一种溶瘤病毒及其用途的制作方法

1.本技术涉及生物医药的技术领域，更具体地说，它涉及一种溶瘤病毒及其用途。


背景技术：

2.溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤性病毒，目前已被大众接受作为肿瘤免疫治疗的重要分支。溶瘤病毒能够特异性地靶向感染肿瘤细胞，例如利用肿瘤细胞中抑癌基因的失活或缺陷，从而选择性地感染肿瘤细胞；溶瘤病毒感染肿瘤细胞后，会在肿瘤细胞内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞，从而杀死肿瘤细胞。同时，溶瘤病毒还可以提供提高宿主自身抗癌反应所必需的免疫刺激信号，从而吸引更多的免疫细胞来继续杀死残余的肿瘤细胞。
3.虽然溶瘤病毒在肿瘤免疫治疗方面具有较好的应用前景，但野生型溶瘤病毒往往会引起机体神经系统炎症等问题，在利用野生型病毒感染肿瘤细胞的过程中，还存在较大的致病风险。因此，为进一步推进溶瘤病毒的临床应用，需要对野生型溶瘤病毒进行改造，以获得减毒后的溶瘤病毒。将减毒后的溶瘤病毒用于临床应用，从而降低溶瘤病毒的致病风险，提高溶瘤病毒的安全性。
4.然而，在对溶瘤病毒改造的过程中，若仅是对野生型溶瘤病毒随机进行基因修饰，虽然能够降低其毒性，但改造后的溶瘤病毒可能治愈率效果不佳，甚至改造后的溶瘤病毒无法进行包装，不利于推进溶瘤病毒的临床应用。因此，提供一种安全性能良好，同时治愈率高的改造后的溶瘤病毒,对肿瘤免疫治疗领域具有重要的科研价值和应用意义。


技术实现要素：

5.本技术提供一种溶瘤病毒及其用途，本技术提供的溶瘤病毒具有良好的安全性和治愈率。
6.第一方面，本技术提供一种溶瘤病毒，采用如下的技术方案：
7.在本技术中，所述溶瘤病毒包括m蛋白和g蛋白；所述m蛋白与seq id no 1所示的氨基酸序列相比，包含在第51位、第221位和第226位的氨基酸取代；所述g蛋白与seq id no 2所示的氨基酸序列相比，包含至少一个氨基酸取代。
8.在某些实施方式中，所述m蛋白的氨基酸取代包含在第51位的甲硫氨酸突变为精氨酸(m51r)；和/或，在第221位的缬氨酸突变为苯丙氨酸(v221f)；和/或，在第226位的丝氨酸突变为精氨酸(s226r)。
9.在某些实施方式中，所述m蛋白的氨基酸取代包含在第51位的甲硫氨酸突变为精氨酸(m51r)。
10.在某些实施方式中，所述m蛋白的氨基酸取代包含在第221位的缬氨酸突变为苯丙氨酸(v221f)。
11.在某些实施方式中，所述m蛋白的氨基酸取代包含在第226位的丝氨酸突变为精氨酸(s226r)。
12.在某些实施方式中，所述m蛋白具有m51r和v221f的氨基酸取代。
13.在某些实施方式中，所述m蛋白具有m51r和s226r的氨基酸取代。
14.在某些实施方式中，所述m蛋白具有m51r、v221f和s226r的氨基酸取代。
15.在某些实施方式中，所述m蛋白具有v221f和s226r的氨基酸取代。
16.在某些实施方式中，所述m蛋白包含如seq id no 5所示的氨基酸序列。
17.在某些实施方式中，所述m蛋白包含如seq id no 3所示的氨基酸序列。
18.在某些实施方式中，所述m蛋白包含如seq id no 4所示的氨基酸序列。
19.在某些实施方式中，所述g蛋白与seq id no 2所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点的氨基酸取代：第438位、第453位、第471位和第487位。
20.在某些实施方式中，所述g蛋白与seq id no 2所示的氨基酸序列相比，包含以下一个或多个位点的氨基酸取代：第53位、第141位、第172位、第217位、第232位、第331位、第371位、第436位、第438位、第453位、第471位和第487位。
21.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含在第53位的缬氨酸突变为异亮氨酸(v53i)；和/或，在第141位的丙氨酸突变为缬氨酸(a141v)；和/或，在第172位的天冬氨酸突变为酪氨酸(d172y)；和/或，在第217位的赖氨酸突变为谷氨酸(k217e)；和/或，在第232位的天冬氨酸突变为甘氨酸(d232g)；和/或，在第331位的缬氨酸突变为丙氨酸(v331a)；和/或，在第371位的缬氨酸突变为谷氨酸(v371e)；和/或，在第436位的甘氨酸突变为天冬氨酸(g436d)；和/或，在第438位的苏氨酸突变为丝氨酸(t438s)；和/或，在第453位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(f453l)；和/或，在第471位的苏氨酸突变为异亮氨酸(t471i)；和/或，在第487位的酪氨酸突变为组氨酸(y487h)。
22.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含在第53位的缬氨酸突变为异亮氨酸(v53i)。
23.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含在第141位的丙氨酸突变为缬氨酸(a141v)；
24.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含在第172位的天冬氨酸突变为酪氨酸(d172y)；
25.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含在第217位的赖氨酸突变为谷氨酸(k217e)
26.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含在第232位的天冬氨酸突变为甘氨酸(d232g)；
27.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含在第331位的缬氨酸突变为丙氨酸(v331a)；
28.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含在第371位的缬氨酸突变为谷氨酸(v371e)；
29.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含在第436位的甘氨酸突变为天冬氨酸(g436d)；
30.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含在第438位的苏氨酸突变为丝氨酸(t438s)；
31.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含在第453位的苯丙氨酸突变为亮
氨酸(f453l)；
32.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含在第471位的苏氨酸突变为异亮氨酸(t471i)；
33.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含在第487位的酪氨酸突变为组氨酸(y487h)。
34.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含t438s、f453l、t471i和y487h。
35.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含v53i和a141v。
36.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含v53i、a141v和d172y。
37.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含v53i、a141v、d172y和k217e。
38.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含v53i、a141v、d172y、k217e和d232g。
39.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含v53i、a141v、d172y、k217e、d232g和v331a。
40.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含v53i、a141v、d172y、k217e、d232g、v331a和v371e。
41.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含v53i、a141v、d172y、k217e、d232g、v331a、v371e和g436d。
42.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含v53i、a141v、d172y、k217e、d232g、v331a、v371e、g436d和t438s。
43.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含v53i、a141v、d172y、k217e、d232g、v331a、v371e、g436d、t438s和f453l。
44.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含v53i、a141v、d172y、k217e、d232g、v331a、v371e、g436d、t438s、f453l和t471i。
45.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含v53i、a141v、d172y、k217e、d232g、v331a、v371e、g436d、t438s、f453l、t471i和y487h。
46.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含a141v、d172y、k217e、d232g、v331a、v371e、g436d、t438s、f453l、t471i和y487h。
47.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含d172y、k217e、d232g、v331a、v371e、g436d、t438s、f453l、t471i和y487h。
48.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含k217e、d232g、v331a、v371e、g436d、t438s、f453l、t471i和y487h。
49.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含d232g、v331a、v371e、g436d、t438s、f453l、t471i和y487h。
50.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含v331a、v371e、g436d、t438s、f453l、t471i和y487h。
51.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含v371e、g436d、t438s、f453l、t471i和y487h。
52.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含g436d、t438s、f453l、t471i和y487h。
53.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含t438s、f453l、t471i和y487h。
54.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含f453l、t471i和y487h。
55.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含t471i和y487h。
56.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代包含v53i、a141v、d172y、k217e、d232g、v331a、v371e、g436d、t438s、f453l、t471i和y487h。
57.在某些实施方式中，所述g蛋白的氨基酸取代为v53i、a141v、d172y、k217e、d232g、v331a、v371e、g436d、t438s、f453l、t471i和y487h。
58.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 17所示的氨基酸序列。
59.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 6所示的氨基酸序列。
60.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 7所示的氨基酸序列。
61.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 8所示的氨基酸序列。
62.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 9所示的氨基酸序列。
63.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 10所示的氨基酸序列。
64.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 11所示的氨基酸序列。
65.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 12所示的氨基酸序列。
66.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 13所示的氨基酸序列。
67.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 14所示的氨基酸序列。
68.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 15所示的氨基酸序列。
69.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 16所示的氨基酸序列。
70.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 18所示的氨基酸序列。
71.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 19所示的氨基酸序列。
72.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 20所示的氨基酸序列。
73.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 21所示的氨基酸序列。
74.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 22所示的氨基酸序列。
75.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 23所示的氨基酸序列。
76.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 24所示的氨基酸序列。
77.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 25所示的氨基酸序列。
78.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 26所示的氨基酸序列。
79.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 27所示的氨基酸序列。
80.在某些实施方式中，所述g蛋白包含如seq id no 28所示的氨基酸序列。
81.在某些实施方式中，所述溶瘤病毒是以棒状病毒为基础，进行定点突变后获得的。
82.在某些实施方式中，所述溶瘤病毒是以vesicular stomatitis virus(简称“vsv”)病毒为基础，进行定点突变后获得的。
83.在某些实施方式中，所述溶瘤病毒是以vsv病毒indiana muddsummer亚型为基础，进行定点突变后获得的。
84.在某些实施方式中，所述溶瘤病毒包含或表达外源目的蛋白。
85.在某些实施方式中，所述溶瘤病毒包含核酸分子，所述核酸分子包含编码所述具有氨基酸取代的m蛋白的核酸序列和编码所述具有氨基酸取代的g蛋白的核酸序列。
86.在某些实施方式中，所述核酸分子包含编码所述外源目的蛋白的核酸序列。
87.在某些实施方式中，所述核酸分子中所述编码外源目的蛋白的核酸序列位于所述编码所述具有氨基酸取代的m蛋白的核酸序列和所述编码所述具有氨基酸取代的g蛋白的核酸序列之间。
88.在某些实施方式中，所述核酸分子编码所述溶瘤病毒的n蛋白(核蛋白n)、l蛋白(大聚合酶蛋白l)和p蛋白(磷酸蛋白p)。
89.第二方面，本技术提供一种溶瘤病毒表达载体，采用如下的技术方案：
90.一种溶瘤病毒表达载体，所述溶瘤病毒表达载体能够产生本技术所述的任一项溶瘤病毒。
91.第三方面，本技术提供一种病毒生产细胞，采用如下的技术方案：
92.一种病毒生产细胞，所述病毒生产细胞能够产生本技术所述的任一项溶瘤病毒。
93.第四方面，本技术提供一种药物组合物，采用如下的技术方案：
94.一种药物组合物，所述药物组合物包括本技术所述的任一项溶瘤病毒，以及任选地药学上可接受的载剂。
95.第五方面，本技术提供上述溶瘤病毒、溶瘤病毒表达载体、病毒生产细胞和/或药物组合物的制备方法。
96.第六方面，本技术提供上述溶瘤病毒、溶瘤病毒表达载体、病毒生产细胞和/或药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病和/或病症的药物中的用途。
97.在某些实施方式中，所述溶瘤病毒、溶瘤病毒表达载体、病毒生产细胞和/或药物组合物用于缓慢持续杀伤异常增生性细胞的方法中。
98.在某些实施方式中，所述疾病和/或病症包括：异常增生性细胞，选自肿瘤细胞或肿瘤组织的相关细胞；优选的，所述肿瘤细胞是癌细胞；更优选的，所述癌细胞是转移性癌细胞。
99.在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤和/或血液瘤。
100.综上所述，本技术具有以下有益效果：
101.本技术提供的溶瘤病毒均对llc细胞、mc38细胞以及hela细胞具有较好的侵染能力，对llc细胞、mc38细胞以及4t1细胞均具有较好的体外杀伤能力，在llc细胞、mc38细胞以及hela细胞内均不容易清除。并且，本技术提供的溶瘤病毒均对mef细胞具有较差的侵染能力、体外杀伤能力以及容易清除度。因此，本技术提供的溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等细胞的侵染和杀伤，且在肿瘤、癌症等细胞内不易清除，进一步提高了溶瘤病毒对肿瘤、癌症等细胞的治愈率；同时，上述提供的溶瘤病毒不会损伤正常细胞，且在正常细胞内时更加容易清除，进一步保证了正常细胞的安全性。
附图说明
102.本技术所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本技术所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
103.图1为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对llc细胞的侵染能力的检测结果。
104.图2为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对mc38细胞的侵染能力的检测
结果。
105.图3为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对hela细胞的侵染能力的检测结果。
106.图4为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对mef细胞的侵染能力的检测结果。
107.图5为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对llc细胞的体外杀伤能力的检测结果。
108.图6为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对mc38细胞的体外杀伤能力的检测结果。
109.图7为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对4t1细胞的体外杀伤能力的检测结果。
110.图8为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对mef细胞的体外杀伤能力的检测结果。
111.图9为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在llc细胞内的清除难易度的检测结果。
112.图10为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在mc38细胞的清除难易度的检测结果。
113.图11为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在hela细胞的清除难易度的检测结果。
114.图12为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在mef细胞的清除难易度的检测结果。
115.以上附图中，横坐标0表示野生型溶瘤病毒；横坐标1-26分别表示制备例1-26制备的溶瘤病毒；
116.纵坐标log
10 tcid50表示利用karber法计算得出的tcid50值，log
10 tcid50的值越大，表示溶瘤病毒对该细胞的侵染能力越好；log
10 tcid50的值越小，表示溶瘤病毒对该细胞的侵染能力越差；
117.纵坐标od
570
表示细胞的od值，od
570
的值越大，表示溶瘤病毒对该细胞的杀伤能力越差；od
570
的值越小，表示溶瘤病毒对该细胞的杀伤能力越好。
118.纵坐标ifn-β水平表示ifn-β基因的表达情况，ifn-β水平的值越大，表示溶瘤病毒在该细胞内越容易清除；ifn-β水平的值越小，表示溶瘤病毒在该细胞内越不容易清除。
119.本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本技术的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本技术的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本技术的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本技术所涉及发明的精神和范围。相应地，本技术的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
具体实施方式
120.以下由特定的具体实施例说明本技术发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本技术发明的其他优点及效果。
121.术语定义
122.在本技术中，术语“溶瘤病毒”通常指能够在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞的病毒。溶瘤病毒包括但不限于：vsv病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、塞内卡谷病毒、埃可型肠道病毒、柯萨奇病毒、新城疫病毒和马拉巴病毒。在某些实施方案中，所述溶瘤病毒被改造以提高对肿瘤细胞的选择性。在某些实施方案中，所述溶瘤病毒被改造以降低其免疫原性。在一些实施方案中，本技术所述溶瘤病毒为vsv病毒。在一些实施方案中，vsv病毒为vsv病毒indiana muddsummer亚型株的突变体。在一些实施方案中，可以对vsv病毒的m蛋白和g蛋白进行定点基因突变。
123.在某些实施方式中，本技术所述溶瘤病毒可以是经过基因水平改造的溶瘤病毒，如经过一个或多个基因的修饰来改造，从而提高其肿瘤选择性和/或在分裂细胞中优先复制。所述基因水平的改造可以为修饰参与dna复制、核酸代谢、宿主向性、表面附着、毒力、裂解和扩散过程的基因，也可以为整合外源基因的改造。所述外源基因可以包括外源免疫调节基因、外源筛选基因、外源报告基因等。所述经过改造的溶瘤病毒也可以是经过氨基酸水平改造的溶瘤病毒，如一个或多个氨基酸的插入、缺失、置换。
124.在本技术中，术语“m蛋白”通常指vsv病毒基质蛋白。m蛋白是vsv病毒重要的毒力因子，也是vsv病毒中已知可干扰小鼠天然免疫应答的蛋白。术语“m蛋白”还包括其同源物、直系同源物、变体、功能活性片段等。在本技术中，野生型vsv病毒indiana muddsummer亚型m蛋白可以包含如seq id no 1所示的氨基酸序列。在本技术中，所述溶瘤病毒的m蛋白可以包含如seq id no 3-5所示的氨基酸序列。
125.在本技术中，术语“g蛋白”通常指水vsv病毒的糖蛋白，也称包膜蛋白。术语“g蛋白”还包括其同源物、直系同源物、变体、功能活性片段等。在本技术中，野生型vsv病毒indiana muddsummer亚型g蛋白可以包含如seq id no 2所示的氨基酸序列。在本技术中，所述溶瘤病毒的糖蛋白g可以包含如seq id no 6-28所示的氨基酸序列。
126.在本技术中，术语“l蛋白”通常指vsv病毒rna聚合酶蛋白。vsv病毒的l基因编码rna poly e蛋白。术语“l蛋白”还包括其同源物，直系同源物、变体、功能活性片段等。
127.在本技术中，术语“n蛋白”通常指vsv病毒的核衣壳蛋白。术语“n蛋白”还包括其同源物，直系同源物、变体、功能活性片段等。
128.在本技术中，蛋白突变位点的表述通常由“氨基酸+氨基酸位数+(突变后的氨基酸)”来表述。在本技术中，所述突变可以包括但不限于氨基酸的增加、替换、缺失和/或删除。例如，术语“m51r”通常指第51位甲硫氨酸m突变为精氨酸r。
129.在本技术中，术语“氨基酸取代”通常是指用另一个氨基酸残基替代存在于亲本序列中的一个氨基酸残基。亲本序列中的氨基酸可以是例如经由化学肽合成或通过本领域已知的重组方法来取代。因此，“在xx位置处取代”通常是指用替代性氨基酸残基取代存在于位置xx处的氨基酸。在本技术中，所述氨基酸取代可以包括氨基酸突变。
130.在本技术中，术语“突变”通常是指改变野生型分子的核苷酸或氨基酸序列。氨基酸变化可以包括氨基酸的置换、删除、缺失、插入、添加、截短、或蛋白质的加工或切割。
131.在本技术中，术语“核酸分子”通常指任何长度的核苷酸。在本技术中，术语“核酸分子”可以编码所述溶瘤病毒包含的蛋白。在本技术中，所述核酸分子可以包含dna和/或rna。在某些情形下，所述rna可以包含单链rna(ssrna)，也可以包含双链rna(dsrna)，单链
rna可以包含正义rna，也可以包含反义rna(anti-sense rna),也可以包含双义rna。
132.在本技术中，术语“表达载体”通常指一种核酸载体。在适当的条件下，其通常能够表达目标基因和/或目标蛋白。在本技术的某些实施方式中，所述表达载体包括用于表达病毒(例如，溶瘤病毒)的一种或多种组分的核酸分子。例如，所述表达载体可包括至少一个病毒基因组元件，并可以被包装入病毒或被包装为病毒粒子。
133.在本技术中，术语“病毒生产细胞”通常指可以或已经含有包括本技术所述的核酸分子或表达载体，或能够表达本技术所述溶瘤病毒的细胞、细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个宿主细胞的子代。所述细胞可以通过使用本技术所述的表达载体体外转染而得到。
134.在本技术中，术语“药物组合物”通常指以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在的制剂，并且其不含有对所述制剂待施用的受试者有不可接受的毒性的另外成分。在某些实施方案中，这些制剂可以包含药物的活性组分以及药学上可接受的载剂。在某些实施方式中，所述药物产品包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中的药物产品。所述药物产品可以通过不同方式给药，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。
135.在本技术中，术语“预防”通常是指通过预先采取某些措施而防止疾病或其一种或多种症状的产生和发作，复发，和/或扩散。在本技术中，术语“治疗”通常指消除或改善疾病，或与疾病相关的一种或多种症状。在某些实施方案中，治疗通常指向患有这种疾病的患者施用一种或多种药物使得疾病消除或缓解。在某些实施方案中，“治疗”可以是在特定疾病的症状发作后，在其他药物存在或不存在的情况下施用所述药物组合和/或药物产品。例如，使用本技术所述药物组合和/或药物产品防止肿瘤的产生，发展，复发和/或转移。
136.在本技术中，术语“肿瘤”通常是指任何新的病理性的组织增生。肿瘤可能是良性的，也可能是恶性的。在本技术中，所述肿瘤可以是实体瘤和/或血液瘤。用于研究时，可通过本领域技术人员熟知的方法从易于获得的资源中将这些组织分离出来。
137.发明详述
138.本技术提供了一种溶瘤病毒，所述溶瘤病毒是以野生型vsv病毒为基础，具体以vsv病毒印第安纳株，vsv病毒indiana muddsummer亚型株为基础，通过对其m蛋白和/或g蛋白的氨基酸序列上的位点进行突变获得的。其m蛋白的氨基酸序列如seq id no 1所示；其g蛋白的氨基酸序列如seq id no 2所示。在本技术中，所述m蛋白可以被改造，所述g蛋白也可以被改造。
139.本技术对所述vsv病毒进行了如下修饰，以获得溶瘤病毒：
140.所述溶瘤病毒包括m蛋白和g蛋白；所述m蛋白与seq id no 1所示的氨基酸序列相比，在第51位、第221位和第226位包含氨基酸取代；所述g蛋白与seq id no 2所示的氨基酸序列相比，包含至少一个氨基酸取代。
141.所述m蛋白的氨基酸取代包含在第51位的甲硫氨酸突变为精氨酸(m51r)；和/或，在第221位的缬氨酸突变为苯丙氨酸(v221f)；和/或，在第226位的丝氨酸突变为精氨酸(s226r)；例如，所述m蛋白包含如seq id no 5所示的氨基酸序列。在本技术中，所述m蛋白还可以包含其他位置的氨基酸取代。
142.在本技术中，所述g蛋白的氨基酸取代可以包含在第53位的缬氨酸突变为异亮氨
酸(v53i)；和/或，在第141位的丙氨酸突变为缬氨酸(a141v)；和/或，在第172位的天冬氨酸突变为酪氨酸(d172y)；和/或，在第217位的赖氨酸突变为谷氨酸(k217e)；和/或，在第232位的天冬氨酸突变为甘氨酸(d232g)；和/或，在第331位的缬氨酸突变为丙氨酸(v331a)；和/或，在第371位的缬氨酸突变为谷氨酸(v371e)；和/或，在第436位的甘氨酸突变为天冬氨酸(g436d)；和/或，在第438位的苏氨酸突变为丝氨酸(t438s)；和/或，在第453位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(f453l)；和/或，在第471位的苏氨酸突变为异亮氨酸(t471i)；和/或，在第487位的酪氨酸突变为组氨酸(y487h)；所述g蛋白可以包含如seq id no 17所示的氨基酸序列。
143.在本技术中，所述g蛋白可以包含第53位和第141位的氨基酸突变。
144.在本技术中，所述g蛋白可以包含第53位、第141位和第172位的氨基酸突变。
145.在本技术中，所述g蛋白可以包含第53位、第141位、第172位和第217位的氨基酸突变。
146.在本技术中，所述g蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位和第232位的氨基酸突变。
147.在本技术中，所述g蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位、第232位和第331位的氨基酸突变。
148.在本技术中，所述g蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位、第232位、第331位和第371位的氨基酸突变。
149.在本技术中，所述g蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位、第232位、第331位、第371位和第436位的氨基酸突变。
150.在本技术中，所述g蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位、第232位、第331位、第371位、第436位和第438位的氨基酸突变。
151.在本技术中，所述g蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位、第232位、第331位、第371位、第436位、第438位和第453位的氨基酸突变。
152.在本技术中，所述g蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位、第232位、第331位、第371位、第436位、第438位、第453位和第471位的氨基酸突变。
153.在本技术中，所述g蛋白可以包含第53位、第141位、第172位、第217位、第232位、第331位、第371位、第436位、第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
154.在本技术中，所述g蛋白可以包含第141位、第172位、第217位、第232位、第331位、第371位、第436位、第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
155.在本技术中，所述g蛋白可以包含第172位、第217位、第232位、第331位、第371位、第436位、第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
156.在本技术中，所述g蛋白可以包含第217位、第232位、第331位、第371位、第436位、第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
157.在本技术中，所述g蛋白可以包含第232位、第331位、第371位、第436位、第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
158.在本技术中，所述g蛋白可以包含第331位、第371位、第436位、第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
159.在本技术中，所述g蛋白可以包含第371位、第436位、第438位、第453位、第471位和
第487位的氨基酸突变。
160.在本技术中，所述g蛋白可以包含第436位、第438位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
161.在本技术中，所述g蛋白可以包含第436位、第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
162.在本技术中，所述g蛋白可以包含第453位、第471位和第487位的氨基酸突变。
163.在本技术中，所述g蛋白可以包含第471位、第487位的氨基酸突变。
164.在本技术中，所述g蛋白可以包含第487位的氨基酸突变。
165.在本技术中，所述g蛋白还可以包含其他位置的氨基酸取代。
166.在某些实施方式中，所述g蛋白至少包含在保守区的一个或多个氨基酸取代。例如，所述保守区可以包含g蛋白的第437-461位氨基酸。在某些实施方式中，所述g蛋白至少包含在胞质域的截短区的一个或多个氨基酸取代。例如，所述胞质域的截短区可以包含g蛋白的第483-511位氨基酸。
167.在本技术中，所述g蛋白可以至少包含在第438、第453位、第471位和第487位的氨基酸取代。
168.所述溶瘤病毒还可以包含核酸分子和外源目的蛋白。该核酸分子可以包含编码所述具有氨基酸取代的m蛋白的核酸序列和编码所述具有氨基酸取代的g蛋白的核酸序列；该核酸分子还可以包含编码所述外源目的蛋白的核酸序列。进一步地，该核酸分子中所述编码外源目的蛋白的核酸序列位于所述编码所述具有氨基酸取代的m蛋白的核酸序列和所述编码所述具有氨基酸取代的g蛋白的核酸序列之间。再进一步地，该核酸分子编码所述溶瘤病毒的n蛋白(核蛋白n)、l蛋白(大聚合酶蛋白l)和p蛋白(磷酸蛋白p)。
169.在本技术中，可以通过病毒包装过程和病毒拯救过程获得本技术所述的溶瘤病毒。具体过程可以包括用表达t7 rna聚合酶的痘病毒vtf7-3感染接种bsr-t7细胞，使用分别克隆vsv n、vsv p、vsv l基因的表达质粒和骨架质粒进行lipofectamine转染，获得目的溶瘤病毒。
170.本技术还提供了一种溶瘤病毒表达载体、一种病毒生产细胞以及一种药物组合物。
171.所述溶瘤病毒表达载体可以包含编码所述溶瘤病毒的m蛋白和g蛋白的核酸序列；所述溶瘤病毒表达载体还可以包含编码所述溶瘤病毒的n蛋白、p蛋白和l蛋白的核酸序列。
172.所述病毒生产细胞能够产生上述的溶瘤病毒；所述病毒生产细胞可以包含bsr-t7细胞。
173.所述药物组合物包括上述的溶瘤病毒，以及任选地药学上可接受的载剂。
174.在某些实施方案中，所述药物组合物可以包括一种或多种(药学上有效的)佐剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。药物组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选对接受者无毒。本技术的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
175.在某些实施方案中，所述药学上可接受的载剂可以包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂，通常安全、无毒。
176.在某些实施方案中，所述药物组合物可以包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内
和/或鼻内施用或直接注射到组织中。例如，所述药物组合物可以通过输注或注射施用于患者或者受试者。在某些实施方案中，所述药物组合物的施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。在某些实施方案中，所述药物组合物可以不间断施用。所述不间断(或连续)施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现，以测量流入患者体内的治疗剂，如wo2015/036583所述。
177.此外，本技术还提供了上述溶瘤病毒的制备方法，该制备方法可以包括溶瘤病毒表达载体、病毒生产细胞和/或药物组合物的制备方法。任何适于生产溶瘤病毒的方法都可用于产生本技术的溶瘤病毒。例如，可以向细胞中加入表达t7 rna聚合酶的痘病毒进行转染，加入表达所述溶瘤病毒n蛋白、l蛋白和p蛋白的质粒以及骨架质粒进行转染，通过病毒拯救过程获得本技术的溶瘤病毒。
178.本技术还提供了上述溶瘤病毒、溶瘤病毒表达载体、病毒生产细胞和/或药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病和/或病症的药物中的用途。
179.本技术提供的溶瘤病毒均对llc细胞、mc38细胞以及hela细胞具有较好的侵染能力，尤其是编号为jbs104-jbs126的溶瘤病毒，在编号为jbs103的溶瘤病毒的基础上，对溶瘤病毒的g蛋白上的氨基酸进行定点突变，从而进一步提高了溶瘤病毒对llc细胞、mc38细胞以及hela细胞的侵染能力。同时，上述制备的溶瘤病毒对正常细胞mef细胞的侵染能力均较差，说明本技术制备的溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等细胞的侵染，同时不会损伤正常细胞，具有广泛的应用前景。
180.本技术提供的溶瘤病毒均对llc细胞、mc38细胞以及4t1细胞具有较好的体外杀伤能力，尤其是编号为jbs104-jbs126的溶瘤病毒，在编号为jbs103的溶瘤病毒的基础上，对溶瘤病毒的g蛋白上的氨基酸进行定点突变，从而进一步提高了溶瘤病毒对llc细胞、mc38细胞以及4t1细胞的体外杀伤能力。同时，上述制备的溶瘤病毒对mef细胞几乎无影响，说明本技术制备的溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等非正常细胞的损伤和杀死，同时不会损伤正常细胞。
181.编号为jbs101和jbs102的溶瘤病毒在llc细胞、mc38细胞以及hela细胞内均不容易清除。相对而言，编号为jbs103的溶瘤病毒在llc细胞、mc38细胞以及hela细胞内更容易清除。而本技术编号为jbs104-jbs126的溶瘤病毒，在编号为jbs103的溶瘤病毒的基础上，进一步对溶瘤病毒的g蛋白上的氨基酸进行定点突变，从而使得溶瘤病毒在llc细胞、mc38细胞以及hela细胞内更加不容易清除，进一步保证溶瘤病毒能够在llc细胞、mc38细胞以及hela细胞内更好的发挥侵染和杀伤能力；同时，本技术提供的溶瘤病毒在mef细胞内更加容易清除，进一步保证了mef细胞的安全性，从而提高了溶瘤病毒的安全性。
182.不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本技术发明的各个技术方案，而不用于限制本技术发明的范围。
183.制备例
184.制备例1-3
185.制备例1-3分别提供了一种溶瘤病毒，其不同之处主要在于野生型溶瘤病毒m蛋白上氨基酸定点突变的位点。各制备例对应的溶瘤病毒的构建方法具体如下：
186.(1)构建质粒
187.以prv-core质粒(biovector ntcc质粒载体菌种细胞基因保藏中心)为模板，利用
pcr技术引入如表1所示的突变位点。将prv-core质粒分别与载有各突变位点的引物进行pcr；然后将pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；再利用凝胶回收试剂盒进行割胶回收，从而获得具有m蛋白不同突变位点的质粒，获得构建好的质粒prv-core mut。
188.表1制备例1-3中溶瘤病毒m蛋白的突变情况表
[0189][0190]
(2)病毒拯救
[0191]
利用磷酸钙转染试剂盒(thermo fisher scientific)，通过细胞转染技术，将构建好的质粒prv-core mut转染至bsr-t7细胞(购自atcc，美国菌种保藏中心，又称美国模式菌种收集中心)。
[0192]
按照prv-core mut、pp、pn、pl的质量比例为10:5:4:1，将四种质粒混合，质粒总量为5μg；使用200μl opti-mem培养基(thermo fisher scientific)稀释质粒，并加入7.5μl转染试剂plus reagent(life technologies)，获得转染质粒预混液；其中，pp(载有棒状病毒磷酸蛋白基因的质粒)、pn(载有棒状病毒核蛋白基因的质粒)、pl(载有棒状病毒聚合酶蛋白基因的质粒)；pn、pp、pl三种质粒对应的母体载体均为pcaggs(购自atcc)；
[0193]
利用200μl opti-mem培养基稀释lipofectamine ltx 10μl(thermo fisher scientific)，获得ltx混合液；
[0194]
按照lipofectamine ltx使用说明书所述的方法进行质粒转染，6h后利用pbs清洗bsr-t7细胞两次，进一步接种于10％胎牛血清的dmem培养基(thermo fisher scientific)中培养3天；
[0195]
将培养bsr-t7细胞获得的的细胞上清转移到vero细胞(thermo fisher scientific)中，并将vero细胞置于37℃的环境条件下培养3天，荧光显微镜观察细胞中绿色荧光确定病毒拯救的情况；进一步将拯救的突变棒状病毒库，通过vero细胞传代，在建立的噬菌斑筛选系统中挑取单克隆病毒株。
[0196]
(3)m蛋白基因测序。利用trizol试剂盒抽提病毒基因组rna，用随机引物进行逆转录反应，用针对m蛋白基因序列设计的引物对逆转录出来的cdna进行pcr；
[0197]
引物序列为：
[0198]
5'-aaaaaagtaacagatatcac-3'；
[0199]
5'-acatttttccagtttcctttttgg-3'。
[0200]
产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收，并送往测序公司进行测序。测序结果如表1所示。
[0201]
制备例4-26
[0202]
制备例4-26分别提供了一种溶瘤病毒，其不同之处主要在于野生型溶瘤病毒m蛋白和g蛋白上氨基酸定点突变的位点，其中m蛋白的突变位点与制备例3中相应的突变位点
相同。各制备例对应的溶瘤病毒的构建方法同制备例1-3中所述的构建方法，不同之处在于：
[0203]
步骤(1)的构建质粒中利用pcr技术引入如表2所示的突变位点；
[0204]
步骤(3)为g蛋白基因测序。利用trizol试剂盒抽提病毒基因组rna，用随机引物进行逆转录反应，用针对g蛋白基因序列设计的引物对逆转录出来的cdna进行pcr；
[0205]
引物序列为：
[0206]5’‑
ccatggcctgttgctccaccagctt-3’；
[0207]5’‑
aagctttcagcagtggctcacagcag-3’。
[0208]
产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收，并送往测序公司进行测序。测序结果如表2所示。
[0209]
表2制备例4-26中溶瘤病毒g蛋白的突变情况表
[0210]
[0211][0212]
制备例27
[0213]
本制备例提供了利用上述实施例1-26制备的溶瘤病毒的包装过程，具体包括以下步骤：
[0214]
1)利用表达t7 rna聚合酶的痘病毒vtf7-3(biovector ntcc质粒载体菌种细胞基因保藏中心)感染接种bsr-t7细胞(购自atcc)
[0215]
具体步骤如下：将bsr-t7细胞铺在6孔板上，控制每孔细胞量达到3
×
105个；铺板14-16h后加入表达t7 rna聚合酶的痘病毒vtf7-3，进行痘病毒vtf7-3对bsr-t7细胞的感染；感染6h后，使用dpbs缓冲液(thermo fisher scientific)漂洗一次bsr-t7细胞，进行转染。
[0216]
2)转染过程
[0217]
具体包括以下步骤：按照prv-core mut、pp、pn、pl的质量比例为10:5:4:1，将四种质粒混合，质粒总量为5μg；使用200μl opti-mem培养基(thermo fisher scientific)稀释质粒，并加入7.5μl转染试剂plus reagent(life technologies)，获得转染质粒预混液；其中，pp(载有棒状病毒磷酸蛋白基因的质粒)、pn(载有棒状病毒核蛋白基因的质粒)、pl(载有棒状病毒聚合酶蛋白基因的质粒)；pn、pp、pl三种质粒对应的母体载体均为pcaggs(购自atcc)；
[0218]
利用200μl opti-mem培养基稀释lipofectamine ltx 10μl(thermo fisher scientific)，获得ltx混合液；
[0219]
将ltx混合液200μl与转染质粒预混液200μl混合，室温孵育15min，获得ltx-dna混合液；
[0220]
将步骤1)的6孔板中的dpbs缓冲液换成opti-mem培养基，将ltx-dna混合液逐滴加入培养bsr-t7细胞的6孔板中，轻轻摇动6孔板，使ltx-dna混合液均匀分布在6孔板内；转染6-8h后，吸去转染试剂，加入3ml新鲜的完全培养基(thermo fisher scientific)；72h后收获bsr-t7细胞的细胞上清，使用0.22μm滤器进行过滤，获得制备例1-26各自对应的溶瘤病毒滴。
[0221]
实施例
[0222]
实施例1
[0223]
本实施例分别利用制备例1-26制得的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对不同细胞的侵染能力进行检测。检测方法为tcid50检测法，即在不同细胞的培养液中，分别加入制备例1-26以及野生型溶瘤病毒各200pfu，检测各溶瘤病毒产生的半数组织培养感染剂量(tissue culture infective dose，tcid50)。所检测的细胞包括：llc细胞(鼠源非小细胞肺癌细胞)、mc38细胞(小鼠结肠癌细胞)、hela细胞(人宫颈癌细胞)、mef细胞(人成纤维细胞)。具体检测方法为：
[0224]
(1)分别在6孔培养板中加入vero(llc/mc38/hela/mef)细胞悬液3ml，使细胞量达到4
×
105个/孔，每种vero细胞共6个孔，mef细胞设置2个孔，作为对照；将6孔培养板置于37℃、5％co2的环境条件下培养16h；
[0225]
(2)向6孔培养板的每个孔中加入制备例制得的溶瘤病毒200pfu，在24h收获mef细胞以及每种vero细胞的上清100μl；将收获的分别加入96孔培养板的孔中，使各种细胞的细胞量达到1
×
104个/ml，将96孔培养板置于37℃、5％co2的环境条件下培养16h；
[0226]
(3)在1.5ml ep管中将步骤(2)收获的上清作连续10倍的稀释，从10-1
～10-11
，共11个滴度；将稀释好的上清接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一列共8孔，每孔接种100μl；
[0227]
(4)48h后观察每孔细胞的荧光情况，有荧光则记为此孔被感染；按karber法计算tcid50。
[0228]
检测结果如图1-图4所示，其中，横坐标0表示野生型溶瘤病毒；横坐标1-26分别表示制备例1-26制备的溶瘤病毒；纵坐标log 10
tcid50表示利用karber法计算得出的tcid50值，log 10
tcid50的值越大，表示溶瘤病毒对该细胞的侵染能力越好；log 10
tcid50的值越小，表示溶瘤病毒对该细胞的侵染能力越差。
[0229]
图1为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对llc细胞的侵染能力的检测结果。
[0230]
图2为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对mc38细胞的侵染能力的检测结果。
[0231]
图3为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对hela细胞的侵染能力的检测结果。
[0232]
图4为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对mef细胞的侵染能力的检测结果。
[0233]
通过上述附图可知，本技术制备例1-26制备的溶瘤病毒均对llc细胞、mc38细胞以及hela细胞具有较好的侵染能力，尤其是制备例4-26，在制备例3的基础上进一步对溶瘤病毒的g蛋白上的氨基酸进行定点突变，从而进一步提高了溶瘤病毒对llc细胞、mc38细胞以及hela细胞的侵染能力。同时，上述制备的溶瘤病毒均对mef细胞的侵染能力较差，说明本技术制备的溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等细胞的侵染，同时不会损伤正常细胞，具有广泛的应用前景。
[0234]
实施例2
[0235]
本实施例分别利用制备例1-26制得的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对不同细胞进行体外杀伤试验检测。检测方法为mtt检测法，即在不同细胞的培养液中，分别加入制备例1-26以及野生型溶瘤病毒各200pfu，24h后进行利用mtt检测法检测细胞活性。所检测的细胞包括：llc细胞、mc38细胞、mef细胞、4t1细胞(小鼠乳腺细胞)。具体检测方法为：
[0236]
(1)分别在96孔培养板中加入vero(llc/mc38/4t1/mef)细胞悬液100μl，使细胞量达到1
×
104个/孔，将96孔培养板置于37℃、5％co2的环境条件下培养16h；
[0237]
(2)将制备例制得的溶瘤病毒稀释到moi(感染复数)分别为0.001、0.01、0.1、1.0，将每一稀释梯度的溶瘤病毒分别接种到步骤(1)的96孔培养板上，每一稀释梯度接种4个孔，每孔100μl，将96孔培养板置于37℃、5％co2的环境条件下培养40h；
[0238]
(3)将步骤(2)的96孔培养板中的细胞上清取出，并向96孔培养板中加入新鲜培养基和mtt溶液，加入量为20μl/孔，将96孔培养板置于37℃、5％co2的环境条件下培养4h；
[0239]
(4)将96孔培养板于室温下离心5min，设置转速为2500rpm/min，用1ml一次性无菌注射器轻轻吸掉上清；然后向96孔培养板的每个孔中加入dmso，加入量为100ul/孔，37℃的环境条件下放置10min。使用多功能酶标仪，震荡2min，在570nm或490nm波长下测定96孔培养板上各孔的od值。
[0240]
检测结果如图5-图8所示，其中，横坐标0表示野生型溶瘤病毒；横坐标1-26分别表示制备例1-26制备的溶瘤病毒；纵坐标od
570
表示细胞的od值，od
570
的值越大，表示溶瘤病毒对该细胞的杀伤能力越差；od
570
的值越小，表示溶瘤病毒对该细胞的杀伤能力越好。
[0241]
图5为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对llc细胞的体外杀伤能力的检测结果。
[0242]
图6为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对mc38细胞的体外杀伤能力的检测结果。
[0243]
图7为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对4t1细胞的体外杀伤能力的检测结果。
[0244]
图8为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒对mef细胞的体外杀伤能力的检测结果。
[0245]
通过上述附图可知，本技术制备例1-26制备的溶瘤病毒均对llc细胞、mc38细胞以及4t1细胞具有较好的体外杀伤能力，尤其是制备例4-26，在制备例3的基础上进一步对溶瘤病毒的g蛋白上的氨基酸进行定点突变，从而进一步提高了溶瘤病毒对llc细胞、mc38细胞以及4t1细胞的体外杀伤能力。同时，上述制备的溶瘤病毒对mef细胞几乎无影响，说明本技术制备的溶瘤病毒能够较好的用于肿瘤、癌症等非正常细胞的损伤和杀死，同时不会损伤正常细胞。
[0246]
虽然野生型溶瘤病毒对llc细胞、mc38细胞以及4t1细胞已具有较好的体外杀伤能力，但其在损伤和杀死上述细胞的同时，还会很大程度地损伤和杀死mef细胞，限制了野生型溶瘤病毒的临床应用。因此，本技术对野生型溶瘤病毒的改造，在保证溶瘤病毒对正常细胞的安全性的同时，还保证了溶瘤病毒对肿瘤、癌症细胞的杀伤能力，具有广泛的临床应用前景。
[0247]
实施例3
[0248]
本实施例对制备例1-26制得的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在不同细胞内的清除难易度进行检测。检测指标为基因ifn-β的表达情况。基因ifn-β是细胞产生的具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白的基因，通过基因ifn-β的表达情况可判断细胞对溶瘤病毒的清除能力：当基因ifn-β的表达较高时，表明溶瘤病毒在细胞内容易清除；当基因ifn-β的表达较低时，表示溶瘤病毒在细胞内不容易清除。所检测的细胞包括：llc细胞、mc38细胞、hela细胞、mef细胞。具体检测方法为：
[0249]
(1)分别在96孔培养板中加入vero(llc/mc38/hela/mef)细胞以及mef细胞悬液100μl，使细胞量达到1
×
104个/孔，将96孔培养板置于37℃、5％co2的环境条件下培养16h；
[0250]
(2)将制备例制得的溶瘤病毒稀释到moi(感染复数)分别为0.001、0.01、0.1、1.0，将每一稀释梯度的溶瘤病毒分别接种到步骤(1)的96孔培养板上，每一稀释梯度接种4个孔，每孔100μl，将96孔培养板置于37℃、5％co2的环境条件下培养40h；
[0251]
(3)将步骤(2)培养获得的各组细胞破碎，并利用trizol(invitrogen)从各细胞中提取总rna，利用primescript rt reagent kit with dna eraser(takara)反转录试剂盒逆转录成cdna，并用lightcycler 480sybr green i master(roche)染料进行染色，在lightcycler 480定量pcr仪上检测各个基因的ct值。用δδct法计算目的基因ifn-β的相对表达量。
[0252]
检测结果如图9-图12所示，其中，横坐标0表示野生型溶瘤病毒；横坐标1-26分别表示制备例1-26制备的溶瘤病毒；纵坐标ifn-β水平表示ifn-β基因的表达情况，ifn-β水平的值越大，表示溶瘤病毒在该细胞内越容易清除；ifn-β水平的值越小，表示溶瘤病毒在该细胞内越不容易清除。
[0253]
图9为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在llc细胞内的清除难易度的检测结果。
[0254]
图10为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在mc38细胞的清除难易度的检测结果。
[0255]
图11为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在hela细胞的清除难易度的
检测结果。
[0256]
图12为本技术制备的溶瘤病毒以及野生型溶瘤病毒在mef细胞的清除难易度的检测结果。
[0257]
通过上述附图可知，本技术制备例1-2在llc细胞、mc38细胞以及hela细胞内均不容易清除。相对制备例1和制备例2而言，制备例3在llc细胞、mc38细胞以及hela细胞内更容易清除。本技术制备例4-26，在制备例3的基础上进一步对溶瘤病毒的g蛋白上的氨基酸进行定点突变，从而使得溶瘤病毒在llc细胞、mc38细胞以及hela细胞内更加不容易清除的程度，进一步保证溶瘤病毒能够在llc细胞、mc38细胞以及hela细胞内更好的发挥侵染和杀伤的能力；同时，使得溶瘤病毒在mef细胞内更加容易清除，进一步保证了mef细胞的安全性，从而提高了溶瘤病毒的安全性。
[0258]
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本技术所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。