用于鉴定陇油杂2号的SSR标记组合及指纹图谱建立与应用

用于鉴定陇油杂2号的ssr标记组合及指纹图谱建立与应用
技术领域
1.本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种用于鉴定陇油杂2号的 ssr标记组合及指纹图谱建立与应用。


背景技术：

2.近年来，随着我国培育和登记油菜新品种速度在加快，推向生产的速度也在加快。然而，由于骨干亲本的集中使用与转基因技术在油菜育种中的大规模应用，油菜品种间的遗传差异越来越小，使得完全依赖传统的形态性状进行品种鉴别越来越困难。同时由于形态鉴定的时效性差，容易受到环境与主观因素的影响，品种多、乱、杂的现象难以得到有效控制，侵权行为时有发生，严重损害了育种家权益和农民利益。以分子标记为基础的dna指纹鉴定技术具有准确可靠、简单快速、易于自动化的优点，通过构建dna指纹图谱进行品种快速鉴定是品种鉴定技术实现产业化的前提，也是品种鉴定技术的发展趋势。这对保护油菜育成品种的知识产权和提高种子市场的种子质量具有重要意义。
3.陇油杂2号是利用我所自育的细胞质雄性不育系101a和恢复系c11 配制而成的中早熟双低优质甘蓝型春油菜杂交种，适应甘肃、新疆、内蒙等春油菜主产区推广种植。2年10点次甘肃省区域试验中平均折合亩产 217.49kg，较对照青杂5号增产7.56％，亩增产油籽15.28kg，位居参试品种第一位。生产试验中，生产试验中，2017年在新疆昭苏平均折合亩产 213公斤，较对照青杂5号增产4.9％；在内蒙古拉布大林平均折合亩产 226.67公斤，较对照青杂5号增产6.9％；适宜在甘肃、新疆、内蒙及周边春油菜区种植。含油率(粗脂肪)47.02％，芥酸含量0.08％，硫甙含量10.28 μmol/g，品质达到国际双低标准；经田间鉴定菌核病病情指数为5.33，相对抗病指数(ri)为
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0.34，对菌核病表现低抗；生育期114天，比青杂 5号早5
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7天，属中早熟甘蓝型油菜品种；株高147.97cm左右，一次有效分枝数5.1个，单株果数137.65个左右，角粒数27.55粒，千粒重3.56克。生长势、抗病性强，结角层密，整齐一致，落黄性好，抗倒伏，综合经济性状优于当地现有的主栽品种，适宜密植和机械收获。
4.但是，现在市场上缺少一种能够快速鉴别“陇油杂2号”品种真伪的技术，使得“陇油杂2号”真伪鉴别困难，影响该品种的大规模推广应用。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种用于鉴定甘蓝型春油菜品种陇油杂2号的ssr标记组合及其dna指纹图谱的建立与应用，该ssr标记组合能够简单快速、准确稳定的完成“陇油杂2号”的真伪判断。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于鉴定甘蓝型春油菜品种陇油杂2号的ssr标记组合，所述ssr标记组合包括引物对a和引物对b；所述引物对a的正向引物为cb10299f，反向引物为 cb10299r；所述引物对b的正向引物为cb10028f，反向引物为cb10028r；
7.所述cb10299f具有序列表seq.id.no.1的核苷酸序列；
8.所述cb10299r具有序列表seq.id.no.2的核苷酸序列；
9.所述cb10028f具有序列表seq.id.no.3的核苷酸序列；
10.所述cb10028r具有序列表seq.id.no.4的核苷酸序列。
11.本发明还提供了用上述的用于鉴定甘蓝型春油菜品种陇油杂2号的 ssr标记组合构建甘蓝型春油菜品种陇油杂2号的dna指纹图谱的方法，该方法为：
12.s1、提取待鉴定的甘蓝型春油菜品种陇油杂2号种子发芽后3天的幼苗的基因组dna；
13.s2、以s1中得到的基因组dna为模板，分别用引物对a和引物对b分别对所述基因组dna进行pcr扩增得到pcr扩增产物，分别命名为 pcr扩增产物a和pcr扩增产物b；
14.pcr扩增的反应体系为：基因组dna1.0μl、含有25mm mgcl2的 10
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pcr缓冲液2.0μl、10μm的正向引物0.5μl、10μm的反向引物0.5μl、 dntps 1.0μl，taqnda聚合酶0.1μl，ddh2o补足至10μl；
15.pcr扩增的反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性45s，65℃退火 30s，72℃延伸45s、每个循环延伸温度降低1℃，进行10次循环；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸45s，进行25次循环；72℃终延伸5min； 4℃保存；
16.s3、将s2中得到的pcr扩增产物a和pcr扩增产物b分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，建立dna指纹图谱。
17.本发明还提供了上述的用于鉴定甘蓝型春油菜品种陇油杂2号的ssr 标记组合的应用，所述ssr标记组合用于鉴定甘蓝型春油菜品种陇油杂2 号的真伪。
18.本发明与现有技术相比具有以下优点：
19.本发明通过甘蓝型春油菜高质量ssr标记组合的开发、分子检测、试验体系的优化，建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的甘蓝型春油菜 dna指纹检测实验体系，并在此基础上开发一种适用于甘蓝型春油菜品种“陇油杂2号”的dna检测方法，采用该方法不仅检测结果稳定可靠，而且操作简单方便，成本低廉，有利于技术的标准化。利用该方法对甘蓝型春油菜品种“陇油杂2号”进行检测，一份样品从送样到出结果仅需1d，且检测结果准确稳定可靠，对保障“陇油杂2号”在生产上长期大面积推广应用具有重大意义。
20.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
21.图1是本发明的甘蓝型春油菜品种陇油杂2号的亲本和杂交种的引物对a的特征指纹图谱。
22.图2是本发明的甘蓝型春油菜品种陇油杂2号的亲本和杂交种的引物对b的特征指纹图谱。
23.图3是本发明实施例1的青杂7号、阳光194、陇油杂2号亲本p1、陇油杂2号亲本p2，陇油杂2号杂交种(1、2、3)用引物对a进行鉴定的特征指纹图谱。
24.图4是本发明实施例1的青杂7号、阳光194、陇油杂2号亲本p1、陇油杂2号亲本p2，陇油杂2号杂交种(1、2、3)用引物对b进行鉴定的特征指纹图谱。
marker。陇油杂2号的亲本p1特征条带大小为95bp，p2特征条带大小为105bp，杂交种(1、2、3)具有双亲共同条带(95bp和105bp)，青杂7号、阳光194没有双亲共同条带，只有105bp的条带，与陇油杂2号杂交种明显不同。
43.(2)用引物对b进行鉴定：
44.将青杂7号、阳光194、陇油杂2号亲本p1、陇油杂2号亲本p2，陇油杂2号杂交种(1、2、3)的幼苗提取基因组dna，用引物对b进行 pcr扩增后，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如图4所示，图中p1、p2为陇油杂2号的亲本，1、2、3为杂交种，4为青杂7号，5为阳光194，m为 dna marker。陇油杂2号的亲本p1有120bp、150bp、165bp共3条特征条带，陇油杂2号的亲本有80bp、95bp、110bp共3条特征条带，杂交种 (1、2、3)具有双亲共同条带(80bp、95bp、110bp、120bp、150bp、 165bp)，而青杂7号和阳光194仅有3条(80bp、95bp、110bp)特征条带，与陇油杂2号杂交种明显不同。
45.结果分析：通过以上检测，获得两个品种在者2个引物位点上的特征 dna指纹图谱，经比较分析，青杂7号和阳光194作用引物对a和引物对b位点与“陇油杂2号”表现为差异基因型，表明青杂7号和阳光194 不是甘蓝型春油菜品种“陇油杂2号”。
46.3)杂交种纯度鉴定
47.分别用引物对a和引物对b对随机抽取的待测的200粒陇油杂2号制种种子的种子发芽后3天的幼苗进行纯度鉴定。
48.将200粒待测的陇油杂2号制种种子的种子发芽后3天的幼苗及其亲本p1、p2种子的幼苗提取基因组dna，用引物对a和引物对b分别对基因组dna进行pcr扩增后，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
49.①
引物对a鉴定结果：
50.陇油杂2号的亲本p1有95bp的特征条带，陇油杂2号的亲本有105bp 的特征条带，杂交种具有双亲共同条带(95bp和105bp)，而杂种子无双亲共同的特异性条带。杂交种子纯度达到97.5％，而田间鉴定纯度为96％，两者鉴定种子纯度结果基本一致。
51.②
引物对b鉴定结果：
52.陇油杂2号的亲本p1有120bp、150bp、165bp共3条特征条带，陇油杂2号的亲本有80bp、95bp、110bp共3条特征条带，杂交种具有双亲共同条带(80bp、95bp、110bp、120bp、150bp、165bp)，而杂种子只有其中一条或部分特征条带。杂交种子纯度达到98.5％，而田间鉴定纯度为 97％，两者鉴定种子纯度结果基本一致。
53.用引物对a和引物对b对待测的陇油杂2号制种种子的幼苗进行鉴定，有利于提高鉴定的准确性。
54.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。