r1)、美国专利号7579186(tgf‑βii型受体)、美国专利号7569387(tnf受体样分子)、美国专利号7541438(结缔组织生长因子)、美国专利号7521048(trail受体‑2)、美国专利号6319499、美国专利号7081523和美国专利申请公布号20080182976(红血球生成素(erythropoietin)受体)、美国专利申请公布号20080166352和美国专利号7435796(b7rp1)、美国专利号7423128(备解素)、美国专利号7422742和美国专利号7141653(白介素‑5)、美国专利号6740522和美国专利号7411050(rankl)、美国专利号7378091(碳酸酐酶ix(caix)肿瘤抗原)、美国专利号7318925和美国专利号7288253(副甲状腺激素(parathyroidhormone))、美国专利号7285269(tnf)、美国专利号6692740和美国专利号7270817(acpl)、美国专利号7202343(单核细胞化学吸引蛋白质‑1)、美国专利号7144731(scf)、美国专利号6355779和美国专利号7138500(4‑1bb)、美国专利号7135174(pdgfd)、美国专利号6630143和美国专利号7045128(flt‑3配体)、美国专利号6849450(金属蛋白酶抑制剂)、美国专利号6596852(lerk‑5)、美国专利号6232447(lerk‑6)、美国专利号6500429(脑源性神经滋养因子)、美国专利号6184359(上皮源性t细胞因子)、美国专利号6143874(神经滋养因子nnt‑1)、美国专利申请公布号20110027287(原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶克欣蛋白酶9型(proproteinconvertasesubtilisinkexintype9，pcsk9))、美国专利申请公布号20110014201(il‑18受体)和美国专利申请公布号20090155164(c‑fms)。以上专利和公开的专利申请就它们公开可变结构域多肽、可变结构域编码核酸、宿主细胞、载体、制备编码所述可变结构域的多肽的方法、药物组合物、以及治疗与含有可变结构域的抗原结合蛋白或抗体的相应靶标相关的疾病的方法而言以引用的方式整体并入本文。[0161]抗体及其片段[0162]在一些实施方案中，本文所述的异二聚抗体包含如本文所述的抗硬化蛋白和抗dkk1抗体及其片段(例如包含介导与硬化蛋白的结合的重链和轻链以及介导与dkk1的结合的重链和轻链的异二聚抗体)。术语“抗体”是指完整抗体或其结合片段。抗体可包括完全抗体(免疫球蛋白)分子(包括具有全长重链和/或轻链的多克隆、单克隆、嵌合、人源化和/或人形式)，或包括其抗原结合片段。抗体片段包括f(ab')2、fab、fab'、fv、fc和fd片段，并且可并入单结构域抗体(例如纳米抗体)、单链抗体、大抗体、微抗体、内抗体、微型双功能抗体、微型三功能抗体、微型四功能抗体、v‑nar和双scfv(参见例如hollinger和hudson,naturebiotechnology,23(9):1126‑1136(2005))。抗体多肽，包括纤维结合蛋白多肽单域抗体，也公开于美国专利号6,703,199中。其它抗体多肽公开于美国专利公布号20050238646中。[0163]抗体片段可为合成或遗传工程改造蛋白质。举例来说，抗体片段包括由轻链可变区组成的分离的片段、由重链和轻链可变区组成的“fv”片段、以及轻链可变区与重链可变区是通过肽接头连接的重组单链多肽分子(scfv蛋白质)。[0164]抗体片段的另一形式是包含抗体的一个或多个互补决定区(cdr)的肽。如本文所用，术语“cdr”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的各可变区中存在三个cdr，其被指定为各可变区的cdr1、cdr2和cdr3。如本文所用的术语“cdr组”是指存在于单一可变区中的能够结合抗原的一组三个cdr。这些cdr的精确边界已根据不同系统加以不同界定。由kabat(kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987)和(1991))所述的系统不仅提供可适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且也提供界定三个cdr的准确残基边界。这些cdr可称为kabatcdr。chothia和同事(chothia和lesk,j.mol.biol.196:901‑917(1987)以及chothia等,nature342:877‑883(1989))发现尽管在氨基酸序列的层面上具有巨大多样性，但kabatcdr内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象。这些子部分指定为l1、l2和l3或h1、h2和h3，其中“l”和“h”分别指定轻链和重链区域。这些区域可称为chothiacdr，其具有与kabatcdr重叠的边界。界定与kabatcdr重叠的cdr的其它边界已由padlan(fasebj.9:133‑139(1995))和maccallum(jmolbiol262(5):73245(1996))描述。其它cdr边界定义可不严格遵循一种以上系统，但将仍然与kabatcdr重叠，尽管鉴于特定残基或残基组或甚至整个cdr不显著影响抗原结合的预测或实验研究结果，它们可能缩短或延长。本文所用的方法可利用根据任何这些系统确定的cdr，但优选实施方案使用kabat或chothia确定的cdr。[0165]cdr(也称为“最小识别单位”或“高变区”)是通过例如构建编码目标cdr的多核苷酸获得。所述多核苷酸是例如通过使用利用抗体产生细胞的mrna作为模板的聚合酶链反应以合成可变区来制备(参见例如larrick等,methods:acompaniontomethodsinenzymology,2:106(1991)；courtenay‑luck,“geneticmanipulationofmonoclonalantibodies”,monoclonalantibodiesproduction,engineeringandclinicalapplication,ritter等(编),第166页,cambridgeuniversitypress(1995)；以及ward等,“geneticmanipulationandexpressionofantibodies”,monoclonalantibodies:principlesandapplications,birch等,(编),第137页,wiley‑liss,inc.(1995))。[0166]本文所述的方法和抗体链适用于产生异二聚抗体。如本文所用的“特异性结合”是指抗原结合蛋白结合抗原优先于结合其它蛋白质。在一些实施方案中，“特异性结合”是指抗原结合蛋白对抗原的亲和力高于对其它蛋白质的亲和力。特异性结合抗原的抗原结合蛋白对抗原的结合亲和力可小于或等于1×10‑7m、小于或等于2×10‑7m、小于或等于3×10‑7m、小于或等于4×10‑7m、小于或等于5×10‑7m、小于或等于6×10‑7m、小于或等于7×10‑7m、小于或等于8×10‑7m、小于或等于9×10‑7m、小于或等于1×10‑8m、小于或等于2×10‑8m、小于或等于3×10‑8m、小于或等于4×10‑8m、小于或等于5×10‑8m、小于或等于6×10‑8m、小于或等于7×10‑8m、小于或等于8×10‑8m、小于或等于9×10‑8m、小于或等于1×10‑9m、小于或等于2×10‑9m、小于或等于3×10‑9m、小于或等于4×10‑9m、小于或等于5×10‑9m、小于或等于6×10‑9m、小于或等于7×10‑9m、小于或等于8×10‑9m、小于或等于9×10‑9m、小于或等于1×10‑10m、小于或等于2×10‑10m、小于或等于3×10‑10m、小于或等于4×10‑10m、小于或等于5×10‑10m、小于或等于6×10‑10m、小于或等于7×10‑10m、小于或等于8×10‑10m、小于或等于9×10‑10m、小于或等于1×10‑11m、小于或等于2×10‑11m、小于或等于3×10‑11m、小于或等于4×10‑11m、小于或等于5×10‑11m、小于或等于6×10‑11m、小于或等于7×10‑11m、小于或等于8×10‑11m、小于或等于9×10‑11m、小于或等于1×10‑12m、小于或等于2×10‑12m、小于或等于3×10‑12m、小于或等于4×10‑12m、小于或等于5×10‑12m、小于或等于6×10‑12m、小于或等于7×10‑12m、小于或等于8×10‑12m或小于或等于9×10‑12m。[0167]抗硬化蛋白抗体no:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72或seqidno:73中的一个或多个组成的肽(例如由seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5组成的肽或由seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72和seqidno:73组成的肽)。[0171]在一些或任何实施方案中，抗硬化蛋白抗体结合包含seqidno:1的氨基酸89‑103和137‑151的硬化蛋白多肽。[0172]在一些或任何实施方案中，抗硬化蛋白抗体结合具有氨基酸序列seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5的硬化蛋白多肽，其中seqidno:2与seqidno:4在参考seqidno:1的氨基酸位置57和111处通过二硫键接合，并且seqidno:3与seqidno:5通过以下至少一个接合：(a)在参考seqidno:1的氨基酸位置82和142处的二硫键，以及(b)在参考seqidno:1的氨基酸位置86和144处的二硫键；所述多肽可保留具有seqidno:1的人硬化蛋白的相应多肽区域的三级结构。或者或此外，抗硬化蛋白抗体结合具有氨基酸序列seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72和seqidno:73的多肽，其中seqidno:72与seqidno:73在参考seqidno:1的氨基酸位置57和111处通过二硫键接合，并且seqidno:70与seqidno:71通过以下至少一个接合：(a)在参考seqidno:1的氨基酸位置82和142处的二硫键，以及(b)在参考seqidno:1的氨基酸位置86和144处的二硫键。[0173]任选地，抗硬化蛋白抗体结合基本上由氨基酸序列seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5组成的肽，其中seqidno:2与seqidno:4在参考seqidno:1的氨基酸位置57和111处通过二硫键接合，并且seqidno:3与seqidno:5通过以下至少一个接合：(a)在参考seqidno:1的氨基酸位置82和142处的二硫键，以及(b)在参考seqidno:1的氨基酸位置86和144处的二硫键。[0174]任选地，抗硬化蛋白抗体结合基本上由seqidno:1的多截短人硬化蛋白蛋白质组成的多肽，其中(a)所述多肽无seqidno:1的氨基酸1‑50、65‑72、91‑100、118‑137和150‑190，或(b)所述多肽无seqidno:1的氨基酸1‑56、65‑72、87‑110、118‑137和145‑190。[0175]在一些或任何实施方案中，抗硬化蛋白抗体结合具有氨基酸序列seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72和seqidno:73的多肽，其中seqidno:72与seqidno:73在参考seqidno:1的氨基酸位置57和111处通过二硫键接合，并且seqidno:70与seqidno:71通过以下至少一个接合：(a)在参考seqidno:1的氨基酸位置82和142处的二硫键，以及(b)在参考seqidno:1的氨基酸位置86和144处的二硫键。[0176]在一些或任何实施方案中，硬化蛋白多肽保留具有seqidno:1的人硬化蛋白的相应多肽区域的三级结构。[0177]在一些或任何实施方案中，抗硬化蛋白抗体结合(i)人硬化蛋白的包含seqidno:1的氨基酸51‑64、73‑90、101‑117和138‑149的部分，其中所述部分具有以下至少一个、至少两个或全部三个：(a)氨基酸57与111之间的二硫键；(b)氨基酸82与142之间的二硫键；以及(c)氨基酸86与144之间的二硫键；或(ii)人硬化蛋白的包含seqidno:1的氨基酸57‑64、73‑86、111‑117和138‑144的部分，其中所述部分具有以下至少一个、至少两个或全部三个：(a)氨基酸57与111之间的二硫键；(b)氨基酸82与142之间的二硫键；以及(c)氨基酸86与144之间的二硫键。[0178]在一些或任何实施方案中，抗硬化蛋白抗体也结合具有seqidno:6的表位。[0179]用于产生本文所述的异二聚抗体的抗硬化蛋白抗体优选在美国专利公布号2007/0110747中所述的细胞基测定和/或美国专利公布号20070110747中所述的体内测定中调节硬化蛋白功能和/或结合美国专利公布号2007/0110747中所述的一种或多种表位和/或交叉阻断美国专利公布号2007/0110747中所述的一种抗体的结合和/或由美国专利公布号2007/0110747(以引用的方式整体且就它描述用于表征抗硬化蛋白抗体的测定而言并入本文)中所述的一种抗体交叉阻断结合硬化蛋白。[0180]在各个方面，当相较于每孔的硬化蛋白摩尔数，每孔存在小于6倍过量摩尔数的硬化蛋白结合位点时，抗硬化蛋白抗体也能够在mc3t3细胞基矿化测定中中和人硬化蛋白。通过培养物中的成骨细胞谱系细胞(初级细胞或细胞系)达成的矿化用作体外骨形成模型。一示例性细胞基矿化测定描述于美国专利公布号20070110747中例如实施例8处(据此以引用的方式并入)。mc3t3‑e1细胞(sudo等,j.cellbiol.,96:191‑198(1983))和原始细胞系的亚克隆可在分化剂存在下生长后在培养物中形成矿物质。所述亚克隆包括mc3t3‑e1‑bf(smith等,j.biol.chem.,275:19992‑20001(2000))。对于mc3t3‑e1‑bf亚克隆以及原始mc3t3‑e1细胞两者，硬化蛋白可抑制导致且包括矿物质沉积的一系列事件中的一个或多个(即硬化蛋白抑制矿化)。能够中和硬化蛋白的抑制活性的抗硬化蛋白抗体允许培养物在硬化蛋白存在下矿化，以使相较于在仅有硬化蛋白(即无抗体)治疗组中测量的钙量，例如磷酸钙(测量为钙)沉积存在统计显著增加。[0181]当以确定特定抗硬化蛋白抗体(或其它硬化蛋白抑制剂)是否可中和硬化蛋白为目标进行测定时，测定中所用的硬化蛋白的量合乎需要地是相较于在无硬化蛋白组中测量的钙量，在仅有硬化蛋白组中导致磷酸钙(测量为钙)沉积统计显著降低至少70％的硬化蛋白的最小量。抗硬化蛋白中和抗体定义为相较于在仅有硬化蛋白(即无抗体)治疗组中测量的钙量，导致磷酸钙(测量为钙)沉积统计显著增加的抗体。为确定抗硬化蛋白抗体是否具有中和性，测定中使用的抗硬化蛋白抗体的量需要使相较于每孔的硬化蛋白摩尔数，每孔存在过量摩尔数的硬化蛋白结合位点。视抗体的效能而定，可能需要的过量倍数可为24、18、12、6、3或1.5，并且本领域技术人员熟悉测试一个以上浓度的结合剂(抗体)的常规规范。举例来说，当相较于每孔的硬化蛋白摩尔数，每孔存在小于6倍过量摩尔数的硬化蛋白结合位点时，极强力抗硬化蛋白中和抗体将中和硬化蛋白。次强力抗硬化蛋白中和抗体将仅在12、18或24倍过量下中和硬化蛋白。[0182]在细胞基测定，如骨特异性碱性磷酸酶测定，例如国际专利公布号wo2008/115732和美国专利号7,744,874(就它描述细胞基测定和抗硬化蛋白抗体而言以引用的方式整体并入本文)中所述的骨特异性碱性磷酸酶测定中，抗硬化蛋白抗体中和人硬化蛋白的ic50任选是100nm或100nm以下、或75nm或75nm以下、或50nm或50nm以下、或25nm或25nm以下。骨特异性碱性磷酸酶测定基于硬化蛋白能够降低多潜力鼠类细胞系c2c12中bmp‑4和wnt3a刺激的碱性磷酸酶水平。根据wo2008/115732，中和抗硬化蛋白抗体在这个测定中介导碱性磷酸酶活性的剂量依赖性增加。[0183]或者或此外，在hek293细胞系中，在细胞基wnt信号传导测定，如描述于例如国际专利公布号wo2009/047356(就它论述抗硬化蛋白抗体和细胞基测定而言以引用的方式并入本文)中的涉及wnt1介导的stf报道体基因诱导的wnt测定中，抗硬化蛋白抗体中和人硬化蛋白的ic50是100nm或100nm以下(例如75nm或75nm以下、或50nm或50nm以下)。或者或此外，在mc3t3细胞中，在bmp2诱导的矿化测定，如描述于例如国际专利公布号wo2009/047356中的矿化测定中，抗硬化蛋白抗体中和人硬化蛋白的ic50是500nm或500nm以下(例如250nm或250nm以下、150nm或150nm以下、100nm或100nm以下、或50nm或50nm以下)。[0184]适用于本发明的情形下的抗硬化蛋白抗体的实例描述于国际专利公布号2007/0110747和2007/0072797中，所述公布据此以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，抗硬化蛋白抗体交叉阻断以下至少一个结合硬化蛋白：抗体ab‑a、ab‑b、ab‑c、ab‑d、ab‑1、ab‑2、ab‑3、ab‑4、ab‑5、ab‑6、ab‑7、ab‑8、ab‑9、ab‑10、ab‑11、ab‑12、ab‑13、ab‑14、ab‑15、ab‑16、ab‑17、ab‑18、ab‑19、ab‑20、ab‑21、ab‑22、ab‑23和ab‑24(其全部描述于美国专利公布号20070110747中)。或者或此外，抗硬化蛋白抗体由以下至少一个交叉阻断结合硬化蛋白：抗体ab‑a、ab‑b、ab‑c、ab‑d、ab‑1、ab‑2、ab‑3、ab‑4、ab‑5、ab‑6、ab‑7、ab‑8、ab‑9、ab‑10、ab‑11、ab‑12、ab‑13、ab‑14、ab‑15、ab‑16、ab‑17、ab‑18、ab‑19、ab‑20、ab‑21、ab‑22、ab‑23和ab‑24(其全部描述于美国专利公布号20070110747中)。术语“交叉阻断(cross‑block/cross‑blocked/cross‑blocking)”在本文中可互换使用来指抗体干扰其它抗体结合硬化蛋白的能力。抗体能够干扰另一抗体结合硬化蛋白的程度，并且因此是否可称它交叉阻断可使用竞争结合测定来确定。在本发明的一些方面，交叉阻断抗体或其片段使参考抗体的硬化蛋白结合降低在约40％与约100％，如约60％与约100％之间、具体来说在70％与100％之间、且更具体来说在80％与100％之间。检测交叉阻断的一特别适合定量测定使用利用表面等离子体共振技术测量相互作用程度的biacore机器。另一适合定量交叉阻断测定使用elisa基方法来测量抗体之间就它们结合硬化蛋白而言的竞争。[0185]在一些实施方案中，抗硬化蛋白抗体交叉阻断包含全长重链和轻链的免疫球蛋白结合具有seqidno:1的硬化蛋白和/或由包含全长重链和轻链的免疫球蛋白交叉阻断结合具有seqidno:1的硬化蛋白，其中包含全长重链和轻链的所述免疫球蛋白包含本文公开的cdr序列，如以下三组cdr序列中的一组：a)cdr‑l1seqidno:284、cdr‑l2seqidno:285、cdr‑l3seqidno:286、cdr‑h1seqidno:296、cdr‑h2seqidno:297和cdr‑h3seqidno:298；b)cdr‑l1seqidno:48、cdr‑l2seqidno:49、cdr‑l3seqidno:50、cdr‑h1seqidno:45、cdr‑h2seqidno:46和cdr‑h3seqidno:47；或c)cdr‑l1seqidno:42、cdr‑l2seqidno:43、cdr‑l3seqidno:44、cdr‑h1seqidno:39、cdr‑h2seqidno:40和cdr‑h3seqidno:41。或者或此外，抗硬化蛋白抗体交叉阻断包含全长重链和轻链的免疫球蛋白结合具有seqidno:1的硬化蛋白和/或由包含全长重链和轻链的免疫球蛋白交叉阻断结合具有seqidno:1的硬化蛋白，其中包含全长重链和轻链的所述免疫球蛋白包含以下cdr：cdr‑h1seqidno:245、cdr‑h2seqidno:246、cdr‑h3seqidno:247、cdr‑l1seqidno:78、cdr‑l2seqidno:79和cdr‑l3seqidno:80。[0186]或者或此外，抗硬化蛋白抗体交叉阻断包含全长重链和轻链的免疫球蛋白结合具有seqidno:1的硬化蛋白和/或由包含全长重链和轻链的免疫球蛋白交叉阻断结合具有seqidno:1的硬化蛋白，其中包含全长重链和轻链的所述免疫球蛋白包含以下cdr：cdr‑h1seqidno:269、cdr‑h2seqidno:270、cdr‑h3seqidno:271、cdr‑l1seqidno:239、cdr‑l2seqidno:240和cdr‑l3seqidno:241。[0187]适合抗硬化蛋白抗体及其片段的实例包括具有以下一个或多个的抗体和抗体片idno:247中给出的序列，cdr‑l1具有seqidno:78中给出的序列，cdr‑l2具有seqidno:79中给出的序列，并且cdr‑l3具有seqidno:80中给出的序列，其全部提供于序列表中以及描述于美国专利公布号20070110747中。在各个方面，抗硬化蛋白抗体包含两个cdr或六个cdr。任选地，抗硬化蛋白抗体包含含有seqidno:378的重链(例如两个重链)的全部或一部分和含有seqidno:376的轻链(例如两个轻链)的全部或一部分。[0190]抗硬化蛋白抗体可包含至少一个与选自以下的cdr具有至少75％同一性(例如100％同一性)的cdr序列：cdr‑h1、cdr‑h2、cdr‑h3、cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3，其中cdr‑h1具有seqidno:269中给出的序列，cdr‑h2具有seqidno:270中给出的序列，cdr‑h3具有seqidno:271中给出的序列，cdr‑l1具有seqidno:239中给出的序列，cdr‑l2具有seqidno:240中给出的序列，并且cdr‑l3具有seqidno:241中给出的序列，其全部提供于序列表中以及描述于美国专利公布号20070110747中。在各个方面，抗硬化蛋白抗体包含至少两个cdr或六个cdr。任选地，抗硬化蛋白抗体包含含有seqidno:366的重链(例如两个重链)的全部或一部分和含有seqidno:364的轻链(例如两个轻链)的全部或一部分。[0191]或者，抗硬化蛋白抗体可具有重链，所述重链包含cdr的h1、h2和h3，并且包含具有seqidno:137、145或392中提供的序列的多肽或其变体，其中cdr分别与seqidno:245、246和247至少75％相同(例如100％相同)；和轻链，所述轻链包含cdr的l1、l2和l3，并且包含具有seqidno:133或141中提供的序列的多肽或其变体，其中cdr分别与seqidno:78、79和80至少75％相同(例如100％相同)(如美国专利公布号2007/0110747中所述)。[0192]抗硬化蛋白抗体可具有重链，所述重链包含cdr的h1、h2和h3，并且包含具有seqidno:335、331、345或396中提供的序列的多肽或任何上述物的变体，其中cdr分别与seqidno:269、270和271至少75％相同(例如100％相同)；和轻链，所述轻链包含cdr的l1、l2和l3，并且包含具有seqidno:334或341中提供的序列的多肽或任何上述物的变体，其中cdr分别与seqidno:239、240和241至少75％相同(例如100％相同)(如美国专利公布号20070110747中所述)。涵盖重链和轻链序列的所有组合(例如包含seqidno:335的重链和包含seqidno:334的轻链；包含seqidno:331的重链和包含seqidno:334的轻链；以及包含seqidno:345或396的重链和包含seqidno:341的轻链)。[0193]或者，抗硬化蛋白抗体具有包含具有seqidno:137中提供的序列的多肽的重链、和包含具有seqidno:133中提供的序列的多肽的轻链；包含具有seqidno:145或392中提供的序列的多肽的重链、和包含具有seqidno:141中提供的序列的多肽的轻链；包含具有seqidno:335中提供的序列的多肽的重链、和包含具有seqidno:334中提供的序列的多肽的轻链；包含具有seqidno:331中提供的序列的多肽的重链、和包含具有seqidno:341中提供的序列的多肽的轻链；或包含具有seqidno:345或396中提供的序列的多肽的重链、和包含具有seqidno:341中提供的序列的多肽的轻链(如美国专利公布号2007/0110747中所述)。或者，抗硬化蛋白抗体交叉阻断针对硬化蛋白的任何以上提及的抗体(或由针对硬化蛋白的任何以上提及的抗体交叉阻断)。[0194]在一些实施方案中，抗硬化蛋白抗体包含含有选自由seqidno:1038、seqidno:1046、seqidno:1040和seqidno:1048组成的组的氨基酸序列的重链；任选还包含选自由seqidno:1039、seqidno:1047、seqidno:1041和seqidno:1049组成的组的轻链氨基酸序列。[0195]抗硬化蛋白抗体的实例也包括但不限于国际专利公布号wo2008/092894、wo2008/115732、wo2009/056634、wo2009/047356、wo2010/100200、wo2010/100179、wo2010/115932和wo2010/130830(其各自以引用的方式整体并入本文)中公开的抗硬化蛋白抗体，如国际专利公布号wo2008/115732的包含cdrseqidno:20‑25(在本文中是seqidno:416‑421)的抗硬化蛋白抗体、国际专利公布号wo2008/115732的包含cdrseqidno:26‑31(在本文中是seqidno:422‑427)的抗硬化蛋白抗体、国际专利公布号wo2008/115732的包含cdrseqidno:32‑37(在本文中是seqidno:428‑433)的抗硬化蛋白抗体、国际专利公布号wo2009/047356的包含cdrseqidno:4、15、26、37、48和59(在本文中分别是seqidno:443、454、465、476、487和498)的抗硬化蛋白抗体、或国际专利公布号wo2010/130830的包含氨基酸序列seqidno:135‑143、153‑161或171‑179(在本文中分别是seqidno:745‑753、763‑771、781‑789)中的至少一个的抗硬化蛋白抗体。[0196]抗dkk1抗体[0197]在一些实施方案中，本文所述的异二聚抗体包含包括抗dkk1抗体的dkk1结合部分。“抗dkk1抗体”结合dkk1或其部分以阻断或损害人dkk1结合一种或多种配体。人dkk1多核苷酸和氨基酸序列分别阐述于seqidno:810和811中。小鼠和大鼠dkk1的多核苷酸和氨基酸序列阐述于seqidno:812和813(小鼠)以及seqidno:814和815(大鼠)中。适用于本发明的情形下的抗dkk1抗体的实例描述于国际公布号wo2012/118903中，所述公布的公开内容以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，抗dkk1抗体交叉阻断以下至少一个结合dkk1或与以下至少一个竞争结合dkk1：抗体11h10hu、11h10rat、2.4.1、2.20.1、2.37.1、2.40.1、2.41.1、2.47.1、5.17.1、5.23.1、5.25.1、5.31.1、5.32.1、5.40.1、5.65.1、5.76.1、5.77.1、5.78.1、5.80.1、5.85.1、6.37.5、6.116.6、6.139.5和6.147.4(其全部描述于国际公布号wo2012/118903中)。或者或此外，抗dkk1抗体由以下至少一个交叉阻断结合dkk1：抗体11h10hu、11h10rat、2.4.1、2.20.1、2.37.1、2.40.1、2.41.1、2.47.1、5.17.1、5.23.1、5.25.1、5.31.1、5.32.1、5.40.1、5.65.1、5.76.1、5.77.1、5.78.1、5.80.1、5.85.1、6.37.5、6.116.6、6.139.5和6.147.4。术语“交叉阻断(cross‑block/cross‑blocked/cross‑blocking)”在本文中可互换使用来指抗体干扰其它抗体结合dkk1的能力。抗体能够干扰另一抗体结合dkk1的程度，并且因此是否可称它交叉阻断可使用竞争结合测定来确定。在一些方面，交叉阻断抗体或其片段使参考抗体的dkk1结合降低在约40％与约100％，如约60％与约100％之间、或在70％与100％之间、或在80％与100％之间。检测交叉阻断的一特别适合定量测定使用利用表面等离子体共振技术测量相互作用程度的biacore机器。另一适合定量交叉阻断测定使用elisa基方法来测量抗体之间就它们结合dkk1而言的竞争。[0198]在一些实施方案中，抗dkk1抗体交叉阻断包含全长重链和轻链的免疫球蛋白结合具有seqidno:811的dkk1和/或由包含全长重链和轻链的免疫球蛋白交叉阻断结合具有seqidno:811的dkk1，其中包含全长重链和轻链的所述免疫球蛋白包含本文公开的cdr序列，如以下三组cdr序列中的一组：seqidno:820‑822、828‑830、836‑838、844‑846、852‑854、860‑862、868‑869、876‑878、884‑886、892‑894、900‑902、908‑910、916‑918、924‑926、932‑934、940‑942、948‑950、956‑958、964‑966、972‑974、980‑982、988‑990、996‑998、1004‑1006、823‑825、831‑833、839‑841、847‑849、855‑857、863‑865、871‑873、879‑881、887‑889、897‑897、903‑905、911‑913、919‑921、927‑929、935‑937、943‑945、951‑953、959‑961、967‑969、975‑977、983‑985、991‑993、999‑1001和1007‑1009。[0199]适合抗dkk1抗体及其片段的实例包括具有以下一个或多个的抗体和抗体片段：本文明确公开以及国际公布号wo2012/118903中公开的cdr‑h1、cdr‑h2、cdr‑h3、cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3，所述公布以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，cdr‑h1、cdr‑h2、cdr‑h3、cdr‑l1、cdr‑l2和cdr‑l3的区域中的至少一个可具有至少一个氨基酸取代，前提是抗体保留非取代的cdr的结合特异性。示例性抗dkk1抗体包括但不限于抗体11h10hu、11h10rat、2.4.1、2.20.1、2.37.1、2.40.1、2.41.1、2.47.1、5.17.1、5.23.1、5.25.1、5.31.1、5.32.1、5.40.1、5.65.1、5.76.1、5.77.1、5.78.1、5.80.1、5.85.1、6.37.5、6.116.6、6.139.5和6.147.4(其全部描述于国际公布号wo2012/118903中)。[0200]在一些实施方案中，抗dkk1抗体包含至少一个与选自由以下组成的组的cdr具有至少75％同一性(例如至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少100％同一性)的cdr：820‑822(ab11h10hu的cdrl1‑l3)、828‑830(ab11h10rat的cdrl1‑cdrl3)、836‑838(ab2.4.1的cdrl1‑cdrl3)、844‑846(ab2.20.1的cdrl1‑cdrl3)、852‑854(ab2.37.1的cdrl1‑cdrl3)、860‑862(ab2.40.1的cdrl1‑cdrl3)、868‑869(ab2.41.1的cdrl1‑cdrl3)、876‑878(ab2.47.1的cdrl1‑cdrl3)、884‑886(ab5.17.1的cdrl1‑cdrl3)、892‑894(ab5.23.1的cdrl1‑cdrl3)、900‑902(ab5.25.1的cdrl1‑cdrl3)、908‑910(ab5.31.1的cdrl1‑cdrl3)、916‑918(ab5.32.1的cdrl1‑cdrl3)、925‑927(ab5.40.1的cdrl1‑cdrl3)、932‑934(ab5.65.1的cdrl1‑cdrl3)、940‑942(ab5.76.1的cdrl1‑cdrl3)、948‑950(ab5.77.1的cdrl1‑cdrl3)、956‑958(ab5.78.1的cdrl1‑cdrl3)、964‑966(ab5.80.1的cdrl1‑cdrl3)、972‑974(ab5.85.1的cdrl1‑cdrl3)、980‑982(ab6.37.5的cdrl1‑cdrl3)、988‑990(ab6.116.6的cdrl1‑cdrl3)、996‑998(ab6.139.5的cdrl1‑cdrl3)、1004‑1006(ab6.147.4的cdrl1‑cdrl3)、823‑825(ab11h10hu的cdrh1‑cdrh3)、831‑833(ab11h10rat的cdrh1‑cdrh3)、839‑841(ab2.4.1的cdrh1‑cdrh3)、847‑849(ab2.20.1的cdrh1‑cdrh3)、855‑857(ab2.37.1的cdrh1‑cdrh3)、863‑865(ab2.40.1的cdrh1‑cdrh3)、871‑873(ab2.41.1的cdrh1‑cdrh3)、879‑881(ab2.47.1的cdrh1‑cdrh3)、887‑889(ab5.17.1的cdrh1‑cdrh3)、895‑897(ab5.23.1的cdrh1‑cdrh3)、903‑905(ab5.25.1的cdrh1‑cdrh3)、911‑913(ab531.1的cdrh1‑cdrh3)、919‑921(ab5.32.1的cdrh1‑cdrh3)、927‑929(ab5.40.1的cdrh1‑cdrh3)、935‑937(ab5.65.1的cdrh1‑cdrh3)、943‑945(ab5.76.1的cdrh1‑cdrh3)、951‑953(ab5.77.1的cdrh1‑cdrh3)、959‑961(ab5.78.1的cdrh1‑cdrh3)、967‑969(ab5.80.1的cdrh1‑cdrh3)、975‑977(ab5.85.1的cdrh1‑cdrh3)、983‑985(ab6.37.5的cdrh1‑cdrh3)、991‑993(ab6.116.6的cdrh1‑cdrh3)、999‑1001(ab6.139.5的cdrh1‑cdrh3)和1007‑1009(ab6.147.4的cdrh1‑cdrh3)。[0201]在一些实施方案中，抗dkk1抗体包含与选自由以下组成的组的抗dkk1重链可变结构域氨基酸序列具有至少75％同一性(例如至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少100％同一性)的重链可变结构域氨基酸序列：seqidno:819、827、835、843、851、859、867、875、883、891、899、907、915、923、931、939、947、955、963、971、979、987、995和1003。在一些实施方案中，抗dkk1抗体包含与选自由以下组成的组的抗dkk1轻链可变结构域氨基酸序列具有至少75％同一性(例如至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少100％同一性)的轻链可变结构域氨基酸序列：seqidno:818、826、834、842、850、866、874、882、890、898、906、814、822、830、938、946、954、962、970、978、988、994和1002。[0202]在一些实施方案中，异二聚抗体的dkk1结合组分包含于各seqidno:中阐述的以下cdr中的一个、两个、三个、四个、五个或六个：820‑822(ab11h10hu的cdrl1‑l3)、828‑830(ab11h10rat的cdrl1‑cdrl3)、836‑838(ab2.4.1的cdrl1‑cdrl3)、844‑846(ab2.20.1的cdrl1‑cdrl3)、852‑854(ab2.37.1的cdrl1‑cdrl3)、860‑862(ab2.40.1的cdrl1‑cdrl3)、868‑869(ab2.41.1的cdrl1‑cdrl3)、876‑878(ab2.47.1的cdrl1‑cdrl3)、884‑886(ab5.17.1的cdrl1‑cdrl3)、892‑894(ab5.23.1的cdrl1‑cdrl3)、900‑902(ab5.25.1的cdrl1‑cdrl3)、908‑910(ab5.31.1的cdrl1‑cdrl3)、916‑918(ab5.32.1的cdrl1‑cdrl3)、925‑927(ab5.40.1的cdrl1‑cdrl3)、932‑934(ab5.65.1的cdrl1‑cdrl3)、940‑942(ab5.76.1的cdrl1‑cdrl3)、948‑950(ab5.77.1的cdrl1‑cdrl3)、956‑958(ab5.78.1的cdrl1‑cdrl3)、964‑966(ab5.80.1的cdrl1‑cdrl3)、972‑974(ab5.85.1的cdrl1‑cdrl3)、980‑982(ab6.37.5的cdrl1‑cdrl3)、988‑990(ab6.116.6的cdrl1‑cdrl3)、996‑998(ab6.139.5的cdrl1‑cdrl3)、1004‑1006(ab6.147.4的cdrl1‑cdrl3)、823‑825(ab11h10hu的cdrh1‑cdrh3)、831‑833(ab11h10rat的cdrh1‑cdrh3)、839‑841(ab2.4.1的cdrh1‑cdrh3)、847‑849(ab2.20.1的cdrh1‑cdrh3)、855‑857(ab2.37.1的cdrh1‑cdrh3)、863‑865(ab2.40.1的cdrh1‑cdrh3)、871‑873(ab2.41.1的cdrh1‑cdrh3)、879‑881(ab2.47.1的cdrh1‑cdrh3)、887‑889(ab5.17.1的cdrh1‑cdrh3)、895‑897(ab5.23.1的cdrh1‑cdrh3)、903‑905(ab5.25.1的cdrh1‑cdrh3)、911‑913(ab531.1的cdrh1‑cdrh3)、919‑921(ab5.32.1的cdrh1‑cdrh3)、927‑929(ab5.40.1的cdrh1‑cdrh3)、935‑937(ab5.65.1的cdrh1‑cdrh3)、943‑945(ab5.76.1的cdrh1‑cdrh3)、951‑953(ab5.77.1的cdrh1‑cdrh3)、959‑961(ab5.78.1的cdrh1‑cdrh3)、967‑969(ab5.80.1的cdrh1‑cdrh3)、975‑977(ab5.85.1的cdrh1‑cdrh3)、983‑985(ab6.37.5的cdrh1‑cdrh3)、991‑993(ab6.116.6的cdrh1‑cdrh3)、999‑1001(ab6.139.5的cdrh1‑cdrh3)和1007‑1009(ab6.147.4的cdrh1‑cdrh3)。预期异二聚抗体可包括来自单一抗体的两个或更多个cdr、或来自本文所述的dkk1抗体的任何组合的两个或更多个cdr。一些dkk1结合组分包括轻链cdr3与重链cdr3两者。某些dkk1结合组分具有seqidno:820‑822、828‑830、836‑838、844‑846、852‑854、860‑862、868‑869、876‑878、884‑886、892‑894、900‑902、908‑910、916‑918、925‑927、932‑934、940‑942、948‑950、956‑958、964‑966、972‑974、980‑982、988‑990、996‑998、1004‑1006、823‑825、831‑833、839‑841、847‑849、855‑857、863‑865、871‑873、879‑881、887‑889、897‑897、903‑905、911‑913、919‑921、927‑929、935‑937、943‑945、951‑953、959‑961、967‑969、975‑977、983‑985、991‑993、999‑1001和1007‑1009中阐述的cdr的变异形式，其中一个或多个(即2、3、4、5或6个)cdr各自与seqidno:820‑822、828‑830、836‑838、844‑846、852‑854、860‑862、868‑869、876‑878、884‑886、892‑894、900‑902、908‑910、916‑918、925‑927、932‑934、940‑942、948‑950、956‑958、964‑966、972‑974、980‑982、988‑990、996‑998、1004‑1006、823‑825、831‑833、839‑841、847‑849、855‑857、863‑865、871‑873、879‑881、887‑889、897‑897、903‑905、911‑913、919‑921、927‑929、935‑937、943‑945、951‑953、959‑961、967‑969、975‑977、983‑985、991‑993、999‑1001和1007‑1009中阐述的cdr序列具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性。举例来说，异二聚抗体的dkk1结合组分可包括轻链cdr3与重链cdr3两者，其各自与选自由seqidno:822、830、838、846、854、862、870、878、886、894、springharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,第9和11章；和currentprotocolsinmolecularbiology,1995,ausubel等编,johnwiley&sons,inc.,第2.10和6.3‑6.4章节)所阐述，并且可易于由本领域普通技术人员基于例如dna的长度和/或碱基组成加以确定。一种达成中等严格条件的方法涉及使用含有5×ssc、0.5％sds、1.0mmedta(ph8.0)的预洗涤溶液；具有约50％甲酰胺、6×ssc的杂交缓冲液；和杂交温度约55℃(或其它类似杂交溶液，如含有约50％甲酰胺的杂交溶液，其中杂交温度是约42℃)，以及于0.5×ssc、0.1％sds中进行约60℃的洗涤条件。通常，高度严格条件定义为如上杂交条件，但在约68℃下于0.2×ssc、0.1％sds中进行洗涤。在杂交和洗涤缓冲液中，sspe(1×sspe为0.15mnacl、10mmnah2po4和1.25mmedta，ph7.4)可被替换成ssc(1×ssc是0.15mnacl和15mm柠檬酸钠)；在杂交完成之后进行洗涤15分钟。应了解必要时可通过应用如本领域技术人员已知，并且以下进一步所述的支配杂交反应和双链体稳定性的基本原则调整洗涤温度和洗涤盐浓度以达成所需严格程度(参见例如sambrook等,1989)。当使核酸杂交于序列未知的靶标核酸时，杂交物长度假定是杂交核酸的长度。当杂交序列已知的核酸时，杂交物长度可通过比对核酸序列和鉴定具有最优序列互补性的一个或多个区域来确定。预期长度小于50个碱基对的杂交物的杂交温度应比杂交物的熔融温度(tm)小5至10.℃，其中tm是根据以下等式确定。对于长度小于18个碱基对的杂交物，tm(℃)＝2(a+t碱基数)+4(g+c碱基数)。对于长度大于18个碱基对的杂交物，tm(℃)＝81.5+16.6(log10[na+])+0.41(g+c％)‑(600/n)，其中n是杂交物中的碱基数，并且([na+]是杂交缓冲液中的钠离子浓度(1×ssc的[na+]＝0.165m)。优选地，各所述杂交核酸的长度是至少15个核苷酸(或更优选至少18个核苷酸、或至少20个核苷酸、或至少25个核苷酸、或至少30个核苷酸、或至少40个核苷酸、或最优选至少50个核苷酸)，或是它与之杂交的本发明核酸的长度的至少25％(更优选至少50％、或至少60％、或至少70％，并且最优选至少80％)，并且与它与之杂交的本发明核酸的序列同一性是至少60％(更优选至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，并且最优选至少99.5％)，其中序列同一性是通过在对准以使重叠和同一性最大，同时使如上更详细所述的序列间隙最小时比较杂交核酸的序列来确定。[0210]变体通常通过以下方式来制备：使用盒式或pcr突变诱发或本领域中熟知的其它技术，使编码多肽的dna中的核苷酸经受位点特异性突变诱发以产生编码变体的dna，以及此后在如本文概述的细胞培养物中表达重组dna。然而，可通过使用确定技术进行体外合成来制备包含变异cdr的具有多达约100‑150个残基的抗体或抗体片段。变体通常展现与天然存在的类似物相同的定性生物活性，例如结合抗原，但也可选择具有改进特征的变体，如将在本文中更充分概述。[0211]如本领域技术人员将了解，归因于遗传密码的简并性，可制备极大数目的都编码本发明的cdr(和本文所述的异二聚抗体的重链和轻链或其它组分)的核酸。因此，在已鉴定特定氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可通过以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式，仅修改一个或多个密码子的序列来制备许多不同核酸。[0212]本发明也提供呈质粒、表达载体、转录或表达盒形式的包含至少一种如上多核苷酸的表达系统和构建体。此外，本发明提供包含所述表达系统或构建体的宿主细胞。[0213]通常，用于宿主细胞中的表达载体将含有用于质粒维持和外源性核苷酸序列的克隆和表达的序列。在某些实施方案中总称为“侧接序列”的所述序列将通常包括以下核苷酸序列中的一个或多个：启动子、一种或多种增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和接受体拼接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入待表达的编码多肽的核酸的多接头区域、以及可选择标记元件。以下论述这些序列中的各个。[0214]任选地，载体可含有“标签”编码序列，即位于多肽编码序列的5'或3'末端的寡核苷酸分子；寡核苷酸序列编码多聚his(如六his)或可商购抗体存在的另一“标签”，如flag、ha(血球凝集素流感病毒(hemaglutinininfluenzavirus))或myc。这个标签通常在多肽表达后融合于多肽，并且可充当一种自宿主细胞亲和纯化或检测多肽的手段。亲和纯化可例如通过使用针对标签的抗体作为亲和基质进行柱色谱来达成。任选地，可随后通过各种手段，如使用用于裂解的某些肽酶自纯化多肽移除标签。[0215]侧接序列可为同源的(即来自与宿主细胞相同的物种和/或品系)、异源的(即来自除宿主细胞物种或品系以外的物种)、杂交的(即来自一种以上来源的侧接序列的组合)、合成的或天然的。因此，侧接序列的来源可为任何原核或真核生物体、任何脊椎动物或无脊椎动物生物体、或任何植物，前提是侧接序列在宿主细胞机构中具有功能性，并且可通过宿主细胞机构活化。[0216]适用于本发明的载体中的侧接序列可通过本领域中熟知的若干方法中的任一个获得。通常，适用于本文中的侧接序列将已先前通过图谱分析和/或通过限制核酸内切酶消化鉴定，并且因此可使用适当限制核酸内切酶自适当组织来源分离。在一些情况下，侧接序列的完整核苷酸序列可为已知的。在本文中，可使用本文对于核酸合成或克隆所述的方法合成侧接序列。[0217]无论已知全部或仅一部分侧接序列，它都可使用聚合酶链反应(pcr)和/或通过用适合探针，如来自相同或另一物种的寡核苷酸和/或侧接序列片段筛选基因组文库来获得。当侧接序列未知时，含有侧接序列的dna片段可自一段可含有例如编码序列或甚至另外一种或多种基因的较大dna分离。分离可通过以下方式达成：限制核酸内切酶消化以产生适当dna片段，随后使用琼脂糖凝胶纯化柱色谱(chatsworth,ca)或熟练技术人员已知的其它方法进行分离。对用以达成这个目的的适合酶的选择将易于为本领域普通技术人员所显而易知。[0218]复制起点通常是那些商购原核表达载体的一部分，并且起点有助于在宿主细胞中扩增载体。如果所选载体不含有复制起点位点，那么可基于已知序列化学合成复制起点位点，并且连接至载体中。举例来说，来自质粒pbr322(newenglandbiolabs,beverly,ma)的复制起点适于大多数革兰氏阴性细菌，并且各种病毒起点(例如sv40、多瘤、腺病毒、水泡性口炎病毒(vsv)或如hpv或bpv的乳头状瘤病毒)适用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，复制起点组分不为哺乳动物表达载体所需(例如仅因为sv40起点也含有病毒早期启动子而常使用它)。[0219]转录终止序列通常位于多肽编码区的末端的3'，并且用于终止转录。通常，原核细胞中的转录终止序列是g‑c富集片段，继之以多聚t序列。尽管序列易于自文库克隆或甚至作为载体的一部分商购，但它也可易于使用用于核酸合成的方法(如本文所述的那些)合成。[0220]可选择标记基因编码为在选择性培养基中生长的宿主细胞的存活和生长所必需的蛋白质。典型选择标记基因编码(a)赋予原核宿主细胞对抗生素或其它毒素，例如胺苄青霉素(ampicillin)、四环素(tetracycline)或卡那霉素(kanamycin)的抗性；(b)弥补细胞的营养缺陷不足；或(c)供应不可自复合或成分确定培养基获得的关键养分的蛋白质。特定可选择标记是卡那霉素抗性基因、胺苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。有利的是，新霉素(neomycin)抗性基因也可用于在原核宿主细胞与真核宿主细胞两者中进行选择。[0221]其它可选择基因可用于扩增将表达的基因。扩增是产生对生长或细胞存活关键的蛋白质所需的基因在连续多代重组细胞的染色体内串联重复的过程。适于哺乳动物细胞的可选择标记的实例包括二氢叶酸还原酶(dhfr)和无启动子胸苷激酶基因。将哺乳动物细胞转化体置于选择压力下，其中仅转化体借助于载体中存在的可选择基因而唯一适应于存活。选择压力是通过在以下条件下培养转化的细胞来施加：连续增加培养基中的选择剂的浓度，由此导致扩增可选择基因与编码另一基因(如抗体轻链或重链)的dna两者。因此，自扩增的dna合成增加量的多肽。[0222]核糖体结合位点通常为rnrna的翻译启始所必需，并且特征在于具有shine‑dalgarno序列(原核生物)或kozak序列(真核生物)。所述元件通常位于启动子的3'和待表达的多肽的编码序列的5'。在某些实施方案中，一个或多个编码区可可操作地连接于内部核糖体结合位点(ires)，从而允许自单一rna转录物翻译两个开放阅读框。[0223]在一些情况下，如当在真核宿主细胞表达系统中需要糖基化时，可操作各种前序列或原序列以改进糖基化或产率。举例来说，可改变特定信号肽的肽酶裂解位点，或添加原序列，此也可影响糖基化。最终蛋白质产物可在‑1位置(相对于成熟蛋白质的第一个氨基酸)具有一个或多个与表达相伴的可能尚未完全移除的额外氨基酸。举例来说，最终蛋白质产物可具有一个或两个见于肽酶裂解位点中的连接于氨基末端的氨基酸残基。或者，如果酶在成熟多肽内的所述区域处切割，那么使用一些酶裂解位点可产生所需多肽的略微截短形式。[0224]本发明的表达和克隆载体将通常含有由宿主生物体识别，并且可操作地连接于编码多肽的分子的启动子。启动子是位于结构基因(通常在约100至1000bp内)的起始密码子上游(即5')的未转录序列，其控制结构基因的转录。启动子依照惯例分组至以下两个类别中的一个：诱导性启动子和组成性启动子。诱导性启动子可反应于培养条件的某一变化(如存在或不存在某一养分或温度变化)来引发在它们控制下自dna的转录程度增加。另一方面，组成性启动子均一转录它们所可操作地连接的基因，即少许控制或不控制基因表达。许多由多种潜在宿主细胞识别的启动子是熟知的。通过限制酶消化自来源dna移除启动子以及将所需启动子序列插入载体中来使适合启动子可操作地连接于编码例如重链或轻链的dna。[0225]适合与酵母宿主一起使用的启动子在本领域中也是熟知的。酵母增强子有利地与酵母启动子一起使用。适合与哺乳动物宿主细胞一起使用的启动子是熟知的，并且包括但不限于自病毒的基因组获得的那些，所述病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、b型肝炎病毒和最优选猿猴病毒40(sv40)。其它适合哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子和肌动蛋白(actin)启动子。[0226]可为所关注的其它启动子包括但不限于：sv40早期启动子(benoist和chambon,1981,nature290:304‑310)；cmv启动子(thornsen等,1984,proc.natl.acad.u.s.a.81:659‑663)；劳斯肉瘤病毒(roussarcomavirus)的3'长末端重复序列中含有的启动子(yamamoto等,1980,cell22:787‑797)；疱疹胸苷激酶启动子(wagner等,1981,proc.natl.acad.sci.u.s.a.78:1444‑1445)；金属硫蛋白(metallothionine)基因的启动子和调控序列(prinster等,1982,nature296:39‑42)；和原核启动子，如β‑内酰胺酶启动子(villa‑kamaroff等,1978,proc.natl.acad.sci.u.s.a.75:3727‑3731)；或tac启动子(deboer等,1983,proc.natl.acad.sci.u.s.a.80:21‑25)。也关注的是展现组织特异性，并且已用于转基因动物中的以下动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶(elastase)i基因控制区(swift等,1984,cell38:639‑646；ornitz等,1986,coldspringharborsymp.quant.biol.50:399‑409；macdonald,1987,hepatology7:425‑515)；在胰腺β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区(hanahan,1985,nature315:115‑122)；在淋巴样细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(grosschedl等,1984,cell38:647‑658；adames等,1985,nature318:533‑538；alexander等,1987,mol.cell.biol.7:1436‑1444)；在睾丸、乳房、淋巴样和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(leder等,1986,cell45:485‑495)；在肝中具有活性的白蛋白(albumin)基因控制区(pinkert等,1987,genesanddevel.1:268‑276)；在肝中具有活性的α‑胎蛋白(alpha‑feto‑protein)基因控制区(krumlauf等,1985,mol.cell.biol.5:1639‑1648；hammer等,1987,science253:53‑58)；在肝中具有活性的α1‑抗胰蛋白酶基因控制区(kelsey等,1987,genesanddevel.1:161‑171)；在骨髓细胞中具有活性的β‑球蛋白基因控制区(mogram等,1985,nature315:338‑340；kollias等,1986,cell46:89‑94)；在脑中的寡树突细胞中具有活性的髓磷脂(myelin)碱性蛋白基因控制区(readhead等,1987,cell48:703‑712)；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白(myosin)轻链‑2基因控制区(sani,1985,nature314:283‑286)；以及在下视丘中具有活性的促性腺释放激素基因控制区(mason等,1986,science234:1372‑1378)。[0227]增强子序列可插入载体中以增加由高等真核生物转录编码本发明的轻链或重链的dna。增强子是dna的顺式作用元件，长度通常约10‑300bp，其作用于启动子以增加转录。增强子具有相对定向和位置非依赖性，其已见于转录单元的5'位置与3'位置两者处。可自哺乳动物基因获得的若干增强子序列是已知的(例如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α‑胎蛋白和胰岛素)。然而，通常使用来自病毒的增强子。本领域中已知的sv40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤增强子和腺病毒增强子是用于活化真核启动子的示例性增强元件。尽管增强子可在载体中位于编码序列的5'或3'，但其通常位于启动子的5'位点处。编码适当天然或异源信号序列(前导序列或信号肽)的序列可并入表达载体中以促进抗体的细胞外分泌。对信号肽或前导物的选择取决于待在其中产生抗体的宿主细胞的类型，并且异源信号序列可替换天然信号序列。在哺乳动物宿主细胞中具有功能性的信号肽的实例包括以下：美国专利号4,965,195中所述的白介素(interleukin)‑7(il‑7)的信号序列；cosman等,1984,nature312:768中所述的白介素‑2受体的信号序列；ep专利号0367566中所述的白介素‑4受体信号肽；美国专利号4,968,607中所述的i型白介素‑1受体信号肽；ep专利号0460846中所述的ii型白介素‑1受体信号肽。disuse)、反射性交感神经营养不良综合征、区域性骨质疏松、骨软化、与关节置换相关的骨损失、hiv相关的骨损失、与生长激素损失相关的骨损失、与囊性纤维化相关的骨损失、化学疗法相关的骨损失、肿瘤诱发的骨损失、癌症相关的骨损失、激素消除性骨损失、多发性骨髓瘤、药物诱发的骨损失、神经性厌食、疾病相关的面骨损失、疾病相关的颅骨损失、疾病相关的颚骨损失、疾病相关的头骨损失、与老化相关的骨损失、与老化相关的面骨损失、与老化相关的颅骨损失、与老化相关的颚骨损失、与老化相关的头骨损失和与太空旅行相关的骨损失。[0237]在一些实施方案中，本文所述的异二聚抗体适用于改进矫形程序、牙科程序、植入手术、关节置换、骨移植、骨整容手术和骨修复(如骨折愈合、骨不连接愈合、连接延迟愈合和面部重建)中的结果。包含一种或多种异二聚抗体或片段的组合物可在程序、置换、移植、手术或修复之前、期间和/或之后施用。[0238]在一些实施方案中，本文所述的异二聚抗体适用于治疗在骨的两个区段之间包含间隙(例如在骨的两个区段之间的至少约1mm间隙)的任何骨折。在一些或任何实施方案中，间隙是至少约2mm、至少约3mm、至少约4mm、至少约5mm、至少约6mm、至少约7mm、至少约8mm、至少约9mm、或至少约1cm或大于1cm。在一些或任何实施方案中，间隙是约5mm至1cm，或多达1cm。术语“骨间隙缺陷”与“区段性骨骼缺陷”在本文中是同义使用，并且是指在骨的两个区段之间的间隙(例如至少1mm间隙)。[0239]示例性骨间隙缺陷包括但不限于粉碎骨折、不连接骨折、区段性骨骼缺陷、手术产生的骨缺陷、手术治疗的骨缺陷、以及由对骨的创伤性损伤或疾病(包括但不限于关节炎、肿瘤移除(切除)或感染移除)产生的骨缺陷。在一些或任何实施方案中，骨间隙缺陷是通过移除感染的骨段或由于包括但不限于骨肉瘤、尤因氏肉瘤(ewing'ssarcoma)、软骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、纤维肉瘤和脊索瘤的骨癌而自骨移除癌症产生。在一些或任何实施方案中，骨间隙缺陷是例如归因于遗传缺陷的发育畸形。[0240]在一些或任何实施方案中，骨间隙缺陷是通过移除含有良性肿瘤的骨段产生。示例性良性骨肿瘤包括但不限于骨瘤、骨样骨瘤、成骨细胞瘤、骨软骨瘤、内生软骨瘤、软骨粘液样纤维瘤、动脉瘤样骨囊肿、单腔骨囊肿、骨纤维性发育不良和骨巨细胞肿瘤。[0241]施用异二聚抗体会增强或加速骨间隙缺陷愈合，由此“治疗”骨间隙缺陷。“增强”骨愈合是指介导骨愈合的程度超过(即大于)未施用硬化蛋白抑制剂的受试者(例如哺乳动物，如人)(即对照受试者)中经受的骨愈合的程度。骨愈合是例如通过桥接状态、骨体积改进、骨折间隙内的骨矿物质含量和密度改进(即形成桥接骨)、成熟骨愈伤组织、骨强度改进(任选伴有医学上可接受的骨刚性程度)、或患者对受影响区域的使用改进来证实。就“改进”而言，其是指测量的参数增加或降低(根据需要)。增加可为测量的参数完全或部分返回至基线水平(例如在骨间隙缺陷之前的水平)、至本领域中使用的标准数据库中提供的值、或至对侧功能水平(例如完全或部分返回至例如对侧肢体的功能能力)。在一些情况下，增加可为超过基线水平的改进。必要时，在施用一剂或多剂异二聚抗体的患者中测量的参数可与未施用异二聚抗体的骨折患者(任选年龄和性别匹配)中的相同参数进行比较以进一步分析本文所述的方法的功效。[0242]在骨缺陷部位处的桥接骨的形成、骨矿物质含量和骨密度、和/或成熟骨愈伤组织可使用放射线摄影术(例如放射线摄影吸光测定法)、单一和/或双重能量x射线吸光测定法、定量电脑断层摄影术(qct)、超声波检查术、放射线摄影术(例如放射线摄影吸光测定法)和磁共振成像测量。在一些实施方案中，异二聚抗体可在有效使在缺陷部位处的桥接骨形成、骨愈伤组织形成、或骨密度(或体积)增加至少约5％(约6％、约7％、约8％或约9％)的剂量下，并且持续有效使在缺陷部位处的桥接骨形成、骨愈伤组织形成、或骨密度(或体积)增加至少约5％(约6％、约7％、约8％或约9％)的时期来施用。在一些实施方案中，在缺陷部位处的桥接骨形成、骨愈伤组织形成、或骨密度增加至少约10％(例如至少约10％、至少约12％、至少约15％、至少约18％、至少约20％或至少约22％)。在其它实施方案中，在缺陷部位处的桥接骨形成、骨愈伤组织形成、或骨密度由硬化蛋白抑制剂增加至少约25％(例如至少约26％或至少约28％)。在其它实施方案中，在缺陷部位处的桥接骨形成、骨愈伤组织形成、或骨密度增加至少约30％(例如至少约32％、至少约35％、至少约38％或至少约40％)或至少约50％(例如至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％)。可在初始施用异二聚抗体之后1周、2周、3周或4周测定桥接骨形成增加或再建立。或者，可在治疗时期结束之后(例如在治疗时期结束之后1周、2周、3周或4周)测定骨密度水平。在一个方面，相较于年龄和性别匹配的未接受异二聚抗体的患者，方法降低为建立所需水平的骨形成、骨体积、骨愈伤组织、或骨密度(例如本文所述的骨形成、骨矿物质密度、骨愈伤组织、或骨体积增加任何百分比)所需的时间量，由此降低受试者的恢复时间。举例来说，在一个实施方案中，异二聚抗体降低为使缺陷部位处的骨密度或体积增加至少约10％(例如至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％)所需的时间量。[0243]异二聚抗体无需治愈患有病症的受试者或完全防止骨相关病症的发作以达成有益生物反应。异二聚抗体可防治性地加以使用，意味完全或部分防止骨相关病症或其症状。异二聚抗体也可治疗性用于完全或部分改善骨相关病症或其症状，或完全或部分防止骨相关病症或其症状进一步进展。实际上，本发明的材料和方法特别适用于增加骨矿物质密度，并且历经一段时期维持增加的骨矿物质密度。[0244]在一些实施方案中，历经例如以下治疗时期来进行本文所述的异二聚抗体的一次或多次施用：约1周至约18个月(例如约1个月至约12个月、约1个月至约9个月或约1个月至约6个月或约1个月至约3个月)。在一些实施方案中，历经例如以下治疗时期向受试者施用一剂或多剂本文所述的异二聚抗体：约1个月至约12个月(52周)(例如约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月或约11个月)。在一些实施方案中，向受试者施用一剂或多剂异二聚抗体以维持骨矿物质密度。如本文所用的术语“维持骨矿物质密度”是指由初始剂量的异二聚抗体所致的骨矿物质密度增加历经约6个月、约9个月、约1年、约18个月、约2年的时程或历经患者一生不降低超过约1％至约5％。应了解患者可需要交替治疗阶段以增加骨密度和维持骨密度。[0245]此外，可为有利的是视选择用于特定受试者的治疗方案而定，施用多剂异二聚抗体或分开施用各剂量。在一些实施方案中，历经1年(12个月，52周)或1年以下(例如9个月或9个月以下、6个月或6个月以下、或3个月或3个月以下)的时期定期施用异二聚抗体或其片段。就此而言，每约3天、或约7天、或2周、或3周、或4周、或5周、或6周、或7周、或8周、或9周、或10周、或11周、或12周、或13周、或14周、或15周、或16周、或17周、或18周、或19周、或20周、或21周、或22周、或23周、或6个月、或12个月一次向人施用异二聚抗体或其片段。[0246]在一些实施方案中，治疗时期开始于检测到骨间隙缺陷之后不久，例如缺陷的30分钟内、1小时内、2小时内、6小时内、12小时内或24小时内。在其它实施方案中，抑制剂是在骨缺陷的1天内、在骨缺陷的3天内、在骨缺陷的5天内、在骨缺陷的7天内、或在骨缺陷的2周内施用，其中硬化蛋白结合剂是持续骨缺陷后至少11周(例如11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、25周、26周、27周28周、29周、30周、31周或31周以上(例如8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月或18个月以上))的时期施用。[0247]在一些实施方案中，以有效治疗与骨矿物质密度降低相关的骨病症的量，并且持续有效治疗与骨矿物质密度降低相关的骨病症的时间施用一剂或多剂异二聚抗体或其片段。在各种实施方案中，每周向受试者(例如人受试者)施用一个或多个包含约50毫克至约1,000毫克异二聚抗体的剂量。举例来说，一剂异二聚抗体可包含至少约5mg、15mg、25mg、50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约120mg、约150mg、约200mg、约240mg、约250mg、约280mg、约300mg、约350mg、约400mg、约420mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg或多达约1,000mg异二聚抗体。也涵盖介于任何和所有这些终点之间的范围，例如约50mg至约80mg、约70mg至约140mg、约70mg至约270mg、约75mg至约100mg、约100mg至约150mg、约140mg至约210mg、或约150mg至约200mg、或约180mg至约270mg、或约280至约410mg。在任何间隔下施用剂量，如一周多次(例如每周两或三次)、一周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次。在一些或任何实施方案中，一周两次施用剂量在约120mg至约210mg的范围内的异二聚抗体。在一些或任何实施方案中，一周两次施用约140mg剂量的异二聚抗体。[0248]在一些实施方案中，一剂或多剂异二聚抗体可包含每千克体重约0.1至约50毫克(例如约5与约50毫克之间)或约1至约100毫克之间的异二聚抗体(mg/kg)。举例来说，异二聚抗体的剂量可包含至少约0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约26mg/kg、约27mg/kg、约28mg/kg、约29mg/kg、约30mg/kg、约31mg/kg、约32mg/kg、约33mg/kg、约34mg/kg、约35mg/kg、约36mg/kg、约37mg/kg、约38mg/kg、约39mg/kg、约40mg/kg、约41mg/kg、约42mg/kg、约43mg/kg、约44mg/kg、约45mg/kg、约46mg/kg、约47mg/kg、约48mg/kg、或约49mg/kg、或约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或多达约100mg/kg。也涵盖介于任何和所有这些终点之间的范围，例如约1mg/kg至约3mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg至约8mg/kb、约3mg/kg至约8mg.kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约20mg/kg、约1mg/kg至约40mg/kg、约5mg/kg至约30mg/kg、或约5mg/kg至约20mg/kg。[0249]监测疗法[0250]可使用单一和双重能量x射线吸光测定法、超声波、电脑断层摄影术、放射线摄影术和磁共振成像来测量异二聚抗体介导的骨矿物质含量或骨密度增加。骨物质的量也可由体重或通过使用其它方法(参见guinness‑hey,metab.bonedis.relat.res.,5:177‑181(1984))加以计算。动物模型在本领域中用于测试药物组合物和方法对例如以下模拟人疾病(如骨质疏松和骨量减少)状况的参数的影响：骨损失、骨再吸收、骨形成、骨强度或骨矿化。所述模型的实例包括切除卵巢的大鼠模型(kalu,boneandmineral,15:175‑192(1991)；frost和jee,boneandmineral,18:227‑236(1992)；以及jee和yao,j.musculoskel.neuron.interact.,1:193‑207(2001))。测量本文所述的异二聚抗体活性的方法也可用于测定其它硬化蛋白抑制剂的功效。[0251]在人中，在临床上可使用例如髋和脊柱的双重x射线吸光测定法(dxa)来测定骨矿物质密度。其它技术包括定量电脑断层摄影术(qct)、超声波检查术、单一能量x射线吸光测定法(sxa)和放射线摄影吸光测定法。通常用于测量的中心骨骼部位包括脊柱和髋；周边部位包括前臂、手指、腕和踵。除超声波检查术以外，美国医学协会指示bmd技术通常涉及使用x射线，并且基于辐射衰减取决于辐射路径中组织的厚度和组成的原理。所有技术都涉及使结果与标准数据库进行比较。[0252]或者，可通过监测骨标记水平来计量对一种或多种硬化蛋白结合剂的生理反应。骨标记是骨重塑过程期间产生的产物，并且由骨、成骨细胞和/或破骨细胞释放。骨再吸收和/或骨形成“标记”水平的波动暗示骨重塑/塑造的变化。国际骨质疏松基金会(iof)推荐使用骨标记来监测骨密度疗法(参见例如delmas等,osteoporosint.,增刊6:s2‑17(2000)，以引用的方式并入本文)。指示骨再吸收(或破骨细胞活性)的标记包括例如c‑端肽(例如1型胶原蛋白的c末端端肽(ctx)或血清交联c‑端肽)、n‑端肽(1型胶原蛋白的n末端端肽(ntx))、脱氧吡啶啉(dpd)、吡啶啉、尿羟脯氨酸、半乳糖羟赖氨酸和酒石酸抗性酸性磷酸酶(例如血清酒石酸抗性酸性磷酸酶亚型5b)。骨形成/矿化标记包括但不限于骨特异性碱性磷酸酶(bsap)、自i型原胶原的n末端和c末端延伸部分释放的肽(p1np、picp)、以及骨钙蛋白(osteocalcin，ostca)。若干试剂盒可商购以检测，并且定量如尿和血液的临床样本中的标记。[0253]组合疗法[0254]相对于单独使用治疗相关剂量的各药剂，通过组合两种或更多种靶向相同病原体或生物化学路径或生物过程的药剂来治疗病变有时会使功效更大，并且副作用减少。在一些情况下，药物组合的功效是累加性的(组合的功效约等于各单独药物的效应的总和)，但在其它情况下，效应是协同性的(组合的功效大于各单独给定药物的效应的总和)。如本文所用，术语“组合疗法”是指以同时方式(例如并行)递送两种或更多种药剂，或其中首先施用一种药剂，随后例如连续施用第二药剂。[0255]在一些实施方案中，连同用于治疗骨矿物质密度降低的照护标准治疗剂一起施用异二聚抗体(即异二聚抗体和照护标准治疗剂是相同治疗计划的一部分)。如本文所用，术语“照护标准”是指通常为临床医师接受的用于诊断有一种类型的疾病的某一类型的患者的治疗剂。在一些实施方案中，连同适用于治疗骨矿物质密度降低或骨缺陷的第二骨增强剂一起施用异二聚抗体。在一些实施方案中，骨增强剂是选自由以下组成的组：抗再吸收剂、骨形成剂(即合成代谢剂)、雌激素受体调节剂(包括但不限于雷洛昔芬(raloxifene)、巴多昔芬(bazedoxifene)和拉索昔芬(lasofoxifene))和对破骨细胞具有抑制效应的药物。在一些实施方案中，第二骨增强剂是选自由以下组成的组：双膦酸盐(包括但不限于阿仑膦酸钠(alendronatesodium)利塞膦酸盐(risedronate)、伊班膦酸钠(ibandronatesodium)和唑来膦酸(zoledronicacid))；雌激素或雌激素类似物；抗rank配体(rankl)抑制剂，如抗rankl抗体(例如)；维生素d或维生素d衍生物或其模拟物；钙源、组织蛋白酶‑k(cathepsin‑k，cat‑k)抑制剂(例如奥丹昔布(odanacatib))、替勃龙(tibolone)、降血钙素(calcitonin)或钙三醇(calcitriol)；以及激素补充疗法。在一些实施方案中，第二骨增强剂包括但不限于副甲状腺激素(pth)或其肽片段、pth相关蛋白质(pthrp)、骨形态发生蛋白质、成骨素(osteogenin)、naf、pge2促效剂、士他汀(statin)、雷尼酸锶(strontiumranelate)、硬化蛋白抑制剂(例如描述于例如美国专利号7,592,429或7,872,106中的抗硬化蛋白抗体)和抗dkk1抗体或抑制剂。在一些实施方案中，第二骨增强剂是(特立帕肽(teriparatide))、或在一些实施方案中，第二骨增强剂包括骨形态发生蛋白质(例如bmp‑1、bmp‑2、bmp‑3、bmp‑4、bmp‑5、bmp‑6、bmp‑7、bmp‑8、bmp‑9、bmp‑10、bmp‑11、bmp‑12、bmp‑13、bmp‑14和/或bmp‑15)。[0256]在一些实施方案中，采用本文所述的异二聚抗体的组合疗法可在施用其它治疗剂(例如第二骨增强剂)之前或之后间隔数分钟至数周至数月范围。举例来说，单独模态在彼此的约24小时内，例如在彼此的约6‑12小时内或在彼此的约1‑2小时内或在彼此的约10‑30分钟内施用。在一些情形下，可合乎需要的是显著延长治疗时期，其中不同模态的相应施用之间间隔数天(2、3、4、5、6或7天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。明确涵盖用组合疗法的一种或两种药剂/疗法重复治疗。[0257]维持治疗方案[0258]也涵盖在维持方案中使用第二骨增强剂和/或本文所述的异二聚抗体来例如预防或减缓骨矿物质密度损失。就此而言，本文所述的方法或用途任选包括在用异二聚抗体进行的治疗时期已结束之后，持续约1周至约5年的维持时期施用有效维持骨矿物质密度的一个或多个量的第二骨增强剂。举例来说，在一些实施方案中，本文所述的方法或用途包括持续约至少约1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、3个月、13周、14周、15周、16周、4个月、17周、18周、19周、20周、5个月、21周、22周、23周、24周、6个月、25周、26周、27周、28周、7个月、29周、30周、31周或31周以上(例如8个月、9个月、10个月、11个月、1年、15个月、18个月、2年、3年、4年、5年或5年以上(例如历经受试者一生)的维持时期向受试者施用第二骨增强剂。在一些实施方案中，维持时期是约6‑12周。在一些实施方案中，维持时期是约4‑12周或约1‑3个月。在一些实施方案中，维持时期是约12‑20周或约3‑5个月。在一些实施方案中，维持时期是约20‑32周或约5‑8个月。在一些实施方案中，维持时期是约24‑36周或约6‑9个月。在一些实施方案中，维持时期是约1年、约2年、约3年、约4年、约5年或5年以上。“维持”骨矿物质密度包括使接受异二聚抗体治疗的受试者中经历的骨矿物质密度参数维持在类似水平下。[0259]类似地，本文所述的方法或用途任选包括在治疗时期已结束之后，随后持续至少约1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、3个月、13周、14周、15周、16周、4个月、17周、18周、19周、20周、5个月、21周、22周、23周、24周、6个月、1年、2年、3年、4年、5年或5年以上(例如历经受试者一生)的维持时期施用有效维持骨矿物质密度的一个或多个量的异二聚抗体。在一些实施方案中，维持时期是约6‑12周。在一些实施方案中，维持时期是约4‑12周或约1‑3个月。在一些实施方案中，维持时期是约12‑20周或约3‑5个月。在一些实施方案中，维持时期是约20‑32周或约5‑8个月。在一些实施方案中，维持时期是约24‑36周或约6‑9个月。在一些实施方案中，维持时期是约1年、约2年、约3年、约4年、约5年或5年以上。[0260]药物组合物[0261]在一些实施方案中，本发明提供一种包含治疗有效量的一种或多种本发明的抗原结合蛋白以及药物有效稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的药物组合物。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。[0262]优选地，配制物质在所用剂量和浓度下对接受者无毒。在特定实施方案中，提供包含治疗有效量的异二聚抗体或片段的药物组合物。[0263]在一些实施方案中，药物组合物可含有用于调节、维持或保持例如组合物的ph、容积摩尔渗透浓度、粘度、澄清度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的配制物质。在所述实施方案中，适合配制物质包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、脯氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(如抗坏血酸(ascorbicacid)、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、tris‑hcl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；增积剂(如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(edta))；络合剂(如咖啡碱(caffeine)、聚乙烯吡咯烷酮、β‑环糊精或羟丙基‑β‑环糊精)；填充剂；单糖；双糖；和其它碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐相对离子(如钠)；防腐剂(如氯化苯甲烃铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞(thimerosal)、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸(sorbicacid)或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)；混悬剂；界面活性剂或湿润剂(如普洛尼克(pluronic)、peg、脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯)、曲通(triton)、缓血酸胺(tromethamine)、卵磷脂(lecithin)、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露糖醇山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见remington'spharmaceuticalsciences,第18版,(a.r.genrmo编),1990,mackpublishingcompany。[0264]在一些实施方案中，最优药物组合物将由本领域技术人员视例如预定施药途径、递送形式和所需剂量而确定。参见例如remington'spharmaceuticalsciences(上文)。在某些实施方案中，所述组合物可影响异二聚抗体或片段的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在某些实施方案中，药物组合物中的主要媒介物或载体在性质方面可为水性或非水性。举例来说，适合媒介物或载体可为注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊髓液，可能补充有用于胃肠外施药的组合物中常见的其它物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其它示例性媒介物。在特定实施方案中，药物组合物包含ph约7.0‑8.5的tris缓冲液或ph约4.0‑5.5的乙酸盐缓冲液，并且可还包括山梨糖醇或其适合替代物。在本发明的某些实施方案中，可通过混合具有所需纯度的所选组合物与任选的配制剂(remington'spharmaceuticalsciences(上文))来以冻干饼或水溶液形式制备组合物以供储存。此外，在一些实施方案中，可使用如蔗糖的适当赋形剂将异二聚抗体或片段配制成冻干物。[0265]可选择本发明的药物组合物以用于胃肠外递送。或者，可选择组合物以用于吸入或通过消化道递送，如经口递送。制备所述药学上可接受的组合物属于本领域的技能。配制组分优选以可为施药部位接受的浓度存在。在某些实施方案中，缓冲剂用于维持组合物在生理ph或略微较低ph下，通常在约5至约8的ph范围内。[0266]当预期胃肠外施药时，用于本发明中的治疗组合物可以于药学上可接受的媒介物中包含所需异二聚抗体或片段的无热原、胃肠外可接受的水溶液形式提供。特别适于胃肠外注射的媒介物是异二聚抗体或片段于其中配制成适当防腐的无菌等张溶液的无菌蒸馏水。在某些实施方案中，制备涉及配制所需分子与可提供可通过储槽注射递送的产品的控制或持续释放的试剂，如可注射微球、生物可腐蚀粒子、聚合化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体。在某些实施方案中，也可使用具有提升在循环中的持续时间的作用的透明质酸。在某些实施方案中，可植入药物递送装置可用于引入所需异二聚抗体或片段。[0267]可配制用于吸入的本发明的药物组合物。在这些实施方案中，异二聚抗体或片段有利地配制成干燥可吸入粉末。在特定实施方案中，异二聚抗体或片段吸入溶液也可与推进剂一起配制以用于气雾剂递送。在某些实施方案中，溶液可加以雾化。经肺施药和因此配制方法进一步描述于国际专利申请号pct/us94/001875中，所述申请以引用的方式并入本文，并且描述经肺递送化学修饰蛋白质。[0268]也预期制剂可经口施用。以这个方式施用的异二聚抗体或片段可与或不与惯常用于混配如片剂和胶囊的固体剂型的载体一起配制。在某些实施方案中，胶囊可被设计来在于胃肠道中时释放制剂的活性部分，此时生物可用度最大，并且全身前降解最小。可包括其它试剂以促进异二聚抗体或片段吸收。也可采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、混悬剂、片剂崩解剂和粘合剂。[0269]其它药物组合物将为本领域技术人员所显而易知，包括涉及呈持续或控制递送制剂形式的抗原结合蛋白的制剂。配制多种其它持续或控制递送装置，如脂质体载体、生物可腐蚀微粒或多孔珠粒和储槽注射液的技术也为本领域技术人员所知。参见例如国际专利申请号pct/us93/00829，其以引用的方式并入本文，并且描述多孔聚合微粒的控制释放以递送药物组合物。持续释放制剂可包括呈定形物品，例如薄膜或微胶囊形式的半透性聚合物基质。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚交酯(如美国专利号3773919和欧洲专利申请公布号ep058481中所公开，其各自以引用的方式并入本文)、l‑谷氨酸与l‑谷氨酸γ乙酯的共聚物(sidman等,1983,biopolymers2:547‑556)、聚(甲基丙烯酸2‑羟乙酯)(langer等,1981,j.biomed.mater.res.15:167‑277和langer,1982,chem.tech.12:98‑105)、乙烯乙酸乙烯酯(langer等,1981(上文))或聚d(‑)‑3‑羟丁酸(欧洲专利申请公布号ep133988)。持续释放组合物也可包括可通过本领域中已知的若干方法中的任一个制备的脂质体。参见例如eppstein等,1985,proc.natl.acad.sci.u.s.a.82:3688‑3692；欧洲专利申请公布号ep036676；ep088046和ep143949，所述文献和专利以引用的方式并入本文。[0270]通常以无菌制剂形式提供用于体内施药的药物组合物。灭菌可通过无菌过滤膜过滤达成。当冻干组合物时，使用这个方法进行的灭菌可在冻干和复原之前或之后进行。用于胃肠外施药的组合物可以冻干形式或以溶液形式储存。胃肠外组合物通常放置入具有无菌入口的容器，例如具有可由皮下注射针刺穿的塞的静脉内溶液袋或小瓶中。[0271]本发明的方面包括可用作药物组合物的自缓冲异二聚抗体或片段制剂，如以引用的方式整体并入本文的国际专利申请wo2006/138181a2(pct/us2006/022599)中所述。[0272]如上所论述，某些实施方案提供除异二聚抗体或片段之外也包含一种或多种赋形剂(如这个章节中以及本文其它地方以说明方式所述的那些)的异二聚抗体或片段组合物，具体来说药物异二聚抗体或片段组合物。就此而言，赋形剂可在本发明中用于广泛多种目的，如调整制剂的物理、化学或生物性质(如调整粘度)和/或本发明的方法以改进有效性和/或使所述制剂和方法稳定以对抗归因于例如在制造、运送、储存、使用前制备、施用期间和此后产生的应激的降解和腐败。[0273]关于蛋白质稳定化和配制物质以及就此而言适用的方法，有多个阐述可用，如arakawa等,“solventinteractionsinpharmaceuticalformulations,”pharmres.8(3):285‑91(1991)；kendrick等,“physicalstabilizationofproteinsinaqueoussolution,”rationaldesignofstableproteinformulations:theoryandpractice,carpenter和manning编pharmaceuticalbiotechnology.13:61‑84(2002)；以及randolph等,“surfactant‑proteininteractions,”pharmbiotechnol.13:159‑75(2002)，其各自以引用的方式整体并入本文，具体来说关于所述文献的用于本发明的自缓冲蛋白质制剂的赋形剂和方法的部分，尤其关于用于兽医学和/或人医学用途的蛋白质药物产品和方法。[0274]可根据本发明的某些实施方案使用盐以例如调整制剂的离子强度和/或等张性和/或改进本发明的组合物的蛋白质或其它成分的溶解性和/或物理稳定性。[0275]如所熟知，离子可通过结合于蛋白质的表面上的带电荷残基和通过遮蔽蛋白质中的带电荷和极性基团，并且降低它们的静电相互作用、吸引和排斥相互作用的强度来使蛋白质的天然状态稳定。离子也可通过结合于具体来说蛋白质的变性肽键(‑‑conh)来使蛋白质的变性状态稳定。此外，与蛋白质中的带电荷和极性基团的离子相互作用也可降低分子间静电相互作用，并且由此防止或降低蛋白质聚集和不溶。[0276]离子物质在它们对蛋白质的影响方面显著不同。已建立对离子和它们对蛋白质的影响的许多种类分级，其可用于配制本发明的药物组合物。一个实例是郝夫麦士特序列(hofmeisterseries)，其根据离子和极性非离子溶质对溶液中的蛋白质的构象稳定性的影响来将它们分级。稳定性溶质称为“低离液序列(kosmotropic)”溶质。去稳性溶质称为“高离液序列(chaotropic)”溶质。低离液序列物通常在高浓度(例如>1摩尔硫酸铵)下用于使蛋白质自溶液沉淀(“盐析”)。高离液序列物通常用于使蛋白质变性和/或溶解(“盐溶”)。离子“盐溶”和“盐析”的相对有效性划定它们在郝夫麦士特序列中的位置。[0277]游离氨基酸可在根据本发明的各种实施方案的异二聚抗体或片段制剂中用作增积剂、稳定剂和抗氧化剂以及用于其它标准用途。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于使制剂中的蛋白质稳定。甘氨酸适用于冻干中以确保恰当饼结构和性质。精氨酸可适用于在液体制剂与冻干制剂两者中抑制蛋白质聚集。甲硫氨酸适用作抗氧化剂。[0278]多元醇包括糖，例如甘露糖醇、蔗糖和山梨糖醇；和多羟基醇，例如像甘油和丙二醇，以及出于本文论述的目的，包括聚乙二醇(peg)和相关物质。多元醇是低离液序列的。它们是液体制剂与冻干制剂两者中的适用于保护蛋白质免遭物理和化学降解过程的稳定剂。多元醇也适用于调整制剂的张力。[0279]适用于本发明的所选实施方案中的多元醇尤其是通常用于确保冻干制剂中的饼的结构稳定性的甘露糖醇。它确保饼的结构稳定性。它通常与例如蔗糖的冻干保护剂一起使用。山梨糖醇和蔗糖是用于调整张力，并且作为在运输期间或在制造过程期间制备大块期间防止冻融应激的稳定剂的优选试剂。如葡萄糖和乳糖的还原糖(其含有游离醛或酮基团)可使表面赖氨酸和精氨酸残基糖化。因此，它们通常不是供根据本发明使用的优选多元醇。此外，形成所述反应性物质的糖，如在酸性条件下水解成果糖和葡萄糖，并且因此导致糖化的蔗糖，就此而言也不是本发明的优选多元醇。peg适用于使蛋白质稳定并适用作低温保护剂，并且就此而言可用于本发明中。[0280]异二聚抗体或片段制剂的实施方案还包含界面活性剂。蛋白质分子可易吸附于表面上，并且易变性和随后在空气‑液体、固体‑液体和液体‑液体界面处聚集。这些效应通常与蛋白质浓度成反比。这些有害相互作用通常与蛋白质浓度成反比，并且通常通过物理搅动，如在产品的运送和处理期间产生的物理搅动加剧。[0281]界面活性剂常规用于防止、最小化或降低表面吸附。就此而言，适用于本发明中的界面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱水山梨醇聚乙氧基化物的其它脂肪酸酯和泊洛沙姆188(poloxamer188)。[0282]界面活性剂也通常用于控制蛋白质构象稳定性。就此而言，界面活性剂的使用具有蛋白质特异性，因为任何给定界面活性剂通常都将使一些蛋白质稳定，并且使其它蛋白质去稳。[0283]聚山梨醇酯易经受氧化降解，并且如所供应，常含有会导致蛋白质残基侧链，尤其甲硫氨酸氧化的足量过氧化物。因此，聚山梨醇酯应小心使用，并且当使用时，应在它们的最低有效浓度下采用。就此而言，聚山梨醇酯例示赋形剂应以它们的最低有效浓度使用的一般性准则。[0284]异二聚抗体或片段制剂的实施方案还包含一种或多种抗氧化剂。在某种程度上，蛋白质的有害氧化可通过维持适当环境氧和温度水平和通过避免暴露于光而在药物制剂中加以防止。抗氧化剂赋形剂也可用于防止蛋白质的氧化降解。就此而言，适用抗氧化剂尤其是还原剂、氧/自由基清除剂和螯合剂。用于本发明的治疗蛋白质制剂中的抗氧化剂优选是水溶性的，并且在产品的整个保存期限期间维持它们的活性。就此而言，edta是本发明的一种优选抗氧化剂。[0285]本发明的制剂可包括作为蛋白质辅因子，并且为形成蛋白质配位复合物所必需的金属离子，如为形成某些胰岛素混悬液所必需的锌。金属离子也可抑制一些使蛋白质降解的过程。然而，金属离子也催化使蛋白质降解的物理和化学过程。[0286]镁离子(10‑120mm)可用于抑制天冬氨酸异构化成异天冬氨酸。ca+2离子(多达100mm)可增加人脱氧核糖核酸酶的稳定性。然而，mg+2、mn+2和zn+2可使rhdna酶去稳。类似地，ca+2和sr+2可使因子viii稳定，因子viii可由mg+2、mn+2和zn+2、cu+2和fe+2去稳，并且它的聚集可由al+3离子增加。[0287]异二聚抗体或片段制剂的实施方案还包含一种或多种防腐剂。当开发涉及自同一容器抽取一次以上的多剂量胃肠外制剂时，防腐剂是必需的。它们的主要功能在于在药物产品的整个保存期限或使用条款期间抑制微生物生长，并且确保产品无菌。通常使用的防腐剂包括苯甲醇、苯酚和间甲酚。尽管防腐剂具有与小分子胃肠外剂一起使用的悠久历史，但开发包括防腐剂的蛋白质制剂可具有挑战性。防腐剂对蛋白质几乎始终具有去稳效应(聚集)，并且此已变为限制它们在多剂量蛋白质制剂中使用的主要因素。迄今为止，大多数蛋白质药物已配制仅供单次使用。然而，当多剂量制剂是可能的时，它们具有使得患者能够得到方便和使得可销售性能够增加的累加优势。一良好实例是人生长激素(hgh)的多剂量制剂，其中开发防腐制剂已导致更方便的多次使用注射笔呈现物商业化。至少四种含有hgh防腐制剂的所述笔装置当前可在市场上获得。诺德托平(norditropin)(液体，novonordisk)、鲁托平水溶液(nutropinaq)(液体，genentech)和增若托平(genotropin)(冻干‑‑双室药筒，pharmacia&upjohn)含有苯酚，而索玛托普(somatrope)(elililly)是与间甲酚一起配制。[0288]在配制和开发防腐剂型期间需要考虑若干方面。必须使药物产品中的有效防腐剂浓度最优化。这需要以赋予抗微生物有效性而不损害蛋白质稳定性的一定浓度范围测试剂型中的给定防腐剂。[0289]正如所预期，开发含有防腐剂的液体制剂比冻干制剂更具挑战。冷冻干燥产品可在无防腐剂下冻干，并且在使用时用含有防腐剂的稀释剂复原。这缩短防腐剂与蛋白质接触的时间，从而使相关稳定性风险显著最小。就液体制剂而言，防腐剂有效性和稳定性应历经整个产品保存期限(约18至24个月)加以维持。一个需注意的要点是防腐剂有效性应在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终制剂中进行证明。[0290]异二聚抗体或片段制剂通常将针对特定施药途径和方法、特定施药剂量和施药频率、对特定疾病的特定治疗以及尤其生物可用度和持久性的范围加以设计。因此，可根据本发明设计用于通过任何适合途径递送的制剂，所述途径包括但不限于经口、经耳、经眼、经直肠和经阴道、以及通过胃肠外途径，包括静脉内和动脉内注射、肌肉内注射和皮下注射。[0291]一旦药物组合物已被配制，它可以溶液、混悬液、凝胶剂、乳液、固体、晶体形式或以脱水或冻干粉末形式储存在无菌小瓶中。所述制剂可以备用形式或以在施用之前复原的形式(例如冻干形式)储存。本发明也提供用于产生单次剂量施药单位的试剂盒。本发明的试剂盒可各自含有具有干燥蛋白质的第一容器与具有水性制剂的第二容器两者。在本发明的某些实施方案中，提供含有单室和多室预填充注射器(例如液体注射器和冷冻注射器)的试剂盒。[0292]待采用的含有抗原结合蛋白的药物组合物的治疗有效量将例如取决于治疗情形和目标。本领域技术人员将了解适用于治疗的剂量将部分地视递送的分子、使用抗原结合蛋白所针对的适应症、施药途径和患者的尺寸(体重、身体表面或器官尺寸)和/或状况(年龄和总体健康状况)而变化。在某些实施方案中，临床医师可滴定剂量，并且改变施药途径以获得最优治疗效应。[0293]稳定性[0294]如本文在包含异二聚抗体(或其抗原结合片段)的组合物的情形下所用的术语“稳定性”和“稳定”是指组合物中的异二聚抗体(或其抗原结合片段)在给定制造、制备、运输和/或储存条件下对聚集、降解或片段化具有抗性。包含高度稳定性的抗体制剂显示可靠性和安全性增强，并且因此有利于临床使用。[0295]任选通过随时间检查组合物中的抗体的所需参数(例如重链和/或轻链的聚集、降解、化学修饰等)来评估组合物中的抗体稳定性。就此而言，通常在初始时间点(t0)和评估时间点(t1)，任选当使抗体或其片段暴露于许多环境条件中的任一个时检查参数，并且进行比较。初始时间点可为例如最初以组合物形式配制抗体或其片段或最初检查质量(即检查以确定抗体组合物是否满足关于聚集或降解的管理或制造规范)的时间。初始时间点也可为以组合物形式再配制抗体或抗体片段(例如相较于初始制剂，在更高或更低浓度下再配制)所处的时间。在各种实施方案中，评估时间点是在初始时间点之后约1周(或约2周、或约3周、或约4周、或约5周、或约6周、或约7周、或约8周、或约10周、或约3个月、或约6个月或约1年)。可在多种储存条件下评估组合物中的抗体或其片段的所需参数(例如聚集或降解)，所述储存条件如温度‑30℃、4℃、20℃或40℃；振荡；ph；在不同容器材料(例如玻璃小瓶、预填充注射器等)中储存等。[0296]测定包含异二聚抗体的组合物中存在的聚集体的聚集度和/或类型和/或尺寸的示例性方法包括但不限于粒径排阻色谱(sec)、高效粒径排阻色谱(hpsec)、静态光散射(sls)、傅立叶转换红外光谱术(ftir)、圆二色性(cd)、脲诱导的蛋白质展开技术、内在色氨酸荧光、示差扫描热析法和1‑苯胺基‑8‑萘磺酸(ans)蛋白质结合技术。可通过使分子历经装填有适当树脂的管柱穿过来进行粒径排阻色谱(sec)以基于分子尺寸分离分子，较大分子(例如聚集体)将在较小分子(例如单体)之前洗脱。通常通过280nm下的uv吸光度检测分子，并且可收集以供进一步表征。高压液体色谱管柱常用于sec分析(hp‑sec)。或者，可利用分析型超速离心(auc)。auc是一种测定液体样本中的巨分子的沉降系数(以斯维德伯格(svedberg)s加以报道)的正交技术。如同sec一样，auc能够使抗体片段/聚集体与单体分离并对此进行检测，并且进一步能够提供关于分子质量的信息。组合物中的抗体或抗体片段聚集也可通过使用库尔特计数器(coultercounter)进行粒子计数器分析或通过使用浊度计进行浊度测量来表征。浊度是溶液中的粒子使光散射的量的量度，并且因此可用作蛋白质聚集的一般性指标。此外，非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)或毛细管凝胶电泳(cge)可用于表征组合物中的抗体或抗体片段的聚集和/或片段化状态。[0297]测定抗体降解的示例性方法包括但不限于粒径排阻色谱(sec)、十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds‑page)和连同sds一起的毛细管电泳(ce‑sds)以及伴有在线ms检测的反相hplc。[0298]在各种实施方案中，在目标条件下，组合物中小于5％的本文所述的异二聚抗体或抗体片段呈聚集体形式。举例来说，在‑30℃、4℃、20℃或40℃下储存约1周(或约2周、或约3周、或约4周、或约5周、或约6周、或约7周、或约8周、或约10周、或约3个月、或约6个月或约1年)的时期之后，组合物中小于4％、或小于3％、或小于2％、或小于1％的异二聚抗体或其片段呈聚集体形式。在一些实施方案中，在约4℃下储存两周之后，组合物中小于5％(或小于4％或小于3％或小于2％或小于1％或1％以下)的本文所述的异二聚抗体或抗体片段呈聚集体形式。[0299]举例来说，在‑30℃、4℃、20℃或40℃下储存约1周(或约2周、或约3周、或约4周、或约5周、或约6周、或约7周、或约8周、或约10周、或约3个月、或约6个月或约1年)的时期之后，组合物中至少85％(或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％)的抗体或其片段任选以非聚集体(即单体)形式存在。在一些实施方案中，在约4℃下储存两周之后，至少85％(或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％或99％以上)的抗体或其片段以非聚集体形式存在于组合物中。在一些实施方案中，在约4℃下储存两周之后，至少99％的抗体以非聚集体形式存在于组合物中，和/或在40℃下储存两周之后至少95％的抗体以非聚集体形式存在于组合物中。[0300]在各种实施方案中，组合物中小于5％的本文所述的异二聚抗体或抗体片段降解。举例来说，在目标条件下，组合物中小于4％、或小于3％、或小于2％、或小于1％或1％以下的异二聚抗体或其片段降解。举例来说，在约‑30℃、约4℃、约20℃或约40℃下储存约1周(或约2周、或约3周、或约4周、或约5周、或约6周、或约7周、或约8周、或约10周、或约3个月、或约6个月或约1年)的时期的组合物中的任选至少85％(或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％)的抗体或片段是完整的(即未降解)。在一些方面，在以组合物形式在约4℃下储存两周的时期之后，至少85％(或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％或99％以上)的抗体或其片段是完整的(即非降解)。在一些实施方案中，当以组合物形式在约4℃下储存两周时，至少99％的抗体或片段保持完整，和/或当以组合物形式在约40℃下储存两周时至少95％保持完整。[0301]本文也涵盖组合物中的异二聚抗体(或其抗原结合片段)的功能或活性稳定性。检测和/或定量例如结合目标的抗体、硬化蛋白中和和dkk‑1中和的测定在本领域中是已知的，并且在本文中描述于实施例4‑6中。任选地，相较于抗体或其片段在初始时间点时的活性，抗体或其片段在目标条件下显示约50‑100％活性。举例来说，相较于初始时间点的活性，抗体或其片段保留的活性程度在约60‑90％或70‑80％之间。因此，相较于在初始时间点时的活性，抗体或其片段的功能稳定性包括保留至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的活性，并且可包括大于100％(如105％、110％、115％、120％、125％或150％或150％以上)的活性测量结果。[0302]粘度[0303]在一些实施方案中，测定包含一种或多种本文所述的异二聚抗体的组合物的粘度。如本文所用的术语“粘度”是指“绝对粘度”。绝对粘度，有时称为动态或简单粘度，是运动粘度与流体密度的乘积(绝对粘度＝运动粘度×密度)。运动粘度的量纲是l2/t，其中l是长度，并且t是时间。通常，运动粘度用厘史(centistoke，cst)表示。运动粘度的si单位是mm2/s，其是1cst。绝对粘度用厘泊(cp)单位表示。绝对粘度的si单位是毫帕‑秒(mpa‑s)，其中1cp＝1mpa‑s。[0304]可在向组合物中添加抗体之后数小时(例如1‑23小时)、数天(例如1‑10天)、数周(例如1‑5周)、数月(例如1‑12个月)或数年(例如1‑2年、1‑3年)测量组合物的粘度。可在储存或施药温度，例如2‑8℃或25℃(室温)下进行粘度测量。在一些实施方案中，液体或复原液体组合物在储存和/或施药温度下的绝对粘度是15cp或15cp以下、或14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4cp或4cp以下。在一些实施方案中，液体或复原液体组合物的绝对粘度是6cp或6cp以下。[0305]在一些实施方案中，在添加异二聚抗体之前和之后测量抗体组合物的粘度。测量粘度的方法在本领域中是熟知的，并且包括例如使用毛细管粘度计或锥板流变仪。任何方法都可使用，前提是相同方法用于比较测试制剂与参考制剂。[0306]试剂盒[0307]包含一种或多种本文所述的异二聚抗体的药物组合物可连同提供关于所述药物组合物的使用的说明书的包装材料一起放置在容器(例如小瓶或注射器)内。通常，所述说明书将包括描述异二聚抗体浓度以及在某些实施方案内可为复原药物组合物所必需的赋形剂成分或稀释剂(例如水、盐水或pbs)的相对量的明确表述。[0308]其它实施方案[0309]也涵盖以下编号段落中提供的以下实施方案：[0310]1.一种分离的抗体重链可变区，其在框架区内在aho位置51或141处包含氨基酸取代，其中所述取代在所述位置处将带正电荷氨基酸或带负电荷氨基酸引入所述重链可变区框架中。[0311]2.如段落1的分离的抗体重链可变区，其中aho位置51或aho位置141被取代成带正电荷氨基酸。[0312]3.如段落2的分离的抗体重链可变区，其还包含在aho位置46处被带正电荷氨基酸取代。[0313]4.如段落2或段落3的分离的抗体重链可变区，其中aho位置51被取代成带正电荷氨基酸。[0314]5.如段落1、2或3的分离的抗体重链可变区，其中aho位置141被取代成正电荷氨基酸。[0315]6.如段落3的分离的抗体重链可变区，其中aho位置46和aho位置141被取代成带正电荷氨基酸。[0316]7.如段落2‑6中任一个的分离的抗体重链，其中所述带正电荷氨基酸是赖氨酸。[0317]8.如段落1的分离的抗体重链可变区，其中aho位置51或aho位置141被取代成带负电荷氨基酸。[0318]9.如段落8的分离的抗体重链可变区，其还包含在aho位置46处被带负电荷氨基酸取代。[0319]10.如段落8或段落9的分离的抗体重链可变区，其中aho位置51被取代成带负电荷氨基酸。[0320]11.如段落8、9或10的分离的抗体重链可变区，其中aho位置141被取代成带负电荷氨基酸。[0321]12.如段落9的分离的抗体重链可变区，其中aho位置46和aho位置141被取代成带负电荷氨基酸。[0322]13.如段落8‑12中任一个的分离的抗体重链，其中所述带负电荷氨基酸是天冬氨酸。[0323]14.如段落1‑13中任一个的分离的抗体重链可变区，其还包含重链ch1区。[0324]15.如段落14的分离的抗体重链可变区，其中所述ch1区包含一个或多个氨基酸添加、缺失或取代。[0325]16.如段落15的分离的抗体重链可变区，其中取代某一氨基酸以将带正电荷或带负电荷氨基酸引入所述ch1区中。[0326]17.如段落16的分离的抗体重链可变区，其中在eu位置s183处引入所述带正电荷或带负电荷氨基酸。[0327]18.如段落17的分离的抗体重链可变区，其中eu位置s183被取代成带正电荷氨基酸。[0328]19.如段落18的分离的抗体重链可变区，其中所述取代是s183k。[0329]20.如段落17的分离的抗体重链可变区，其中eu位置s183被取代成带负电荷氨基酸。[0330]21.如段落20的分离的抗体重链可变区，其中所述取代是s183d。[0331]22.一种抗体重链，其包含如段落1‑21中任一个的分离的抗体重链可变区。[0332]23.如段落22的抗体重链，其中所述重链包含含有一个或多个不利于同二聚化的氨基酸取代的ch3区。[0333]24.如段落23的抗体重链，其中所述ch3区中的带负电荷氨基酸被带正电荷氨基酸取代。[0334]25.如段落24的抗体重链，其中所述带负电荷氨基酸是eu位置d399、e356或e357。[0335]26.如段落25的抗体重链，其中所述带正电荷氨基酸是赖氨酸。[0336]27.如段落26的抗体重链，其中所述ch3区包含d399k和e356k取代。[0337]28.如段落23的抗体重链，其中所述ch3区中的带正电荷氨基酸被带负电荷氨基酸取代。[0338]29.如段落28的抗体重链，其中所述带正电荷氨基酸是eu位置k370、k392或k409。[0339]30.如段落29的抗体重链，其中所述带负电荷氨基酸是天冬氨酸。[0340]31.如段落30的抗体重链，其中所述ch3区包含k392d和k409d取代。[0341]32.一种抗体，其包含如段落24‑27中任一个的抗体重链和如段落28‑31中任一个的抗体重链。[0342]33.如段落22‑31中任一个的抗体重链，其中所述重链包含含有一个或多个改变fc效应物功能的氨基酸取代的ch2区。[0343]34.一种抗体κ轻链可变区，其在框架区内在aho位置51或141处包含氨基酸取代，其中所述取代在所述位置处将带正电荷或带负电荷氨基酸引入所述κ轻链可变区框架中。[0344]35.如段落34的抗体κ轻链可变区，其中aho位置51或aho位置141被取代成带正电荷氨基酸。[0345]36.如段落35的抗体κ轻链可变区，其还包含在aho位置46处被带正电荷氨基酸取代。[0346]37.如段落35或36的抗体κ轻链可变区，其中aho位置51被取代成带正电荷氨基酸。[0347]38.如段落35、36或37的抗体κ轻链可变区，其中aho位置141被取代成带正电荷氨基酸。[0348]39.如段落35‑38中任一个的抗体轻链，其中所述带正电荷氨基酸是赖氨酸。[0349]40.如段落34的抗体κ轻链可变区，其中aho位置51或aho位置141被取代成带负电荷氨基酸。[0350]41.如段落40的抗体κ轻链可变区，其还包含在aho位置46处被带负电荷氨基酸取代。[0351]42.如段落40或41的抗体κ轻链可变区，其中aho位置51被取代成带负电荷氨基酸。[0352]43.如段落40、41或42的抗体κ轻链可变区，其中aho位置141被取代成带负电荷氨基酸。[0353]44.如段落40‑43中任一个的抗体轻链，其中所述带正电荷氨基酸是赖氨酸。[0354]45.如段落34‑44中任一个的抗体κ轻链可变区，其还包含κ轻链恒定区。[0355]46.如段落45的抗体κ轻链可变区，其中所述κ轻链恒定区包含一个或多个氨基酸添加、缺失或取代。[0356]47.如段落46的分离的抗体κ链可变区，其中取代某一氨基酸以将带正电荷或带负电荷氨基酸引入所述κ轻链恒定区中。[0357]48.如段落47的分离的抗体κ链可变区，其中在eu位置s176处引入所述带正电荷或带负电荷氨基酸。[0358]49.如段落48的分离的抗体κ链可变区，其中eu位置s176被取代成带正电荷氨基酸。[0359]50.如段落49的分离的抗体κ链可变区，其中所述取代是s176k。[0360]51.如段落48的分离的抗体κ链可变区，其中eu位置s176被取代成带负电荷氨基酸。[0361]52.如段落51的分离的抗体κ链可变区，其中所述取代是s176d。[0362]53.一种抗体λ轻链可变区，其在框架区内在aho位置51或141处包含氨基酸取代，其中所述取代在所述位置处将带正电荷或带负电荷氨基酸引入所述λ轻链可变区框架中。[0363]54.如段落53的抗体λ轻链可变区，其还包含λ轻链恒定区。[0364]55.如段落54的抗体λ轻链可变区，其中所述λ轻链恒定区包含一个或多个氨基酸添加、缺失或取代。[0365]56.如段落55的分离的抗体λ链可变区，其中取代某一氨基酸以将带正电荷或带负电荷氨基酸引入所述λ轻链恒定区中。[0366]57.如段落56的分离的抗体λ链可变区，其中在kabat位置s176处引入所述带正电荷或带负电荷氨基酸。[0367]58.如段落57的分离的抗体λ链可变区，其中s176被取代成带正电荷氨基酸。[0368]59.如段落58的分离的抗体λ链可变区，其中所述取代是s176k。[0369]60.如段落57的分离的抗体λ链可变区，其中s176被取代成带负电荷氨基酸。[0370]61.如段落60的分离的抗体λ链可变区，其中所述取代是s176d或s176e。[0371]62.一种分离的核酸，其编码如段落1‑21中任一个的抗体重链可变区、如段落22‑31中任一个的抗体重链、如段落34‑52中任一个的抗体κ轻链可变区、或如段落53‑61中任一个的抗体轻链可变区。[0372]63.一种表达载体，其包含可操作地连接于启动子的如段落62的分离的核酸。[0373]64.一种重组宿主细胞，其包含如段落62的分离的核酸。[0374]65.一种重组宿主细胞，其包含如段落63的表达载体。[0375]66.一种抗原结合蛋白，其包含如段落1‑21中任一个的分离的重链可变区和如段落22‑31或34‑52中任一个的分离的轻链可变区。[0376]67.如段落66的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是包含两个重链和两个轻链的抗体。[0377]68.如段落67的抗原结合蛋白，其中所述抗体是双特异性抗体。[0378]69.一种药物组合物，其包含如段落66‑68中任一个的抗原结合蛋白。实施例[0379]实施例1‑通过硬化蛋白抗体治疗诱导dkk1表达[0380]评估抗硬化蛋白抗体治疗对不同动物模型的骨中的dkk1表达的影响。出乎意料的是在所有动物模型中，在用抗硬化蛋白抗体治疗的动物的全骨提取物中检测到dkk1表达显著增加。在自正常动物、绝经后骨质疏松动物模型和骨折愈合动物模型提取的骨中观测到这个表达增加。在抗硬化蛋白抗体治疗后观测的dkk1表达增加发生在所有三个测试物种(小鼠、大鼠和灵长类动物)中。[0381]示例性研究细节如下：每2周用4.5或22.5mg/kgab‑5(抗硬化蛋白抗体(sab))治疗13岁正常雄性食蟹猕猴(cynomolgusmonkey)总计8周。在研究结束时，以人道方式使动物安乐死，并且收集组织，包括骨。自骨分离rna，并且遵循制造商说明书，使用quantigene分支dna(bdna)测定(affymetrix)和对食蟹猕猴dkk1mrna和持家基因具有特异性的探针组测定dkk1rna表达。图8中说明的数据显示在较低剂量(4.5mg/kg)下肱骨中段中的dkk1表达增加，并且在最高剂量(22.5mg/kg)下dkk1mrna受显著诱导。也在腰椎中观测到dkk1表达增加。数据呈现为相较于持家(hkg)基因hprt的校正表达(+/‑标准偏差)。图8的图上方的括号表示p<0.05(anova)。[0382]本文呈现的数据显示抗硬化蛋白抗体治疗不依赖于疾病的发生诱导dkk1表达，并且可能可适用于包括人的所有物种。诱导dkk1可限制抗硬化蛋白抗体的活性，并且表明抑制硬化蛋白与dkk1两者的治疗剂显示优选活性。此外，dkk1表达增加可充当硬化蛋白抗体治疗的生物标记。[0383]实施例2‑产生接头体[0384]以下实施例描述产生异二聚抗体(具有igg1骨架)，其中使用g4s接头共价连接(a)抗硬化蛋白抗体和(b)抗dkk1抗体的轻链和重链以形成结合硬化蛋白的单一多肽链和结合dkk1的单一多肽链(“接头体”)。接着通过在ch3结构域处进行电荷配对取代(即一个重链含有k392d和k409d取代，并且另一含有e356k和d399k取代)使针对dkk1和硬化蛋白目标的多肽链或半抗体装配成双特异性抗体。电荷配对取代采用本文所述的静电操纵机制，由此通过ch3区中带负电荷残基与带正电荷残基之间的吸引促进异二聚体形成(dkk1ab‑硬化蛋白ab)，并且由于在ch3‑ch3界面的相应区域处具有相同电荷的氨基酸之间的排斥而阻碍同二聚体(两个dkk1ab臂或两个硬化蛋白ab臂)。也在ch1‑cl结构域界面处引入电荷配对取代以降低聚集程度(重链中的s183k/e和轻链中的s176e/k)。此外，一些接头体也在vl‑vh界面处具有工程改造结构域间二硫键以进一步稳定化重链‑轻链相互作用。这通过使重链中的g44(kabat)和轻链中的g100(kabat)取代成半胱氨酸残基来达成。[0385]上述方法导致高度聚集，如通过粒径排阻色谱(sec)所测定。为降低聚集程度，在轻链与重链之间在重链和轻链恒定区(ch1‑cl1)中用电荷配对取代添加或置换g4s接头。预期聚集程度将由于向接头体构建体中添加电荷配对取代而降低。[0386]与ch1‑cl界面中的电荷配对取代组合的接头体设计仍然在若干构建体中产生非所要聚集问题。[0387]实施例3‑产生无接头的异二聚抗体[0388]以下实施例描述产生不具有接头，但代之以在亲本抗体的ch/cl界面与ch3/ch3界面两者中包含电荷配对取代的异二聚抗体。在ch/cl和ch3/ch3界面中包含带电荷取代的所得异二聚抗体在本文中称为异二聚抗体形式1或异ig‑v1。[0389]简要来说，将以下取代引入dkk1抗体6.37.5中：ch3结构域中的k392d(eu)和k409d(eu)取代、ch1结构域中的s183k(eu)取代、和cl结构域中的s176e(eu)取代。将以下取代引入硬化蛋白抗体27h6中：ch3结构域中的e356k(eu)和d399k(eu)取代、ch1结构域中的s183e(eu)取代、和cl结构域中的s176k(eu)取代。igg1骨架用于异二聚形式1设计中。[0390]两种不同抗体的各种输入dna比率用于使igg产量最大，并且使聚集程度(高分子量物质)最小。使用两种抗体的等量dna导致聚集程度最小。[0391]为评估异ig双特异性抗体形成，纯化物质，并且使其经受质谱分析。nr质量分析确认抗体产物具有两个不同轻链和两个不同重链。为确认特定轻链‑重链配对，通过蛋白水解(piercefab微量制备试剂盒)产生fab片段。质量分析仅显示两种物质，一种对应于dkk1抗体重链和轻链配对，并且另一对应于硬化蛋白抗体的重链和轻链配对。质量分析确认存在在硬化蛋白/dkk1异二聚抗体的两臂中均具有正确轻链和重链配对的异二聚抗体。[0392]质量分析指示在纯化样本中存在单一抗体物质，其中观测质量与异二聚抗体的计算质量匹配。所得异二聚抗体具有两个轻链和两个重链，其中异二聚抗体的抗硬化蛋白部分的重链在ch1结构域中具有s183e(eu)取代，并且抗硬化蛋白部分的轻链在cl结构域中具有s176k(eu)取代。异二聚抗体的抗dkk1部分的重链在ch1结构域中具有s183k(eu)取代，并且dkk1部分的轻链在cl结构域中具有s176e(eu)取代。异二聚抗体的抗硬化蛋白部分的ch3结构域具有e356k(eu)和d399k(eu)取代，并且抗dkk1部分的ch3结构域在k392d(eu)和k409d(eu)处具有取代。[0393]在独立成骨细胞wnt活化测定中评估产生的异二聚抗体在硬化蛋白和/或dkk1存在下活化典型wnt信号传导的能力，其中诱导细胞分化，并且以自分泌方式分泌活化wnt信号传导的因子。在测定中，mc3t3‑e1细胞用super‑topflash报道体构建体转染，并且选择并评估稳定细胞系。mc3t3e1/tetonwnt1/荧光素酶是一种使用慢病毒转导，用t细胞因子反应荧光素酶构建体、tet抑制子构建体和多西环素(doxycycline)诱导性wnt‑1构建体工程改造的小鼠成骨细胞细胞系。在多西环素存在下，mc3t3e1/tetonwnt1/luc细胞表达wnt‑1，并且通过wnt‑1结合细胞表面lrp5/6和卷曲受体，从而导致荧光素酶表达来诱导信号转导。当在硬化蛋白和/或dkk1存在下孵育mc3t3e1/tetonwnt1/luc#5细胞时，wnt信号传导由这些蛋白质通过lrp5/6β螺旋桨1基序加以抑制。生物测定测量用固定浓度的硬化蛋白和/或dkk1处理的异二聚抗体和亲本抗体的细胞基报道体测定中的剂量依赖性刺激效应。[0394]克隆c10显示在与纯化硬化蛋白或dkk1蛋白质一起孵育之后，报道体活性由于wnt路径活化受抑制而降低。在扩增培养基(含有10％fbs、1x青霉素‑链霉素‑glu和1.0ug/ml嘌呤霉素(puromycin)的α‑mem培养基)中培养细胞。当细胞达到80％汇合时，将培养基变换成分化培养基“dm”(扩增培养基、50ug/ml抗坏血酸和10mmβ‑甘油磷酸盐)，持续4天。在分化之后，这个细胞系以自分泌方式产生触发典型wnt活化的内源性蛋白质。吸出培养基，并且添加100μl含有各种浓度的单特异性或异二聚抗体(在37℃下与dkk1一起预孵育4小时和/或与硬化蛋白一起预孵育45‑60分钟)的新鲜dm至孔中持续24小时。遵循制造商说明书(promega的荧光素酶测定系统，目录号：e4530)测量荧光素酶活性。测试的各种大鼠和人双特异性抗体能够在硬化蛋白与dkk1两者存在下以剂量依赖性方式活化成骨细胞典型wnt路径，从而进一步显示抗体可同时中和两种可溶性蛋白质的wnt抑制功能。[0395]结果指示根据这个实施例中所述的方法产生的异二聚抗体与接头体(其用作阳性对照)两者均具有极类似活性，从而进一步确认轻链和重链的正确配对。[0396]实施例4‑产生在ch3结构域、ch/cl结构域和vh/vl结构域中具有取代的异二聚抗体。[0397]以下实施例描述产生在ch3、ch/cl和vh/vl结构域中的各个中具有一个或多个取代以进一步有利于轻链和重链的正确配对的异二聚抗体。异二聚抗体的硬化蛋白部分是基于ab‑5和ab‑23，并且dkk1部分是基于抗体6.147和6.37.5。此处使用igg2类别恒定结构域以防止adcc，并且阻碍效应物功能。在vh/vl、ch/cl和ch3/ch3界面中包含带电荷取代的所得异二聚抗体在本文中称为异二聚抗体形式2或异ig‑v2。[0398]当在一种细胞内部共表达两种不同抗体时，转录并翻译四个不同链(hc1、lc1、hc2、lc2)。hc可形成同二聚体(hc1‑hc1)或异二聚体(hc1‑hc2)；lc可与两个不同hc一起随机装配。总计，可存在十种不同组合[paulcarterjimmunologicalmethods248(2001)7‑15]。可通过工程改造ch3区来使非所要重链同二聚体最少以仅形成异二聚体。这个实施例显示不合需要lc/hc配对可通过工程改造lc/hc的界面以增强lc与它们的同源hc的正确配对加以消除。静电操纵机制用于引导lc/hc的配对和装配；相反极性吸引所需复合物亚单位，而同二聚体亚单位的相同极性是排斥性的。[0399]当沿重链和轻链界面选择残基对用于被具有相反极性的带电荷残基(例如asp或lys)置换以控制lc与它的同源hc的正确配对时，应用若干准则：1)所有位置在vl/vh界面与cl/ch1界面两者内均紧密邻近定位；2)所有位置都被包埋，并且在大多数(如果不是全部)不同抗体家族之中充分保守；3)所有位置对表达和抗原结合都具有最小影响；以及4)引入带电荷残基不干扰侣伴蛋白bip在抗体折叠和装配过程中结合ch1区。[0400]在vl/vh和cκ/ch1界面处选择用于工程改造的残基列于表2中。在可变区中，vh中的主要aho位置46(q39kabat)、aho位置51(kabatg44)和aho位置141(kabatq105)分别紧密邻近于vl中的aho位置46(kabatq38)、aho位置141(kabatq100)和aho位置51(kabata43)。在恒定区中，ch1区中的a141(eu)、p171(eu)和s183(eu)分别接触ck中的残基f116(eu)、s162(eu)和s176(eu)，但ch1中的k147(eu)可与ck区中的q124(eu)、s131(eu)或t180(eu)相互作用。[0401]表2：选择位于vh/vl和ch1/cκ界面处的氨基酸残基用于引入电荷配对残基。根据不同编号系统对vh和vl的生殖系残基编号，粗体残基是主要残基。大多数抗体的vh/vl中的接触残基排列在同一行中。人igg1ch1结构域的接触cκ区中的残基的残基也用粗体表示，并且置于同一行中。fw：框架。[0402][0403][0404]异二聚抗体的wnt1驱动的成骨细胞报道体分析显示在dkk1与硬化蛋白两者存在下典型wnt信号传导受强健活化，而对照dkk1抗体(6.37.5、6.147)和对照硬化蛋白抗体(ab‑23)仅部分逆转抑制。[0405]工程改造异二聚抗体能够中和dkk1，并且阻断重组wnt3a诱导的tcf/lef荧光素酶活性，如独立细胞基测定中所见。在这个测定中，在4℃下用100ng/ml重组wnt3a蛋白质(r&dsystems)诱导mc3t3e1/stf‑荧光素酶稳定细胞系中的wnt信号传导30分钟。随后用与对照pbs或异二聚抗体的起始于426.7nm的两倍连续稀释液预混合的0.15ug/ml人dkk1蛋白质处理细胞。如上所述在24小时之后测定荧光素酶信号，并且通过使用prism软件绘制数据。结果指示可变区靶向硬化蛋白的环2区域(即seqidno:1的氨基酸86‑111)与dkk1两者的异二聚抗体能够中和硬化蛋白和dkk1，并且增加由wnt3a驱动的报道体活性。[0406]实施例5‑亲本和异二聚抗体的功能分析[0407]对针对硬化蛋白的环2区域的抗硬化蛋白亲本抗体(ab23、ab5、20c3)和针对非环2表位的抗硬化蛋白亲本抗体(27h6、ab13、ab‑d、ab‑3)的功能分析揭示各组抗体的独特作用机制。进行竞争α筛选结合测定以测量递增浓度的亲本硬化蛋白抗体对含his标签的lrp6与生物素标记的人硬化蛋白之间的相互作用的影响。这个分析揭示当结合硬化蛋白的环2区域的抗硬化蛋白抗体强力抑制硬化蛋白与lrp6之间的相互作用时，针对硬化蛋白的非环2区域的抗体使这些蛋白质之间的相互作用增加。此外，工程改造异二聚抗体显示类似现象，其中不同于针对硬化蛋白的环2区域的异二聚抗体，针对非环2硬化蛋白表位的异二聚抗体(即27h6‑6.37.5、6.147‑27h6)促进lrp6与硬化蛋白的结合增加。发现所有异二聚抗体都与人dkk1竞争结合lrp6。[0408]为了解这个现象对典型wnt路径活化的影响，在使用成骨细胞和293细胞的tcf报道体细胞基测定中研究亲本抗体和异二聚抗体。用结合lrp6β螺旋桨1基序的wnt1或结合lrp6β螺旋桨3基序的wnt3a刺激细胞。典型wnt路径活化通过荧光素酶活性增加加以量度。在测定中，添加硬化蛋白和/或dkk1以抑制报道体活性，并且研究不同抗硬化蛋白或抗dkk1抗体的中和活性。尽管硬化蛋白抑制wnt3a驱动的tcf报道体活化，但抗硬化蛋白非环2区域结合抗体(27h6)而非对照环2结合抗体(ab5和ab23)增强wnt3a信号传导。用含有针对硬化蛋白的非环2区域的抗硬化蛋白可变区的异二聚抗体获得类似wnt3a增强结果。相反，通过硬化蛋白抑制，wnt1活性由任一抗体恢复，如通过不超过未处理对照的荧光素酶活性的荧光素酶活性增加所示。这些影响依赖于硬化蛋白的存在，因为在不存在硬化蛋白下，用针对硬化蛋白的非环2区域的异二聚抗体未观测到增强作用。对其它异二聚抗体的类似分析显示包含结合硬化蛋白的环2的抗硬化蛋白部分的异二聚抗体未能增强wnt3a，而含有结合硬化蛋白的非环2区域的可变区的异二聚抗体增强wnt3a信号传导。此外，包含结合硬化蛋白的非环2区域的可变区的异二聚抗体在dkk1存在下增强wnt3a信号传导，而单特异性非环2异二聚抗体增强作用在dkk1存在下受抑制。在单独dkk1存在下，所有典型wnt活化都受抑制，此与显示dkk1的c末端区域结合lrp6的β螺旋桨3基序，并且阻断wnt3a类别蛋白质与这个区域的相互作用的新近报道(cheng等,naturestructuralmolbiol,2011；anhdevcell2011)一致。这些数据表明通过硬化蛋白结合于β螺旋桨域1的抗体‑配体复合物可以增加wnt3a/β螺旋桨3活性的方式影响受体的构象。先前已报道由抗lrp6β螺旋桨1结合抗体达成的类似wnt3a依赖性增强现象，其中这些抗体增加癌症细胞系中的促有丝分裂性和肿瘤异种移植物的生长(ettenberg等,pnas2010)。[0409]也观测到由非环2结合抗硬化蛋白抗体在非成骨细胞中达成的wnt3a增强作用。这个结果提升硬化蛋白/非环2结合抗体复合物可活化表达lrp6的任何细胞类型中的wnt信号传导的可能性，前提是存在wnt3类别蛋白质或β螺旋桨3结合蛋白，并且不存在dkk1。在异二聚抗体的情况下，增强作用可在dkk1存在下发生。基于这些观测结果，并且为减小非成骨细胞中的促有丝分裂性的风险，用针对环2区域的在wnt1成骨细胞tcf报道体测定中显示使报道体活性强健增加的抗硬化蛋白可变区工程改造新型异二聚抗体。[0410]此外，结合硬化蛋白的非环2区域的亲本抗硬化蛋白抗体不破坏硬化蛋白与它的同源lrp受体的相互作用，并且保持lrp6相互作用或lrp4相互作用。尽管针对硬化蛋白的环2区域的亲本硬化蛋白抗体和异二聚抗体抑制lrp6与硬化蛋白之间的相互作用，但它们在共免疫沉淀实验中未能抑制硬化蛋白与lrp4之间的相互作用。相反，含有抗非环2可变结构域的亲本抗体或异二聚抗体都使lrp4与硬化蛋白之间的结合降低(19d11、27h6、l8和n22)。在igg2骨架中工程改造新型异二聚抗体。[0411]实施例6‑异二聚抗体显示体内活性。[0412]以下实施例显示根据实施例3和4中所述的方法产生的异二聚抗体在低骨矿物质密度的动物模型中使骨矿物质密度增加。[0413]雄性10周龄b6d2f1小鼠用于这个研究中。在研究开始时，将动物分成5组(n＝9/组)，各组在体重与股骨‑胫骨区域处的通过体内dxa获得的骨矿物质密度(bmd)两者方面平衡。每周两次持续3周用媒介物(脯氨酸)或硬化蛋白‑ab(scl‑ab)、或dkk1‑ab或scl‑ab与dkk1‑ab(组合)的组合或异二聚抗体(异ig)皮下注射小鼠。抗体在12.5mg/ml下给药。每周通过体内dxa扫描动物以监测腰椎和股骨‑胫骨区域处药物治疗的骨合成代谢活性。随后在研究结束时使小鼠安乐死。收集股骨以通过μct进行离体密度测定和进行骨强度分析。[0414]图1说明以下异二聚抗体的体内研究设计：(1)ab23‑ab6.147v2，(2)ab5‑ab6.37.5v1，和(3)ab5‑ab6.147v1。ab‑5用作单药疗法对照，并且dvdig6.147‑ab23(描述于国际公布号wo2012/118903中)用作这个研究中的双特异性抗体对照。由于分子量高于单药疗法对照和异二聚抗体，所以dvdig的剂量略微较高(17mg/kg)。此处必须注意异二聚抗体形式针对各目标是单价，而dvd针对各目标是二价。因此，尽管就体积摩尔浓度而言，给药水平使得dvd和异二聚抗体(异ig)相等，但它们在结合位点(互补位)的数目方面不同。[0415]图2比较上述单特异性ig(ab5)、双特异性dvd(6.147‑ab23)和异二聚抗体1、2和3之间的在第3周在小鼠的腰椎和腿中达成的骨物质密度(bmd)增加百分比。[0416]图2中所示的数据明确显示异二聚抗体ab5‑6.37.5v1(异二聚抗体2‑“异ig2”)和785‑6.147v1(异二聚抗体3‑“异ig3”)使骨物质密度增加。然而，在可变结构域界面(vh/vl)中具有额外电荷配对取代的异二聚抗体ab23‑6.147v2(异二聚抗体1‑“异ig1”)不增加bmd。预期在可变结构域中添加其它电荷配对取代将有助于达成轻链和重链的特定配对(例如ab5轻链与ab5重链配对)。但似乎在这个情况下，可变结构域中的其它电荷配对取代导致异二聚抗体的稳定性不良。在这个pd研究之后的pk研究实际上显示异二聚抗体ab23‑6.147的dkk1臂具有不良体内稳定性。[0417]实施例7‑药物动力学数据[0418]进行四种不同药物动力学测定(即硬化蛋白/dkk1测定；硬化蛋白/fc测定；dkk1/硬化蛋白测定；和fc/fc桥式elisa测定)以捕捉并检测血清样本中的异二聚抗体。[0419]硬化蛋白/dkk1测定：简要来说，半区域板用含1μg/ml人硬化蛋白的1×pbs涂布，并且在4℃下孵育过夜。用i‑block缓冲液阻断各板至少1小时。于大鼠血清样本中制备标准物(std)和质量控制样本(qc)。以1:30于缓冲液(1xpbs、1mnacl、0.5％吐温20(tween20)和10mg/mlbsa)中稀释标准物、qc和血清样本。接着将稀释std、qc和样本装载入elisa板中，并且孵育90分钟。接着洗涤elisa板，并且添加含200ng/ml生物素化人dkk1的缓冲液并孵育90分钟。将板洗涤，并且添加200ng/ml结合有hrp的抗生蛋白链菌素(streptavidin)并孵育30分钟。在将板洗涤之后，添加tmb底物。在15分钟之后通过添加1m硫酸终止反应。接着通过spectramax板读取器读取板。[0420]硬化蛋白/fc测定：半区域板用含1μg/ml人硬化蛋白的1×pbs涂布，并且在4℃下孵育过夜。用i‑block缓冲液阻断各板至少1小时。于大鼠血清样本中制备标准物(std)和质量控制样本(qc)。以1:30于缓冲液(1xpbs、1mnacl、0.5％吐温20和10mg/mlbsa)中稀释标准物、qc和血清样本。接着将稀释std、qc和样本装载入elisa板中，并且孵育90分钟。接着洗涤elisa板，并且添加10ng/ml结合有hrp的抗人fc抗体mab1.35.1并孵育90分钟。在将板洗涤之后，添加tmb底物。在15分钟之后通过添加1m硫酸终止反应。接着通过spectramax板读取器读取板。[0421]dkk1/fc测定：半区域板用含1μg/ml人dkk1的1×pbs涂布，并且在4℃下孵育过夜。用i‑block缓冲液阻断各板至少1小时。于大鼠血清样本中制备标准物(std)和质量控制样本(qc)。以1:30于缓冲液(1xpbs、1mnacl、0.5％吐温20和10mg/mlbsa)中稀释标准物、qc和血清样本。接着将稀释std、qc和样本装载入elisa板中，并且孵育90分钟。接着洗涤elisa板，并且添加10ng/ml结合有hrp的抗hufc抗体mab1.35.1并孵育90分钟。在将板洗涤之后，添加tmb底物。在15分钟之后通过添加1m硫酸终止反应。接着通过spectramax板读取器读取板。[0422]fc/fc桥式elisa测定：简要来说，半区域板用含0.2μg/ml抗人fc抗体mab1.35.1的1×pbs涂布并在4℃下孵育过夜。用i‑block缓冲液阻断各板至少1小时。于大鼠血清样本中制备标准物(std)和质量控制样本(qc)。以1:30于缓冲液(1xpbs、1mnacl、0.5％吐温20和10mg/mlbsa)中稀释标准物、qc和血清样本。接着，将稀释std、qc和样本装载入elisa板中，并且孵育90分钟。接着洗涤elisa板，并且添加50ng/ml结合有hrp的抗人fc抗体mab1.35.1并孵育30分钟。在将板洗涤之后，添加tmb底物。在10分钟之后通过添加1m硫酸终止反应。接着通过spectramax板读取器读取板。[0423]图3显示测试的四种硬化蛋白‑dkk1异二聚抗体(即ab23‑6.37.5v1、ab5‑6.37.5v1、ab5‑6.147v2和ab23‑6.147v2)的药物动力学(pk)分布。结果指示在vh/vl结构域中包含带电荷氨基酸取代的异二聚抗体负性影响稳定性，因为基于硬化蛋白/dkk1和dkk1/fc测定的pk分布偏离硬化蛋白/fc和fc/fc测定的pk分布。[0424]实施例8：在产生异二聚抗体期间通过静电操纵机制控制轻链与它的同源重链的正确配对[0425]当在一种细胞内部共表达两种不同抗体时，转录并翻译四个不同链(hc1、lc、hc2、lc2)。hc可形成同二聚体或异二聚体；lc可与两个不同hc一起随机装配。可存在十种不同组合[paulcarterjimmunologicalmethods248(2001)7‑15]。可通过工程改造ch3区来使源于重链同二聚体的非所要副产物最少以仅形成异二聚体。这个实施例显示不合需要lc/hc配对可通过工程改造lc/hc的界面以增强lc与它们的同源hc的正确配对加以消除。静电操纵机制用于引导lc/hc的配对和装配，因为相反极性是吸引性的，而相同极性是排斥性的。[0426]当沿重链和轻链界面选择被具有相反极性的带电荷残基(例如asp或lys)置换以控制lc与它的同源hc的正确配对的残基对时，应用若干准则：1)所有位置在vl/vh界面与cl/ch1界面两者内均紧密邻近定位；2)所有位置都被包埋，并且在大多数(如果不是全部)不同抗体家族之中充分保守；3)所有位置对表达和抗原结合都具有最小影响；以及4)引入带电荷残基不干扰侣伴蛋白bip在抗体折叠和装配过程中结合ch1区。[0427]在vl/vh和cκ/ch1界面处选择用于工程改造her2/egfr异二聚抗体的残基列于表2中。在可变区中，vh中的主要q39(kabat编号；aho位置46)、g44(aho位置51)和q105(aho位置141)分别紧密邻近于vl中的q38(kabat编号；aho位置46)、q100(aho位置141)和a43(aho位置51)。在恒定区中，ch1区中的a141(eu编号)、p171和s183分别接触ck中的残基f116(eu编号)、s162和s176，但ch1中的k147(eu编号)可与ck区中的q124、s131或t180(eu编号)相互作用。[0428]使用来自抗egfr抗体和抗her2抗体的v基因构建概念验证异二聚igg。图4显示构成异二聚抗体变体的不同构造。一个fc链在ch2结构域中具有adcc增强取代s298t+a330m+k334v，并且在ch3结构域中具有异二聚化取代k392d+k409d，而另一fc链在下部铰链区和ch2结构域中具有adcc增强取代l234y+k290y+y296w以及在ch3结构域中具有异二聚化取代e356k+d399k。抗体优先形成当以它们的fab区特异性结合肿瘤细胞时可诱导强烈adcc杀伤性的异二聚体。[0429]表2：选择位于vh/vl和ch1/cκ界面处的氨基酸残基用于引入电荷配对残基。根据不同编号系统对vh和vl的生殖系残基编号，粗体残基是主要残基。大多数抗体的vh/vl中的接触残基排列在同一行中。人igg1ch1结构域的接触cκ区中的残基的残基也用粗体表示，并且置于同一行中。fw：框架。[0430]表2[0431][0432]在一概念验证研究中，将fn3标签(12kda)插入在抗egfrab2hc的n末端处，并且使fn3‑flag‑his6标签(14kda)同框融合于抗egfrab2lc的c末端，因此lc/hc的4种不同组合可在sds‑page凝胶中根据不同尺寸加以区分：所要lc1/hc1::lc2‑fn3‑fh/fn3‑hc2或非所要lc2‑fn3‑fh/hc1::lc1/fn3‑hc2是176kda；非所要lc1/hc1::lc1/fn3‑hc2是162kda；并，并且非所要lc2‑fn3‑fh/hc1::lc2‑fn3‑fh/fn3‑hc2是190kda。176kda产物的组合物随后在部分还原下通过质谱加以确定。双抗原结合板elisa用于筛选具有优选lc/hc配对的有利变体。[0433]研究不同变体(表3)以获得双抗原结合性最高和lc/hc配对正确的最佳组合。当相较于不产生任何结合信号的单特异性抗her2ab1(c01)或抗egfrab2(c07)、和由lc/hc随机配对的四个规则链构成的内部对照c11时，变体1c02、1c04、2a05、2b04、2b05和5d03显示与双抗原(her2和egfr细胞外域)的结合以剂量依赖性方式改进。变体2b05和5d03具有最强烈结合，因为曲线向左移动最多。在sds‑page凝胶中，这些变体也主要形成全长异二聚体igg1。表达测试指示添加调节剂xbp1略微加强异二聚抗体变体的表达水平，而另一调节剂erp23很少加强表达。[0434]表3：通过静电操纵机制制备的变体。呈异二聚igg1形式的抗her2ab1和抗egfrab2的vh/vl和ch1/cl界面的氨基酸变化，其中ab1的hc在ch2结构域中具有s298t+a330m+k334v，并且在ch3结构域中具有k392d+k409d；ab2的hc在下部铰链和ch2结构域中具有l234y+k209y+y296w，并且在ch3结构域中具有e356k+d399k。将fn3标签插入在抗egfrab2hc的n末端处，并且使fn3‑flag‑his6标签同框融合于抗egfrab2lc的c末端。可变区(vh或vl)中的残基是根据kabat编号系统来编号，而恒定区(ch1或cl)中的残基是根据eu编号系统来编号。[0435][0436][0437][0438][0439]通过短暂转染hek2936e细胞来制备变体1c02、1c04、2a05、2b05和5d03，并且用蛋白质a管柱纯化，接着用superdex200粒径排阻管柱精制。自900ml上清液，通过分析型sec获得1.2～6.8mg纯度约100％的最终产物。在非还原sda‑page凝胶中(图4，左侧)，所有变体都具有极主要全长igg1，其中fn3标签插入在抗egfrab2hc的n末端处，并且fn3‑flag‑his6标签同框融合于抗egfrab2lc的c末端。变体2b05和5d03的纯度最大，伴有极少量较小亮带。在还原条件下，归因于它们的不同尺寸分离四个不同链(fn3‑hc2在61kda处；hc1在50kda处；lc2‑fn3‑flag‑his6在36kda处；lc1在23kda处)。四个不同链显示在装配的全长igg1抗体中是1:1:1:1比率。通过质谱确认组分和正确lc/hc配对。[0440]实施例9‑her2/egfr异二聚抗体维持亲本抗体的阻断功能[0441]这个实施例显示实施例7中所述的异二聚抗体维持制备它们所始于的个别抗体的阻断功能。此外，异二聚抗体能够介导针对目标表达性细胞的adcc。[0442]除双抗原结合之外，选择变体2b05和5d03以通过细胞基测试来测试它们的功能性。cho细胞系用人egfr稳定转染。当在培养基中添加配体egf时，cho细胞表面上的受体egfr被活化，并且被磷酸化，从而打开下游信号路径，如mapk、erk1/2、pi3k、jak/stat和pkc。2b05和5d03所源于的抗egfr抗体阻断配体egf结合受体egfr，并且在ic50＝2.7nm下抑制受体egfr磷酸化。抗egfr抗体与抗her2抗体的组合在ic50＝3.2nm下类似地起作用。抗egfr×her2异二聚抗体变体2b05与5d03两者在受体egfr磷酸化方面类似，ic50分别是4.2nm和4.6nm，从而指示异二聚抗体变体2b05和5d03的抗egfrfab臂的作用与野生型抗egfr抗体类似。[0443]bt474是一种人乳房肿瘤细胞系。bt474细胞在表面上表达her2(erb2)与her3(erb3)两者。抗her2抗体可结合her2的结构域iv，从而触发受体内化和降解[wehrmants,等(2006)pnas103(50):19063‑19068以及buschenfeldecm等(2002)cancerres62(8):2244‑2247]。因此，抗体阻断下游信号传导路径[yakesfm,等(2002)cancerres62(14):4132‑4141以及scottiml等(2008)breastcancerrestreat111(2):241‑50]，如raf/mek1和2/erk1和2和pi3k/akt路径。在bt474细胞中，抗her2抗体不降低her2磷酸化但抑制基底her3磷酸化。当不在bt474细胞培养基中添加配体时，单独her2抗体在ic50＝2.8nm下阻断her3磷酸化。抗egfr抗体与抗her2抗体的组合在ic50＝5.2nm下类似地起作用。抗egfr×her2异二聚抗体变体2b05与5d03两者分别在ic50＝3.0nm和ic50＝3.6nm下抑制受体her3基底程度磷酸化，从而指示抗her2臂在起作用。[0444]以上两种不同细胞基测定的组合数据表明抗egfr×her2异二聚抗体变体2b05和5d03的两个臂在抑制egfr和her2的活化方面均恰当地起作用。[0445]实施例10‑her2/egfr异二聚抗体能够介导对肿瘤细胞的adcc杀伤[0446]n87是一种表达高水平her2和中等水平egfr的人胃肿瘤细胞系。无关人igg1用作对照。抗egfr×her2异二聚抗体变体2b05和5d03已在它们的fc区中并入adcc增强取代和异二聚化取代。进行adcc测定以测试异二聚抗体变体是否结合它们的特定抗原，并且诱导对n87细胞的杀伤。在1μg/ml下，无关人igg1对照抗体具有本底溶解30％，并且在它被向下滴定时不显示剂量依赖性反应。变体2b05与5d03两者在1μg/ml浓度下均具有高得多的特异性溶解，并且以ec50分别是0.10pm和0.19pm显示剂量依赖性反应。数据显示异二聚抗体变体2b05和5d03可结合目标egfr和her2，并且通过啮合nk细胞来诱导对n87细胞的强烈杀伤。[0447]实施例11‑替代性变体也可指导正确lc/hc配对[0448]静电操纵可与其它操纵技术组合。举例来说，探究用一对半胱氨酸残基置换vh/vl界面中的一对带电荷残基。所述对半胱氨酸残基紧密邻近界面中的一对带电荷残基。所述对半胱氨酸残基紧密邻近以形成二硫键，因此锁定正确配对的lc/hc。通过短暂转染哺乳动物2936e细胞进行基于变体2b05的电荷配对和cys‑cys配对的七种不同组合(表4)。通过sds‑page凝胶分离上清液。尽管内部对照c11显示介于148kda与250kda之间的四个不同亮带，但变体2c04和2c06主要产生全长igg1；在单独fab臂中的q105c‑a43c和g44c‑g100c处具有不同二硫键的变体2d04仅装配成全长igg1抗体，从而暗示电荷配对残基和半胱氨酸配对残基的组合可合作起作用以制备正确配对并折叠的异二聚抗体。[0449]表4：通过在可变区中组合电荷配对残基和半胱氨酸配对残基制备的变体。可变区(vh或vl)中的残基是根据kabat编号系统来编号，而恒定区(ch1或cl)中的残基是根据eu编号系统来编号。将fn3标签插入在抗egfrab2hc的n末端处，并且使fn3‑flag‑his6标签同框融合于抗egfrab2lc的c末端。[0450][0451]也测试用一对大/小残基置换vh/vl界面中的一对带电荷残基[zamyatninaa(1972)prog.biophos.mol.biol.24:107‑123；chothiac(1975)j.mol.biol.105:1‑14]。大/小残基对可施加钮入孔效应，从而在静电操纵机制的组合中引导正确lc/hc配对。大残基，例如色氨酸(w)具有体积和可及表面积酪氨酸(y)具有体积和可及表面积小残基丙氨酸(a)仅具有体积和可及表面积而丝氨酸(s)类似地具有体积和可及表面积制备、并且通过西方墨点术测试基于异二聚抗体变体2b05的一系列64个变体(表5)。在通过sds‑page凝胶分离之后，变体3a01、3a02、3a03、3a04、3a05、3a06、3b01、3b02、3b03、3b04、8a03和8a04仅显示单一亮带，从而指示四个不同链可装配成全长异二聚抗体。在通过sds‑page凝胶分离之后，其它变体具有多个亮带，表明这些lc在与它们的同源hc配对方面可具有一些问题。[0452]表5.通过在可变区中组合电荷配对残基与大/小配对残基制备的变体。此处大残基表示色氨酸(w)或酪氨酸(y)，而小残基表示丙氨酸(a)或丝氨酸(s)。可变区(vh或vl)中的残基是根据kabat编号系统来编号，而恒定区(ch1或cl)中的残基是根据eu编号系统来编号。将fn3标签插入在抗egfrab2hc的n末端处，并且使fn3‑flag‑his6标签同框融合于抗egfrab2lc的c末端。[0453][0454][0455][0456]实施例12‑在不存在标签下使异二聚抗体最优化[0457]移除抗egfrxher2变体2b05和5d03的标签，并且通过用四种dna转染哺乳动物2936e细胞以制备全长抗体或仅用两种dna转染哺乳动物2936e细胞以评估错配lc/hc配对的耐受性加以测试。当存在所有四个不同链时，两种变体均产生全长抗体，伴有大量半抗体。用编码匹配lc1+hc1或lc2+hc2的两种质粒进行转染也产生全长同二聚体抗体，伴有大量半抗体。当lc2与它们的非同源hc1错误配对(lc2+hc1)时，存在少量产物显示于凝胶中，而当lc1与它的非同源hc2错误配对(lc1+hc2)时，不形成产物。表达测试暗示抗egfr抗体的lc2耐受抗her2抗体的hc1，而抗her2抗体的lc1不耐受抗egfr抗体的hc2。为使静电操纵效应最大，通过在相同空间位置处，但以相反极性引入电荷配对残基来研究一系列新型变体(表6)。lc/hc界面互为相反的，当相同极性残基靠近时是排斥的，或当相反极性残基邻近时是吸引的。[0458]在转录并翻译四个不同链之后，变体v15和v20主要表达为完整抗体。在匹配hc/lc(即lc1+hc1或lc2+hc2)存在下，产生半抗体和同二聚体全长抗体。当错配hc/lc(例如lc2+hc1)被共表达时，未观测到产物，表明lc2不可与hc1相容。然而，lc1由hc2耐受以形成半抗体或同二聚体抗体，从而暗示v15和v20的lc1可与非同源hc2配对，并且得以装配，接着分泌。相反，在转录并翻译四个不同链之后，变体v21、v23和v25主要表达为完整抗体。在两个匹配链(即lc1+hc1或lc2+hc2)存在下，产生完整igg抗体，从而指示lc可与它们的同源hc兼容。在错配lc2+hc1或lc1+hc2存在下，不形成产物，表明lc不耐受非同源hc。变体v22不如同v21、v23和v25一般有效，因为当迫使错配lc与非同源hc配对时观测到次要产物。质谱分析显示变体v12、v21、v23和v25存在四个不同链(lc1+hc1+lc2+hc2)和正确lc/hc配对(lc1+hc1和lc2+hc2)。[0459]表6.呈异二聚igg1形式的抗her2ab1和抗egfrab2的vh/vl和ch1/cl界面的采用相互排斥/吸引机制的氨基酸变化。抗her2ab1的hc在ch2结构域中具有s298t+a330m+k334v，并且在ch3结构域中具有k392d+k409d；抗egfrab2的hc在下部铰链/ch2结构域中具有l234y+k209y+y296w，并且在ch3结构域中具有e356k+d399k。可变区(vh或vl)中的残基是根据kabat编号系统来编号，而恒定区(ch1或cl)中的残基是根据eu编号系统来编号。[0460][0461]实施例13‑最优化egfr/her2异二聚抗体变体显示热稳定性[0462]通过示差扫描热析法(dsc)评估抗egfrigg2、抗her2igg1、抗her2去海藻糖基化igg1和四种抗egfr×her2异二聚抗体变体在相同溶剂条件下的温度诱导展开。各蛋白质的热分析图由2或3个变迁组成。野生型抗her2抗体显示fab/ch3的tm在82℃下，并且ch2的tm在72℃下；抗her2抗体的无海藻糖基化形式不改变单独结构域的tm但使焓略微降低。抗egfr抗体具有类似温度诱导展开分布。所有四种抗egfr×her2异二聚抗体变体都具有略微降低的在68℃下的ch2/ch3tm，因为它们都在ch2结构域中具有adcc增强取代，并且在ch3结构域中具有异二聚化取代。就fab结构域的tm而言，变体v12和v24具有自82℃至72℃的最大显著降低；变体v25具有在72℃和78℃下的两个单独峰，而变体v23具有在78℃下的单一峰。总之，四种异二聚抗体变体显示良好热稳定性。数据表明所选用于在fab区中引入电荷配对残基的位置在某种程度上影响完整异二聚抗体的稳定性，其中单独结构域的tm高于68℃。[0463]实施例14‑靶向同一抗原的两个不同表位的异二聚抗体[0464]为显示制备异二聚抗体的相同方法可应用于不同抗体，自两种不同抗her2抗体产生异二聚igg。一种抗体结合her2的结构域iv而另一结合her2的结构域ii。通过用四种dna转染以制备全长抗体或仅用两种dna转染以评估错配lc/hc配对的耐受性来测试以相反方式引入vh/vl中的两对电荷残基和ch1/cl中的一对电荷残基的变体v23(表6)。类似于抗egfrxher异二聚抗体变体v23，在翻译并装配四个不同链之后，抗her2xher2异二聚抗体v23主要表达为完整抗体。在两个匹配链(即lc1+hc1或lc2+hc2)存在下，产生半抗体和同二聚体抗体，从而指示lc可与它们的同源hc兼容。在错配链lc2+hc1或lc1+hc2存在下，完全不形成产物，表明lc不耐受它们的非同源hc。[0465]实施例15‑带电荷残基的不同组合影响异二聚抗体表达和lc/hc配对[0466]为研究电荷残基的不同组合是否产生不同表达水平或影响lc/hc配对，通过在相同位置处以不同组合引入电荷配对残基(表7)来制备若干抗her2xher2异二聚抗体变体。尽管v23b如同v23a一般具有正确lc/hc配对，但完整抗体或半抗体形式的表达水平下降。然而，v23c和v23d耐受lc/hc错配。总之，这组数据表明静电操纵不是指导正确lc/hc配对的唯一因素；如形状互补性的其它机制可在过程中起作用。[0467]表7.在vh/vl和ch1/cl界面的相同位置处的不同电荷配对组合的比较。可变区(vh或vl)中的残基是根据kabat编号系统来编号，而恒定区(ch1或cl)中的残基是根据eu编号系统来编号。抗her2ab1的hc在ch2结构域中具有adcc增强取代s298t+a330m+k334v，并且在ch3结构域中具有异二聚化变化k392d+k409d；抗her2ab2的hc在下部铰链/ch2结构域中具有adcc增强取代l234y+k209y+y296w，并且在ch3结构域中具有异二聚化变化e356k+d399k。[0468][0469]实施例16‑稳定性和粘度研究[0470]对包含本文所述的代表性异二聚抗体的组合物进行稳定性研究，并且将抗体组合物的特征与类似dvd(双可变结构域)抗体组合物进行比较。抗体样本于a52su制剂(即10mm乙酸盐、9％蔗糖，ph5.2)中储存在4℃或40℃下两周或两个月的时期。使用例如se‑hplc、cex‑hplc、hiac(次可见粒子)和目视检查将抗体聚集测量为稳定性的替代物。结果以单体峰的百分比形式(即100％将指示未观测到聚集)概述于表8中。[0471]表8[0472][0473]如通过表8中所述的结果所显示，相较于当储存在类似条件下时a52su中11％‑85％的dvd抗体形成聚集体的测试dvd抗体，当在40℃下储存两周时，a52su中小于5％的异ig抗体形成聚集体。当在4℃下储存两周时，小于1％的测试异ig抗体形成聚集体。[0474]进行单独研究以研究a52su制剂中的dvd和异二聚抗体的粘度与不同浓度(70mg/ml或150mg/ml)之间的关系。使用具有锥/板几何尺寸的流变仪(rviii+型，brookfieldengineeringlabs,inc.,middleboro,mass.)测量粘度。在测量期间用水浴维持样本温度在25℃下。主轴速度在15至125rpm的范围内，增量是10rpm。用rheocalctm软件2.7版进行数据收集。于a52su制剂中测试的各种抗体的粘度测量结果以下提供于表9中。[0475]表9[0476][0477]如表9中所示，包含测试异二聚抗体或dvd抗体(70mg/ml)中的一个的各组合物的粘度小于6cp。当异二聚抗体在浓度150mg/ml下存在于组合物中时，三种组合物的粘度小于17cp。与异二聚抗体制剂不同，当dvd抗体在浓度150mg/ml下存在时，仅一种dvd抗体制剂的粘度小于16cp。[0478]上述实施例显示本文所述的异二聚抗体比测试的双特异性dvd抗体更稳定(即当在4℃下储存两周时，组合物中小于1％的抗体形成聚集体)。包含所述异二聚抗体的制剂也满足优选粘度规范，并且因此特别适于大规模制造。[0479]实施例17‑靶向硬化蛋白和dkk1的异二聚抗体促进灵长类动物中的骨合成代谢[0480]为显示靶向硬化蛋白和dkk1的异二聚抗体促进灵长类动物中的骨合成代谢，在40只未处理4至6岁雌性食蟹猕猴中进行9周pk/pd研究。将动物分成三组，各组施用不同异二聚抗体。[0481]每两周向各组动物施用总计三次剂量(第1天和第15天施用iv剂量25mg/kg，随后在第43天施用一次25mg/kg皮下剂量)。历经研究的过程数次抽取血液。短暂离心、等分，并且冷冻血清以供随后分析。对照包括未治疗动物和用单一抗硬化蛋白抗体(ab‑5)或针对硬化蛋白和dkk1的中和异二聚抗体(形式1)或针对硬化蛋白和dkk1的双可变结构域(dvd)抗体(6.147‑abl‑ab23)治疗的动物。在基线时使用血清骨形成标记测量结果(cicp、bsap和骨钙蛋白)和体重将所有动物随机分组。[0482]收集初始40个动物的血清样本以进行预筛选骨转换标记(btm)评估。选择23个动物，并且基于平衡的生物标记分布和体重分配至治疗组中。在基线(bl)预筛选时，各组之间在所有btm浓度方面都不存在显著差异(表10)。[0483]表10.在bl预筛选时的血清btm蛋白质浓度[0484][0485]绝对血清酒石酸抗性酸性磷酸酶5b(tracp5b)数据显示于表11中。tracp是一种由骨再吸收破骨细胞以高量表达的酶。已显示tracp5b适用作破骨细胞数目和骨再吸收的标记。参见halleen等,clin.lab.,52:499‑509,2006，其公开内容以引用的方式整体并入本文。对相对于给药前的tracp5b变化百分比的分析(表11和图9)揭示dvd抗体6.147‑abl‑ab23和异二聚抗体ab‑23‑6.37.5治疗在第5天和第7天导致tracp5b显著降低(相较于ab‑5治疗的动物)。[0486]表11.血清tracp5b(自第1天给药前开始的变化％)[0487][0488]相较于组1，*p<0.05，**p<0.01[0489]相较于ab‑5治疗的动物，在研究的第36、43和57天，异二聚抗体ab‑5‑6.147的血清骨钙蛋白(oc)浓度(表12和图10)显著较高。对相对于给药前的血清oc变化的分析(表10和图9)揭示异二聚抗体ab‑23‑6.37.5治疗导致这个分析物持续自第21天至第45天的测试时间点显著升高。相较于ab‑5‑6.147治疗的动物，用异二聚抗体ab‑5‑6.147治疗导致自第21天至第43天和在第50天和第57天oc显著增加。[0490]表12.血清oc(自第1天给药前开始的变化％)[0491][0492]相较于组1，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001[0493]分析血清骨碱性磷酸酶(bap)超过给药前的变化百分比，其结果显示于表13和图11中。结果指示在第5天，异二聚抗体ab‑23‑6.37.5治疗的动物中的bap显著升高(相对于ab‑5组)。[0494]表13.血清bap(自第1天给药前开始的变化％)[0495][0496]相较于组1，*p<0.05，***p<0.001[0497]血清c1cp数据呈现于表14中。相较于ab‑5治疗的动物，在第14天，dvd抗体6.147‑abl‑ab23治疗组具有超过给药前的显著较低c1cp变化百分比(表14和图12)。[0498]表14.血清c1cp(自第1天给药前开始的变化％)[0499][0500]相较于组1，*p<0.05[0501]在对照与ab‑5治疗的动物之间，跨越测量的所有时间点，绝对血清dkk1浓度以及相对于给药前的变化百分比(表17)不显著不同。[0502]表17.未处理雌性食蟹猕猴持续研究的持续时间的dkk1于血清中的浓度和自第1天给药前开始的变化％[0503][0504]总之，相较于ab‑5治疗，dvd抗体6.147‑abl‑ab23治疗在第5天(p<0.01)和第7天(p<0.05)短暂降低血清tracp5b(就相对于给药前的变化百分比而言)。相较于ab‑5治疗的动物，在第14天，dvd抗体6.147‑abl‑ab23治疗组中的c1cp(就相对于给药前的变化百分比而言)显著降低(p<0.05)。血清oc和bap浓度不受dvd抗体6.147‑abl‑ab23治疗影响。[0505]相较于单独ab‑5治疗，在第5天和第7天，异二聚抗体ab‑23‑6.37.5治疗也显著降低血清tracp5b(就自给药前开始的变化百分比而言)(p<0.05)。相较于ab‑5治疗组，在第5天，用异二聚抗体ab‑23‑6.37.5治疗的动物显示bap显著较高(就相对于给药前的变化百分比而言)(p<0.05)，但未见oc和c1cp水平有显著差异。[0506]相较于单独ab‑5治疗，用异二聚抗体ab‑5‑6.37.5治疗在评估的任何时间点都对血清trap5b、bap或cicp无影响。然而，相较于ab‑5治疗组，在第21天(p<0.05)、第28天(p<0.05)、第36天(p<0.01)、第43天(p<0.001)和第45天(p<0.05)，异二聚抗体ab‑5‑6.37.5治疗组中的oc(就相对于给药前的变化百分比而言)显著增加。[0507]类似地，相对于单独ab‑5治疗，trapcp5b、bap和c1cp浓度不受异二聚抗体ab‑5‑6.147治疗影响。相较于ab‑5治疗组，在第36天(p<0.05)、第43天(p<0.05)和第57天(p<0.01)，这个组中的血清oc浓度显著升高。相较于ab‑5治疗组，在第21天、第28天、第36天(分别p<0.05)、第43天(p<0.001)、第50天和第57天(分别p<0.01)，ab‑5‑6.147治疗组中的就相对于给药前的变化百分比而言的血清oc显著增加。[0508]在对照与ab‑5治疗的动物之间，跨越评估的所有时间点，血清dkk1浓度不显著不同。[0509]这个实施例中提供的这些数据显示针对dkk1和硬化蛋白的异二聚抗体具有与亲本abab‑5类似的igg样药物动力学性质，并且在于食蟹猕猴中施药之后导致特定骨形成标记出众增加。在非人灵长类动物和啮齿动物中观测的双重dkk1和硬化蛋白抑制效应强调异二聚抗体治疗骨病症的治疗功效。[0510]实施例18‑异二聚抗体的药物动力学性质[0511]在研究中表征三种异二聚抗体(ab23‑6.37.5v.1、ab‑5‑6.37.5v.1和ab‑5‑6.147v.1)的药物动力学(pk)分布。[0512]将食蟹猕猴分成通过在第1天和第15天静脉内施药和在第43天皮下施药来接受25mg/kgab‑5(组1)、34.4mg/kgdvd抗体6.147‑abl‑ab23(组2)、或25mg/kgab‑23‑6.37.5.v.1(组3)、ab‑5‑6.37.5.v.1(组4)或ab‑5‑6.147.v.1(组5)中的各个的5个治疗组。在第1研究日开始收集662个血清样本(历经64天)以供pk分析，其中也在第15和43研究日获取样本。[0513]使用如上在实施例7中所述的四种不同酶联免疫吸附测定(elisa)(硬化蛋白/dkk1测定；硬化蛋白/fc测定；dkk1/硬化蛋白测定；和fc/fc桥式elisa测定)分析血清样本。使用利用一对针对ab‑5的抗个体基因型抗体进行的elisa来分析来自组1的在完整ab‑5浓度的情况下的血清样本。使用以下两种不同elisa分析来自组2的血清样本：一种用以测量完整抗dkk1mab，并且一种用以测量总mab浓度。使用以下三种不同elisa分析来自组3、4和5的血清样本：一种用以测量完整抗dkk1mab，一种用以测量完整抗硬化蛋白(sost)mab，并且一种用以测量总mab浓度。通过elisa测定完整(dkk1)血清mab浓度，其中重组人dkk1和抗人fc分别用作捕捉试剂和检测试剂。通过elisa测定完整(sost)血清mab浓度，其中重组人sost和抗人fc用作捕捉试剂和检测试剂。另外，通过elisa测定总血清mab浓度，其中一对抗人iggfc抗体用作捕捉试剂和检测试剂。[0514]三种异二聚抗体和阳性对照的pk分布描绘于图13中，并且由第一iv剂量资料获得的pk参数以下概述于表18中。[0515]表18.ab23‑6.37.5v.1、ab‑5‑6.37.5v.1和ab‑5‑6.147v.1异ig候选物在食蟹猕猴中的由第1iv剂量间隔获得的pk参数估计值。[0516][0517]这个研究中的5只猴产生针对不同mab的结合性抗药物抗体(ada)，其使药物暴露量降低；因此自分析排除这些受试者。异二聚抗体ab‑5‑6.37.5v.1、ab‑5‑6.147v.1和ab23‑6.37.5v.1的终末半衰期(t1/2)分别估计为5.5、3.5和3.2天。ab‑5‑6.37.5v.1的暴露量与ab‑5类似(auc0‑无穷‑18.4天*μm相较于18.0天*μm)，而相较于ab‑5，其它两种异ig的暴露量降低约25‑30％。三种异ig的生物可用度(f)类似，在78‑83％的范围内。[0518]实施例19‑其它体内实验[0519]在10周龄完整小鼠中进行三周研究以比较异二聚抗体(ab‑5‑6.37.5.v.1)与亲本abdkk1ab6.37.5和ab‑5中的各个以及与两种亲本抗体(igg)的组合的骨合成代谢活性(每组n＝6)。鉴于异二聚抗体是硬化蛋白和dkk1的单价抑制剂，评估两个剂量的异二聚抗体(即25mg/kg和12.5mg/kg)以相对于用作对照的二价分子衡量价数对生物活性的影响。[0520]一周两次在12.5mg/kg下用单药疗法(ab‑5和dkk1ab6.37.5，分开施用)和异二聚抗体疗法各自皮下给药，并且在对照组中类似地施用dkk1ab(6.37.5，12.5mg/kg)加抗硬化蛋白ab(ab‑5，12.5mg/kg)的组合。此外，用异二聚抗体在25mg/kg下给药以相对于研究中使用的二价对照校正价数。一周一次通过dxa测量骨矿物质密度。[0521]图14中说明的结果显示由异二聚抗体治疗介导的腰椎骨物质增加显著优于两种单药疗法。用降低剂量的异二聚抗体观测的骨合成代谢活性不显著不同于在用组合疗法治疗的小鼠中测量的骨合成代谢活性。较高剂量的异二聚抗体略微优于组合疗法，但这个差异不显著。在股骨中观测到类似骨物质增加(数据未显示)。[0522]相较于用单独抗硬化蛋白抗体或抗dkk1抗体进行的治疗，在啮齿动物中观测的同时双重dkk1和硬化蛋白抑制强调异二聚抗体治疗骨病症的治疗功效。[0523]本发明的一些实施方案如下：[0524]1.一种结合硬化蛋白的包含seqidno:1的氨基酸86‑111的区域的抗体，其中所述抗体在以下各结构域中包含取代：第一ch3结构域、第二ch3结构域、ch1结构域和cl结构域，[0525]其中所述一个或多个取代引入在静电方面不利于同二聚体形成，并且在静电方面有利于异二聚体形成的带电荷氨基酸。[0526]2.一种结合硬化蛋白的包含seqidno:1的氨基酸86‑111的区域的抗体，其中所述抗体包含具有包含一个或多个氨基酸取代的ch3结构域的重链，其中所述一个或多个取代引入在静电方面不利于同二聚体形成，并且在静电方面有利于异二聚体形成的带电荷氨基酸。[0527]3.如实施方案2所述的抗体，其中所述ch3结构域中的带负电荷氨基酸被带正电荷氨基酸取代。[0528]4.如实施方案3所述的抗体，其中所述带负电荷氨基酸在eu位置d399、e356或e357处。[0529]5.如实施方案3所述的抗体，其中eu位置d399、e356和e357处的所述带负电荷氨基酸各自被带正电荷氨基酸取代。[0530]6.如实施方案3或实施方案5所述的抗体，其中所述带正电荷氨基酸是赖氨酸。[0531]7.如实施方案3所述的抗体，其中所述ch3结构域中的正电荷氨基酸被带负电荷氨基酸取代。[0532]8.如实施方案7所述的抗体，其中所述带正电荷氨基酸在eu位置k370、k392或k409处。[0533]9.如实施方案7所述的抗体，其中eu位置k370、k392和k409处的所述带正电荷氨基酸各自被带负电荷氨基酸取代。[0534]10.如实施方案7或实施方案9所述的抗体，其中所述带负电荷氨基酸是天冬氨酸。[0535]11.如前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含一组六个选自由以下组成的组的cdr：a)cdr序列seqidno:54、55和56以及cdr序列seqidno:51、52和53；b)cdr序列seqidno:60、61和62以及cdr序列seqidno:57、58和59；c)cdr序列seqidno:48、49和50以及cdr序列seqidno:45、46和47；d)cdr序列seqidno:42、43和44以及cdr序列seqidno:39、40和41；e)cdr序列seqidno:275、276和277以及cdr序列seqidno:287、288和289；f)cdr序列seqidno:278、279和280以及cdr序列seqidno:290、291和292；g)cdr序列seqidno:78、79和80以及cdr序列seqidno:245、246和247；h)cdr序列seqidno:81、idno:290、291和292；g)cdr序列seqidno:78、79和80以及cdr序列seqidno:245、246和247；h)cdr序列seqidno:81、99和100以及cdr序列seqidno:248、249和250；i)cdr序列seqidno:101、102和103以及cdr序列seqidno:251、252和253；j)cdr序列seqidno:104、105和106以及cdr序列seqidno:254、255和256；k)cdr序列seqidno:107、108和109以及cdr序列seqidno:257、258和259；l)cdr序列seqidno:110、111和112以及cdr序列seqidno:260、261和262；m)cdr序列seqidno:281、282和283以及cdr序列seqidno:293、294和295；n)cdr序列seqidno:113、114和115以及cdr序列seqidno:263、264和265；o)cdr序列seqidno:284、285和286以及cdr序列seqidno:296、297和298；p)cdr序列seqidno:116、237和238以及cdr序列seqidno:266、267和268；q)cdr序列seqidno:239、240和241以及cdr序列seqidno:269、270和271)cdr序列seqidno:242、243和244以及cdr序列seqidno:272、273和274；或s)cdr序列seqidno:351、352和353以及cdr序列seqidno:358、359和360。[0544]18.如实施方案15或实施方案16所述的异二聚抗体，其中所述硬化蛋白结合部分包含一组六个选自由以下组成的组的cdr：a)cdr‑l1seqidno:284、cdr‑l2seqidno:285、cdr‑l3seqidno:286、cdr‑h1seqidno:296、cdr‑h2seqidno:297和cdr‑h3seqidno:298；b)cdr‑l1seqidno:48、cdr‑l2seqidno:49、cdr‑l3seqidno:50、cdr‑h1seqidno:45、cdr‑h2seqidno:46和cdr‑h3seqidno:47；或c)cdr‑l1seqidno:42、cdr‑l2seqidno:43、cdr‑l3seqidno:44、cdr‑h1seqidno:39、cdr‑h2seqidno:40和cdr‑h3seqidno:41。[0545]19.如实施方案15或实施方案16所述的异二聚抗体，其中所述硬化蛋白结合部分包含含有cdr‑h1seqidno:269、cdr‑h2seqidno:270、cdr‑h3seqidno:271、cdr‑l1seqidno:239、cdr‑l2seqidno:240和cdr‑l3seqidno:241的重链和轻链。[0546]20.如实施方案15或实施方案16所述的异二聚抗体，其中所述第一轻链包含选自由以下组成的组的可变区氨基酸序列：seqidno:364、seqidno:376、seqidno:75、seqidno:384、seqidno:388、seqidno:380、seqidno:299、seqidno:303、seqidno:314、seqidno:311、seqidno:315和seqidno:368。[0547]21.如实施方案15或实施方案16所述的异二聚抗体，其中所述第一重链包含选自由以下组成的组的可变区氨基酸序列：seqidno:366、seqidno:378、seqidno:77、seqidno:386、seqidno:390、seqidno:382、seqidno:301、seqidno:305、seqidno:327、seqidno:313、seqidno:317和seqidno:370。[0548]22.如实施方案15‑21中任一项所述的异二聚抗体，其中所述dkk1结合部分包含一组六个选自由以下组成的组的cdr：(a)seqidno:820‑825，(b)seqidno:828‑833，(c)seqidno:836‑841，(d)seqidno:844‑849，(e)seqidno:852‑857，(f)seqidno:860‑865，(g)seqidno:868‑873，(h)seqidno:876‑881，(i)seqidno:884‑889，(j)seqidno:892‑897，(k)seqidno:900‑905，(l)seqidno:908‑913，(m)seqidno:916‑921，(n)seqidno:924‑929，(o)seqidno:932‑937，(p)seqidno:940‑945，(q)seqidno:948‑953，(r)seqidno:956‑961，(s)seqidno:964‑969，(t)seqidno:972‑977，(u)seqidno:980‑985，(v)seqidno:988‑993，(w)seqidno:996‑1001，和(x)seqidno:1004‑1009。[0549]23.如实施方案15‑21中任一项所述的异二聚抗体，其中所述dkk1结合部分包含一组六个选自由以下组成的组的cdr：seqidno:980‑985和seqidno:1004‑1009。[0550]24.如实施方案15‑21中任一项所述的异二聚抗体，其中所述第二轻链包含选自由以下组成的组的可变区氨基酸序列：seqidno:818、seqidno:826、seqidno:834、seqidno:842、seqidno:850、seqidno:866、seqidno:874、seqidno:882、seqidno:890、seqidno:898、seqidno:906、seqidno:814、seqidno:822、seqidno:830、seqidno:938、seqidno:946、seqidno:954、seqidno:962、seqidno:970、seqidno:978、seqidno:988、seqidno:994和seqidno:1002。[0551]25.如实施方案15‑21中任一项所述的异二聚抗体，其中所述第二重链包含选自由以下组成的组的可变区氨基酸序列：seqidno:819、seqidno:827、seqidno:835、seqidno:843、seqidno:851、seqidno:859、seqidno:867、seqidno:875、seqidno:883、seqidno:891、seqidno:899、seqidno:907、seqidno:915、seqidno:923、seqidno:931、seqidno:939、seqidno:947、seqidno:955、seqidno:963、seqidno:971、seqidno:979、seqidno:987、seqidno:995和seqidno:1003。[0552]26.一种结合硬化蛋白和dkk‑1的异二聚抗体，其包含[0553]第一重链，所述第一重链包含选自由seqidno:378和366组成的组的可变区氨基酸序列，并且在所述第一重链的eu位置183、356和399处包含氨基酸取代；[0554]第二重链，所述第二重链包含选自由seqidno:1003和974组成的组的可变区氨基酸序列，并且在所述第二重链的eu位置183、392和409处包含氨基酸取代；[0555]第一轻链，所述第一轻链包含选自由seqidno:376和364组成的组的可变区氨基酸序列，并且在所述第一轻链的eu位置176处包含氨基酸取代；以及[0556]第二轻链，所述第二轻链包含选自由seqidno:1002和978组成的组的可变区氨基酸序列，并且在所述第二轻链的eu位置176处包含氨基酸取代；[0557]其中所述氨基酸取代在所述位置处引入带电荷氨基酸。[0558]27.一种结合硬化蛋白和dkk‑1的异二聚抗体，其包含[0559](a)含有seqidno:1038中所述的氨基酸序列的第一重链；含有seqidno:1034中所述的氨基酸序列的第二重链；含有seqidno:1039中所述的氨基酸序列的第一轻链以及含有seqidno:1035中所述的氨基酸序列的第二轻链；[0560](b)含有seqidno:1038中所述的氨基酸序列的第一重链；含有seqidno:1036中所述的氨基酸序列的第二重链；含有seqidno:1039中所述的氨基酸序列的第一轻链以及含有seqidno:1037中所述的氨基酸序列的第二轻链；[0561](c)含有seqidno:1040中所述的氨基酸序列的第一重链；含有seqidno:1034中所述的氨基酸序列的第二重链；含有seqidno:1041中所述的氨基酸序列的第一轻链以及含有seqidno:1035中所述的氨基酸序列的第二轻链；[0562](d)含有seqidno:1040中所述的氨基酸序列的第一重链；含有seqidno:1036中所述的氨基酸序列的第二重链；含有seqidno:1041中所述的氨基酸序列的第一轻链以及含有seqidno:1037中所述的氨基酸序列的第二轻链；[0563](e)含有seqidno:1046中所述的氨基酸序列的第一重链；含有seqidno:1042中所述的氨基酸序列的第二重链；含有seqidno:1047中所述的氨基酸序列的第一轻链以及含有seqidno:1043中所述的氨基酸序列的第二轻链；[0564](f)含有seqidno:1046中所述的氨基酸序列的第一重链；含有seqidno:1044中所述的氨基酸序列的第二重链；含有seqidno:1047中所述的氨基酸序列的第一轻链以及含有seqidno:1045中所述的氨基酸序列的第二轻链；[0565](g)含有seqidno:1048中所述的氨基酸序列的第一重链；含有seqidno:1042中所述的氨基酸序列的第二重链；含有seqidno:1049中所述的氨基酸序列的第一轻链以及含有seqidno:1043中所述的氨基酸序列的第二轻链；或[0566](h)含有seqidno:1048中所述的氨基酸序列的第一重链；含有seqidno:1044中所述的氨基酸序列的第二重链；含有seqidno:1049中所述的氨基酸序列的第一轻链以及含有seqidno:1045中所述的氨基酸序列的第二轻链。[0567]28.一种结合硬化蛋白和dkk‑1的异二聚抗体，其包含：[0568](a)含有选自由seqidno:1038、seqidno:1046、seqidno:1040和seqidno:1048组成的组的氨基酸序列的重链，任选还包含选自由seqidno:1039、seqidno:1047、seqidno:1041和seqidno:1049组成的组的轻链氨基酸序列；或[0569](b)含有选自由seqidno:1034、seqidno:1042、seqidno:1036和seqidno:1044组成的组的氨基酸序列的重链，任选还包含选自由seqidno:1035、seqidno:1043、seqidno:1037和seqidno:1045组成的组的轻链氨基酸序列。[0570]29.一种异二聚抗体或其片段，其在以下各结构域中包含一个或多个取代：第一ch3结构域、第二ch3结构域、ch1结构域、cl结构域、vh结构域和vl结构域，[0571]其中所述一个或多个取代引入在静电方面不利于同二聚体形成，并且在静电方面有利于异二聚体形成的带电荷氨基酸。[0572]30.如实施方案29所述的异二聚抗体或其片段，其中所述第一ch3结构域或所述第二ch3结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型人igg氨基酸序列中的一个或多个带正电荷氨基酸被一个或多个带负电荷氨基酸置换。[0573]31.如实施方案29所述的异二聚抗体或其片段，其中所述第一ch3结构域或所述第二ch3结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型人igg氨基酸序列中的一个或多个带负电荷氨基酸被一个或多个带正电荷氨基酸置换。[0574]32.如实施方案29所述的异二聚抗体或其片段，其中所述ch1结构域或所述cl结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型igg氨基酸序列中的一个或多个带正电荷氨基酸被一个或多个带负电荷氨基酸置换。[0575]33.如实施方案29所述的异二聚抗体或其片段，其中所述ch1结构域或所述cl结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型igg氨基酸序列中的一个或多个带负电荷氨基酸被一个或多个带正电荷氨基酸置换。[0576]34.如实施方案29所述的异二聚抗体或其片段，其中所述vh结构域或所述vl结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型igg氨基酸序列中的一个或多个带正电荷氨基酸被一个或多个带负电荷氨基酸置换。[0577]35.如实施方案29所述的异二聚抗体或其片段，其中所述vh结构域或所述vl结构域包含不同于野生型igg氨基酸序列的氨基酸序列以使野生型igg氨基酸序列中的一个或多个带负电荷氨基酸被一个或多个带正电荷氨基酸置换。[0578]36.如实施方案29‑35中任一项所述的异二聚抗体或其片段，其中所述带正电荷氨基酸是选自由赖氨酸、组氨酸和精氨酸组成的组。[0579]37.如实施方案29‑35中任一项所述的异二聚抗体或其片段，其中所述带负电荷氨基酸是选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组。[0580]38.如实施方案29所述的异二聚抗体或其片段，其中所述第一ch3结构域包含用带正电荷氨基酸置换谷氨酸。[0581]39.如实施方案38所述的异二聚抗体或其片段，其中所述谷氨酸是glu356。[0582]40.如实施方案29所述的异二聚抗体或其片段，其中所述第一ch3结构域包含用带负电荷氨基酸置换天冬氨酸。[0583]41.如实施方案40所述的异二聚抗体或其片段，其中所述天冬氨酸是asp356和asp399。[0584]42.如实施方案29所述的异二聚抗体或其片段，其中所述第二ch3结构域包含用带负电荷氨基酸置换赖氨酸。[0585]43.如实施方案42所述的异二聚抗体或其片段，其中所述赖氨酸是选自由lys392、lys409、lys439和lys370组成的组。[0586]44.如实施方案29所述的异二聚抗体或其片段，其中所述ch1结构域包含用带负电荷氨基酸置换丝氨酸。[0587]45.如实施方案44所述的异二聚抗体或其片段，其中所述丝氨酸是ser183。[0588]46.如实施方案29所述的异二聚抗体或其片段，其中所述cl结构域包含用带正电荷氨基酸置换丝氨酸。[0589]47.如实施方案46所述的异二聚抗体或其片段，其中所述丝氨酸是ser176。[0590]48.如实施方案29所述的异二聚抗体或其片段，其中所述vh结构域包含用带负电荷氨基酸置换谷氨酰胺。[0591]49.如实施方案48所述的异二聚抗体或其片段，其中所述谷氨酰胺是gln38(kabat位置38、aho位置46)。[0592]50.如实施方案29所述的异二聚抗体或其片段，其中所述vl结构域包含用带正电荷氨基酸置换谷氨酰胺。[0593]51.如实施方案50所述的异二聚抗体或其片段，其中所述谷氨酰胺是gln39(kabat位置39、aho位置46)。[0594]52.如实施方案29‑51中任一项所述的异二聚抗体或其片段，其是选自由抗体、双特异性抗体、单特异性单价抗体、双特异性大抗体、单域抗体、肽体、双特异性肽体、单价肽体和受体融合蛋白组成的组。[0595]53.一种异二聚抗体或其片段，其包含含有以下的重链：[0596](a)在选自由aho位置42‑50组成的组的aho位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第一氨基酸取代，[0597](b)在选自由位置126‑213(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第二氨基酸取代，[0598](c)在选自由位置352‑360(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第三氨基酸取代，和[0599](d)在选自由位置395‑403(eu编号)组成的组的位置处的引入带电荷氨基酸的第四氨基酸取代，[0600]其中(a)的所述带电荷氨基酸与(b)的所述带电荷氨基酸具有相同电荷，并且[0601]其中(c)和(d)的所述带电荷氨基酸具有(a)和(b)的所述带电荷氨基酸的相反电荷。[0602]54.如实施方案52所述的异二聚抗体或其片段，其中所述第一氨基酸取代在aho位置46处，所述第二氨基酸取代在eu位置183处，所述第三氨基酸取代在eu位置356处，并且所述第四氨基酸取代在eu位置399处。[0603]55.如实施方案53所述的异二聚抗体或片段，其中aho位置46处的谷氨酰胺被谷氨酸置换，eu位置183处的丝氨酸被谷氨酸置换，eu位置356处的谷氨酸被赖氨酸置换，并且eu位置399处的天冬氨酸被赖氨酸置换。[0604]56.一种抗体或其片段，其包含含有以下的重链：[0605](a)在选自由aho位置35‑43组成的组的aho位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第一氨基酸取代，[0606](b)在选自由位置126‑213(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第二氨基酸取代，[0607](c)在选自由位置388‑398(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第三氨基酸取代，和[0608](d)在选自由位置404‑413(eu编号)组成的组的位置处的引入带电荷氨基酸的第四氨基酸取代，[0609]其中(c)和(d)的所述带电荷氨基酸具有(a)和(b)的所述带电荷氨基酸的相反电荷。[0610]57.如实施方案56所述的异二聚抗体或其片段，其中所述第一氨基酸取代在aho位置46处，所述第二氨基酸取代在eu位置183处，所述第三氨基酸取代在eu位置393处，并且所述第四氨基酸取代在eu位置409处。[0611]58.如实施方案57所述的抗体或其片段，其中aho位置46处的谷氨酰胺被赖氨酸置换，eu位置183处的丝氨酸被赖氨酸置换，eu位置392处的赖氨酸被天冬氨酸置换，并且eu位置409处的赖氨酸被天冬氨酸置换。[0612]59.一种异二聚抗体或片段，其包含含有以下的轻链：[0613](a)在选自由aho位置42‑50组成的组的aho位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第一氨基酸取代，和[0614](b)在选自由位置126‑213(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第二氨基酸取代。[0615]60.如实施方案59所述的异二聚抗体或其片段，其中所述第一氨基酸取代在aho位置46处，并且所述第二氨基酸取代在eu位置176处。[0616]61.如实施方案60所述的异二聚抗体或片段，其中aho位置46处的谷氨酰胺被谷氨酸置换，并且eu位置176处的丝氨酸被谷氨酸置换。[0617]62.一种抗体或其片段，其包含含有以下的重链：[0618](a)在选自由aho位置42‑50组成的组的aho位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第一氨基酸取代，[0619](b)在选自由位置126‑213(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第二氨基酸取代，[0620](c)在选自由位置352‑360(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第三氨基酸取代，和[0621](d)在选自由位置395‑403(eu编号)组成的组的位置处的引入带电荷氨基酸的第四氨基酸取代，[0622]其中(a)和(b)的所述带电荷氨基酸具有负电荷，并且(c)和(d)的所述带电荷氨基酸具有正电荷。[0623]63.如实施方案62所述的抗体，其中所述第一氨基酸取代在aho位置46处，所述第二氨基酸取代在eu位置183处，所述第三氨基酸取代在eu位置356处，并且所述第四氨基酸取代在eu位置399处。[0624]64.如实施方案62所述的抗体或其片段，其包含在aho位置46和eu位置176处含有带正电荷氨基酸的轻链。[0625]65.一种异二聚抗体或其片段，其包含含有以下的重链：(a)在选自由aho位置42‑50组成的组的aho位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第一氨基酸取代，[0626](b)在选自由位置126‑213(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第二氨基酸取代，[0627](c)在选自由位置388‑397(eu编号)组成的组的位置处的在所述位置处引入带电荷氨基酸的第三氨基酸取代，和[0628](d)在选自由位置404‑413(eu编号)组成的组的位置处的引入带电荷氨基酸的第四氨基酸取代，[0629]其中(a)和(b)的所述带电荷氨基酸具有正电荷，并且(c)和(d)的所述带电荷氨基酸具有负电荷。[0630]66.如实施方案65所述的异二聚抗体或其片段，其中所述第一氨基酸取代在aho位置46处，所述第二氨基酸取代在eu位置183处，所述第三氨基酸取代在eu位置392处，并且所述第四氨基酸取代在eu位置409处。[0631]67.如实施方案65所述的异二聚抗体或其片段，其包含在aho位置46和eu位置176处含有带负电荷氨基酸的轻链。[0632]68.一种异二聚抗体，其包含第一重链和第二重链以及第一轻链和第二轻链，其中所述第一重链在aho位置46和eu位置183、356和399处包含氨基酸取代，其中所述第二重链在aho位置46和eu位置183、392和409处包含氨基酸取代，并且其中所述第一轻链和所述第二轻链在aho位置46和eu位置176处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在所述位置处引入带电荷氨基酸。[0633]69.如实施方案68所述的异二聚抗体，其中所述第一重链的aho位置46处的谷氨酰胺被谷氨酸置换，其中所述第二重链的aho位置46处的谷氨酰胺被赖氨酸置换，其中所述第一轻链的aho位置46处的谷氨酰胺被赖氨酸置换，其中所述第二轻链的aho位置46处的谷氨酰胺被谷氨酸置换，其中所述第一重链的eu位置183处的丝氨酸被谷氨酸置换，其中所述第一重链的eu位置356处的谷氨酸被赖氨酸置换，其中所述第一重链的eu位置399处的谷氨酸被赖氨酸置换，其中所述第二重链的eu位置183处的丝氨酸被赖氨酸置换，其中所述第二重链的eu位置392处的赖氨酸被天冬氨酸置换，并且其中所述第二重链的eu位置409处的赖氨酸被天冬氨酸置换。[0634]70.如实施方案29‑69中任一项所述的异二聚抗体，其中所述抗体结合硬化蛋白的包含seqidno:1的氨基酸86‑111的区域。[0635]71.如实施方案1‑70中任一项所述的异二聚抗体，其是igg免疫球蛋白。[0636]72.一种核酸，其包含编码如实施方案1‑71中任一项所述的异二聚抗体的核苷酸序列。[0637]73.一种载体，其包含如实施方案72所述的核苷酸序列。[0638]74.一种分离的宿主细胞，其包含如实施方案72所述的核酸或如实施方案73所述的载体。[0639]75.一种增加哺乳动物受试者中的骨矿物质密度的方法，其包括以有效增加所述受试者中的骨矿物质密度的量向所述受试者施用如实施方案1‑71中任一项所述的异二聚抗体。[0640]76.一种组合物，其包含如实施方案1‑71中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂。[0641]77.如实施方案76所述的组合物，其中在约4℃下储存两周之后，所述组合物中小于5％的所述抗体呈聚集体形式。[0642]78.如实施方案76所述的组合物，其中在约4℃下储存两周之后，所述组合物中小于1％的所述抗体是呈聚集体形式。[0643]79.如实施方案77或实施方案78所述的组合物，其中通过粒径排阻色谱测定一定量的抗体以聚集体形式存在于所述组合物中。[0644]88.一种组合物，其包含异二聚抗体或其片段和药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂，[0645]所述异二聚抗体或其片段在以下各结构域中包含一个或多个取代：第一ch3结构域、第二ch3结构域、ch1结构域、cl结构域、vh结构域和vl结构域，其中所述一个或多个取代引入在静电方面不利于同二聚体形成，并且在静电方面有利于异二聚体形成的带电荷氨基酸；[0646]其中在约4℃下储存两周之后，所述组合物中小于5％的所述抗体或片段呈聚集体形式。[0647]89.一种组合物，其包含结合硬化蛋白的包含seqidno:1的氨基酸86‑111的区域的异二聚抗体和药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂，[0648]所述抗体在以下各结构域中包含取代：第一ch3结构域、第二ch3结构域、ch1结构域和cl结构域，其中所述一个或多个取代引入在静电方面不利于同二聚体形成，并且在静电方面有利于异二聚体形成的带电荷氨基酸；[0649]其中在约4℃下储存两周之后，所述组合物中小于5％的所述抗体呈聚集体形式。[0650]90.如实施方案88或实施方案89所述的组合物，其中在约4℃下储存两周之后，所述组合物中小于1％的所述抗体是呈聚集体形式。当前第1页12当前第1页12