一种新型探针标记方法与流程

1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种新型探针标记方法。


背景技术：

2.目前主要的荧光标记方法依然是切口平移法，随机引物法，聚合酶链式反应法等，每种方法都各有其优缺点，随机引物法产量低，操作复杂；聚合酶链式反应法得率较高，但方法不稳定，批间差比较大；切口平移法发展最早，最为成熟，但标记时间长，得率低。常规的切口平移法标记探针是将dnase i，dna polymerase i，bac质粒加入一个体系中进行反应，dnase i首先对质粒产生切口，dna polymerase i在切口处进行延伸，在延伸的过程中通过错配的方式将dutp
‑
荧光素插入到新合成的dna分子中，从而获得标记的探针。但此方法反应时间比较长，2.5h左右，且反应结束后需要酒精沉淀纯化，有时需过夜沉淀，大大限制了探针生产的效率。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种新型探针标记方法，该方法对常规切口平移法进行改进，既缩短了标记时间又提高了标记效率。
4.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
5.本发明提供了一种新型探针标记方法，包括如下步骤：
6.1)用dna酶i消化bac克隆质粒，形成大小不一的dna片段；
7.2)用tdt末端转移酶对dna片段进行末端标记；
8.3)配制探针溶液。
9.优选的，步骤1)中dna片段的长度为200
‑
500bp。
10.优选的，步骤1)用dna酶i消化bac克隆质粒的酶切体系如下：bac克隆2μg，dnase i 1μl，10
×
dnase buffer 2μl，ddh2o补足20μl。进一步优选的，酶切程序为：37℃5
‑
10min，75℃10min。
11.优选的，步骤2)中先对dna片段进行纯化再进行末端标记。进一步优选的，采用pcr产物纯化试剂盒对dna片段进行纯化。
12.优选的，步骤2)中标记体系如下：dna片段700ng，terminal deoxynucleotidyl transferase 0.5μl，5
×
reaction buffer 2μl，aminoallyl
‑
dutp
‑
xx
‑
af555 0.5μl，ddh2o补足10μl，其中terminal deoxynucleotidyl transferase的浓度为20u/μl。进一步优选的，标记程序如下：37℃25min，70℃5min。
13.优选的，步骤3)中按照杂交缓冲液：标记溶液：human cot
‑
1dna：1
×
te buffer＝7：1：1：1比例配制，获得探针溶液。进一步优选的，所述杂交缓冲液由水和甲酰胺、硫酸葡聚糖、氯化钠、柠檬酸组成，其中，甲酰胺的体积百分含量为30％，硫酸葡聚糖的质量百分含量为28％，氯化钠的终浓度为8.75g/l，柠檬酸的终浓度为4.4g/l。
14.本发明取得的有益效果：
15.本发明提供的新型探针标记方法，是在切口平移法的基础上进行改进，先将bac克隆的质粒进行dna酶1消化，使其片段化处理，处理后的质粒用过柱纯化也可以直接进行下一步标记。然后对片段化的质粒进行末端转移酶标记，将dutp
‑
荧光素插入到dna片段的5’端，标记好的探针无需纯化，可以直接配制探针溶液进行杂交。整个流程在一小时内即可完成，并且中间过程损耗量少，探针得率高。试验证明，切口平移法标记探针每2μg的质粒可以得到10
‑
20人份的探针，而本发明的方法每2μg的质粒可以得到40
‑
50人份的探针，极大的提高了生产效率。
附图说明
16.图1为切口平移法标记的探针结果；
17.图2为本发明提供的新型标记方法制备的探针结果。
具体实施方式
18.下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例及试验例中所用的仪器设备如无特别说明，均为市售常规仪器设备；所用试剂材料，如无特别说明，均为市售常规试剂材料；其中，terminal deoxynucleotidyl transferase购自碧云天生物，试剂盒包含reaction buffer(反应缓冲液)、tdt末端转移酶；recombinant dnase i(rnase
‑
free)购自takara，试剂盒包含10
×
dnase i buffer(10
×
dna酶i缓冲液)、recombinant dnase i(rnase
‑
free)(重组dna酶i(无rna酶))；dna polymerase i(e.coli)购自takara，试剂盒包含dna polymerase i dna聚合酶i。aminoallyl
‑
dutp
‑
xx
‑
af555(荧光素)和dtt(二硫苏糖醇)市售可得。
19.取同一批次质粒dna(以her2探针bac克隆ctd
‑
2019c10为例)2μg，分别采用常规切口平移法和本发明提供的新型标记方法标记探针，具体实施如下：
20.实施例 新型探针标记法
21.本实施例的新型探针标记方法，包括如下步骤：
22.1.探针的标记
23.配制酶切反应体系如下：
[0024][0025]
配置完毕后，用移液器吹打混匀，离心后，放在pcr仪上反应，程序如下：37℃，10min；75℃，10min；4℃，∞。
[0026]
配制标记体系，如下：
[0027][0028]
配置完毕后，用移液器吹打混匀后离心，放在pcr仪上反应，程序如下：37℃，25min；70℃，5min，4℃，∞。
[0029]
反应完毕后，即得探针溶液。
[0030]
2.探针的配制
[0031][0032]
其中，杂交缓冲液由水和甲酰胺、硫酸葡聚糖、氯化钠、柠檬酸组成，其中，甲酰胺的体积百分含量为30％，硫酸葡聚糖的质量百分含量为28％，氯化钠的终浓度为8.75g/l，柠檬酸的终浓度为4.4g/l。
[0033]
上述试验中，tdt末端转移酶购自翊圣生物，货号：10302es76，aminoallyl
‑
dutp
‑
xx
‑
af555购自jena；封闭剂cot
‑
1dna购自invitrogen，货号1996778。
[0034]
对比例切口平移标记法
[0035]
本对比例的切口平移标记法，包括如下步骤：
[0036]
1.探针的标记
[0037]
配制反应体系如下：
[0038][0039][0040]
其中10*nick translation buffer配方为1m tris
‑
hcl(ph7.8)，500mm mgcl2,0.5mg/mlbsa；dtt购自sigma，dna polymerase i和recombinant dnase i购自takara。
[0041]
配置完毕后，用移液器吹打混匀，离心后，放在pcr仪上反应，程序如下：16℃，2h20min；80℃，10min，4℃，∞。
[0042]
2.探针的纯化
[0043]
a)将pcr产物转入到新的1.5ml ep管中，加入等体积的无菌去离子水和0.1倍的3m naac(ph＝5.2)后混匀，
[0044]
b)再加入2.5倍体积的无水乙醇(提前预冷)，混匀；
[0045]
c)置于
‑
20℃冰箱沉淀过夜或
‑
80℃冰箱沉淀2h；
[0046]
d)取出离心管，4℃12000rpm离心20min；
[0047]
e)弃上清，加入700μl 70％乙醇，4℃12000rpm离心10min；
[0048]
f)重复上述步骤一次；
[0049]
g)弃上清，4℃12000rpm离心10min；
[0050]
h)室温放置5～10min，以使乙醇挥发完全；
[0051]
i)加入10μl 1*te(ph8.0)溶解沉淀即得探针溶液。
[0052]
3.探针的配制：
[0053][0054]
试验例 探针检测
[0055]
1.样本收集及玻片制备：
[0056]
1)样本于常温下在10％中性福尔马林缓冲液中固定6～48小时，为了达到最佳的和均匀的固定与石蜡包埋效果，样本大小不宜超过0.5cm3。
[0057]
2)标准操作和石蜡包埋，使用高质量的石蜡。渗透和包埋应在低于65℃下进行。
[0058]
3)切成3μm厚度的切片。
[0059]
2.玻片预处理程序：
[0060]
1)56
‑
65℃左右烤片三小时以上(过夜)。
[0061]
2)提前预热胃蛋白酶处理液，使其温度达到37℃保温备用。
[0062]
3)二甲苯中室温放置切片10分钟，重复该步骤两次。
[0063]
4)无水乙醇中室温放置切片5分钟，重复该步骤一次。
[0064]
5)依次85％、70％乙醇中室温处理切片3分钟。
[0065]
6)去离子水洗2分钟，重复3次。
[0066]
7)用微波炉将适量的预处理缓冲液煮沸后，然后使其处于保温状态，放入切片修复20分钟，或是在高压锅内加入适量的预处理缓冲液，高压修复5分钟。
[0067]
8)取出玻片，用去离子水洗涤三次。将切片直接放入蛋白酶消化液中，消化15
±
10分钟。
[0068]
注：根据不同的组织(细胞)类型及切片厚度，消化时间有所不同，一般来讲，建议预实验找到样本的最佳消化时间。
[0069]
9)去离子水清洗2分钟，三次。
[0070]
10)脱水：70％，85％，100％乙醇溶液中依次处理各2分钟，晾干。
[0071]
3.fish操作步骤
[0072]
警告和预防:荧光基团遇强光会产生光漂白现象。将含有荧光基团的试剂与玻片
避光有助于减少此效应。所有需避光的步骤均在暗处进行。fish实验操作过程中请注意防护，试剂勿与皮肤直接接触。
[0073]
a)标本变性与杂交
[0074]
1)将配制好的探针的杂交液从冰箱取出，瞬时离心，用移液器取10μl至各个样本。滴加至目标区域；
[0075]
2)样本盖上盖玻片，避免气泡；封片胶封片；
[0076]
3)将玻片放入杂交仪，80℃(
±
2℃)变性6分钟，40℃过夜杂交(建议使用82℃变性6分钟，40℃杂交过夜)。
[0077]
注意：杂交期间片子不能干！
[0078]
b)杂交后的处理
[0079]
1)提前30分钟将洗涤液i水浴加热到73
±
1℃，小心除去封片胶；
[0080]
2)将切片置于洗涤液ii溶液中，放置5
‑
10分钟，除去盖玻片；
[0081]
3)将切片置于洗涤液i洗液(水浴加热到73
±
1℃)中，上下提拉切片1
‑
3s，放置分钟；
[0082]
4)室温条件下，将切片置于洗涤液ii洗液中，上下提拉1
‑
3s，处理切片2分钟；
[0083]
5)在70％、85％的乙醇溶液中依次放置2分钟。
[0084]
6)避光晾干样本。
[0085]
注：考普林缸中每次最好同时放置4张切片，当最后一张玻片放入考普林缸时开始计时。
[0086]
c)观察
[0087]
1)滴加10μl dapi复染液到切片组织上，盖上盖玻片，避免气泡，暗处
‑
20℃处理15分钟。
[0088]
2)于荧光显微镜下观察计数。
[0089]
3)长期保存应放于
‑
20℃。
[0090]
4.结果分析
[0091]
1)探针产量对比
[0092]
2μg质粒用对比例1的切口平移法共获得探针100μl，即10人份探针；而用本专利提供新型标记方法(参见实施例)共获得探针476μl，约为47人份探针。
[0093]
2)标记时间对比
[0094]
对比例的切口平移法标记共计需要工作时间4h左右(不计过夜时间)；而本发明实施例的新型标记方法共计工作时长1h左右。
[0095]
3)标记结果对比
[0096]
图1
‑
2为切口平移法和新型标记法对比，图1为对比例切口平移法标记探针，图2为本发明实施例提供的新型标记方法制备的探针。
[0097]
4)标记效率分析
[0098]
切口平移法标记的1人份探针包含200ng质粒dna，而本发明提供的新型标记方法标记的1人份探针包含42ng质粒dna，从结果看出两者信号亮度相当，可得知两个探针中荧光素的总量相当，而后者质粒总量较少，由此可知，本发明的新型探针标记法的荧光素插入率要显著高于切口平移法，即是说，本发明方法标记探针效率要远远高于传统的切口平移法。