一种类孟买血型FUT1236delG等位基因及其检测方法和应用与流程

一种类孟买血型fut1 236delg等位基因及其检测方法和应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学分析检测技术领域，涉及一种类孟买fut1236delg等位基因及其检测方法和应用。


背景技术：

2.血型系统是指根据红细胞膜上抗原的差异而对血液进行分型。截止至2021年2月，国际输血协会(isbt)确认了人类红细胞血型系统共有43个。hh血型系统又称为孟买血型系统，是根据红细胞表面是否存在h抗原而对血液分型的人类血型系统。h抗原是每个abo血型抗原的前体。决定h抗原的fut1基因在19号染色体上，长度超过5000个碱基对，含有4个外显子。fut1基因有两个等位基因h和h，h等位基因编码岩藻糖转移酶，使岩藻糖与糖链末端的半乳糖相连形成h抗原，而h等位基因无法编码具有活性的岩藻糖转移酶。hh纯合子个体在人类中非常罕见，主要包括孟买型(h抗原完全缺失的非分泌性)和类孟买型(h抗原部分缺失)。类孟买血型在我国极其罕见，由于类孟买血型的个体无法合成a抗原、b抗原，以及这两种抗原的前体物h抗原，同时由于天然免疫，体内会产生抗a、抗b和抗h抗体，因此他们不能接受任何abo血型的血液。在abo血型的常规检测中，类孟买血型者往往会被误认为o型，若未经进一步详查，误输入o型血，抗h免疫球蛋白激活补体级联反应，将会导致红细胞溶解，引发急性溶血性输血反应。为了保障患者输血安全，对类孟买血型进行检测具有非常重要的临床价值。即使明确患者为(类)孟买血型，找到与之相合的罕见(类)孟买血型的献血者也极为困难。因此建立(类)孟买血型捐献者资料库非常有必要。由于该血型极其罕见，需要筛选大量献血者方可发现一二，因此操作简单、结果精确、技术要求低、筛选成本低等适用于大量样本检测的方法亟待开发。目前，类孟买血型的常规检测方法是采用血型血清学方法，包括：abo正定型、abo反定型、h血型正定型、h血型反定型、抗h效价试验、吸收放散试验检测红细胞表面的abh抗原等。该方法不仅操作繁琐、结果也存在不稳定性和不确定性，不适合临床大规模应用。此外，抗
‑
h试剂价格高、不易长期保存。相比之下，基因检测可用于批量检测，而且对类孟买血型的检测结果可靠、精确。通过检测fut1基因型确定类孟买表型，不仅在弥补血清学技术的不足上具有重要的临床实用意义，而且还具有广泛的科研应用价值。
3.目前，对fut1基因突变的鉴定均通过测序方法进行，但该方法存在一些难以克服的缺点：操作过程复杂，技术要求高，试剂昂贵，检测费用高，测序仪普及率低，普通实验室无法开展等，这些缺点使其在临床应用中受到很大的限制。
4.因此一种操作简单、结果精确、技术要求低、筛选成本低并适用于大量样本的类孟买血型检测方法是亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种类孟买fut1 236delg等位基因及其检测方法和应用，不仅可用于特定个体的fut1基因鉴别及(类)孟买血型鉴定，而且
由于筛选成本低、操作简单，还可用于大量样本的筛选，以建立(类)孟买血型捐献者资料库，为(类)孟买血型患者提供相合的血液。
6.本发明采用如下技术方案：
7.在本发明实施例的第一方面，提供了一种类孟买血型fut1236delg等位基因，所述类孟买血型fut1 236delg等位基因为hh血型系统变异型fut1基因编码区域由起始密码子第236位碱基缺失了1个g。
8.在本发明实施例的第二方面，提供了一种所述类孟买血型fut1 236delg等位基因在制备用于检测类孟买血型的制品中的应用。
9.在本发明实施例的第三方面，提供了一种用于检测红细胞类孟买血型的引物对，所述的引物对的序列如seq id no:1
‑
seqid no:3所示，所述类孟买血型fut1基因236delg等位基因的引物序列如下：
10.236delg
‑
f：如seq id no:1所示，
11.440wild
‑
r：如seq id no:2所示；
12.针对野生型fut1基因的引物序列如下：
13.236wild
‑
f：如seq id no:3所示，
14.反向引物：如seq id no:2所示；反向引物序列为突变型与野生型共用，不具突变鉴别特异性。
15.在本发明实施例的第四方面，提供了一种用于检测红细胞类孟买血型的制品，所述制品是用于检测待检测的样品是否存权利要求1所述的类孟买血型fut1 236delg等位基因。
16.进一步地，所述制品包括pcr扩增测序检测试剂盒，所述pcr扩增测序检测试剂盒包括所述的引物对。
17.进一步地，所述pcr扩增测序检测试剂盒还包括2
×
taq pcr mastermix和内参引物对。
18.在本发明实施例的第五方面，提供了一种类孟买血型fut1基因236delg等位基因的检测方法，所述检测方法包括：通过基因扩增方法对包含突变位点的目的片段进行选择性扩增，由此检测该突变基因的有无，检测方法包括以下步骤：
19.提取待检样本中的基因组dna；
20.以所述基因组dna为模板，采用用于检测红细胞类孟买血型的引物对进行pcr反应，得到pcr反应产物；
21.利用凝胶电泳法检测所述pcr反应产物的条带格局；
22.根据所述条带格局判断被检样本是否携带236delg等位基因，并鉴别纯合型或杂合型。
23.进一步地，所述根据所述条带格局判断被检样本是否携带236delg等位基因，并鉴别纯合型或杂合型，具体包括：
24.若待检测样本的所述条带格局为：没有236delg特异性扩增产物条带，表明待检测样本为非携带者；
25.若待检测样本的所述条带格局为：有236delg特异性扩增产物条带，表明待检测样本为236delg等位基因携带者；进一步判断236delg等位基因携带者为纯合型或杂合型，包
括：
26.若待检测样本的所述条带格局为：既有236delg特异性扩增产物条带又有440wild特异性扩增产物条带，表明待检测样本为杂合型236delg等位基因携带者；
27.若待检测样本的所述条带格局为：只有236delg特异性扩增产物条带而没有440wild特异性扩增产物条带，表明待检测样本为纯合型236delg等位基因携带者。
28.进一步地，所述用于检测红细胞类孟买血型的引物对如权利要求3所示，所述236delg特异性扩增产物条带和所述440wild特异性扩增产物条带的长度均为250bp；
29.同时引入1对管家基因β
‑
actin引物作为dna样本扩增阳性内参照，所述内参基因引物对的序列如seq id no:4
‑
no:5所示，所述内参照扩增产物片段长度为200bp。
30.进一步地，所述236delg等位基因/野生型基因扩增的反应体系总体积10μl，包括dna模板50ng，正反向引物终浓度各为0.4μm，2
×
taq pcr mastermix 5ul；
31.所述pcr扩增的条件：95℃预变性2min；95℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸10min，冷却至4℃。
32.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
33.本发明实施例提供的一种类孟买fut1 236delg等位基因及其检测方法和应用，该类孟买fut1 236delg等位基因为hh血型系统变异型fut1基因编码区域由起始密码子第236位缺失一个g碱基。所述类孟买血型fut1 236delg等位基因检测方法和应用可以高灵敏且高精度检测掺杂于基因库中fut1236delg突变基因的有无。所述的检测类孟买血型fut1 236delg等位基因，是采用所述的引物对待检测血样的dna进行pcr扩增，得到特异性扩增条带格局与fut1野生型的扩增条带格局进行比较，确定待检样品是否存在类孟买血型fut1236delg等位基因。由于不同民族间存在fut1基因的差异，在相关研究的基础上，根据中国人的fut1基因分子背景，专门针对在中国人中新发现的fut1236delg等位基因而设计的。本发明不仅在弥补血清学技术的不足上具有重要的临床实用意义，而且还具有广泛的科研应用价值。该检测方法不仅可用于特定个体的fut1基因鉴别及(类)孟买血型鉴定，而且由于筛选成本低、操作简单，还可用于大量样本的筛选，以建立(类)孟买血型捐献者资料库，为(类)孟买血型患者提供相合的血液。
附图说明
34.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
35.图1为本发明实施例中fut1236delg等位基因检测凝胶电泳图；其中m为dnamarker，从下至上分别是150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp；泳道1为dna为野生型，引物为野生型引物；泳道2为dna为野生型，引物为突变型引物；泳道3为dna为突变型，引物为野生型引物；泳道4为dna为突变型，引物为突变型引物；泳道5为dna为杂合型，引物为野生型引物；泳道6为dna为杂合型，引物为突变型引物；内控基因：β
‑
actin，产物200bp；
36.图2为本发明实施例中fut1236delg等位基因突变测序图；图2a为待测样本3的杂合突变型结果；图2b为待测样本1的野生型结果，
37.图3为酶结构的3d模拟图，其中图3a为野生型酶结构的3d模拟图；图3b为突变型翻译产物的3d模拟图。
具体实施方式
38.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
39.以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
40.在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
41.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
42.本技术发现fut1基因上存在的新等位基因236delg，即类孟买血型fut1 236delg等位基因为hh血型系统变异型fut1基因编码区域由起始密码子第236位碱基缺失了1个g。
43.然后根据fut1基因上发现的新等位基因236delg建立了一种新的基于pcr方法的fut1基因突变检测制品和检测方法。具体地，利用突变基因与野生型基因在突变点碱基序列的差异设计出序列特异性引物，并通过基因扩增方法对携带突变基因的个体进行鉴别。该检测制品和检测方法可以高灵敏度且高精度检测掺杂于基因库中该突变基因的有无。该特异性引物的上游引物序列如seq id no:1所示，下游引物序列如seq id no:2所示，用于检测fut1 236delg等位基因。而针对野生型fut1基因的引物序列如seq id no:3所示和seq id no:2所示(反向引物序列为突变型与野生型共用，不具突变鉴别特异性)；
44.该类孟买血型fut1基因236delg突变基因的检测方法不仅可用于特定个体的fut1基因鉴别及(类)孟买血型鉴定，而且由于筛选成本低、操作简单，还可用于大量样本的筛选，以建立(类)孟买血型捐献者资料库，为(类)孟买血型患者提供相合的血液。
45.本发明中，“野生型基因”是指未发生突变，具有原本正常功能的含有遗传信息的基因；“突变型基因”是指发生了突变的基因；“突变”是指dna、rna等的核酸序列的改变，相当于遗传学中使用的碱基置换、插入、缺失、倒位、重复、易位等。
46.除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
47.下面将结合实施例、比对例及实验数据对本技术的一种类孟买fut1 236delg等位基因及其检测方法和应用进行详细说明。
48.实施例1孟买血型fut1236delg等位基因
49.本发明实施例提供一种fut1236delg等位突变基因，野生型fut1基因和突变型fut1基因分别如图2所示；与野生型fut1基因相比，突变型fut1基因在基因序列的第236位碱基缺失了1个g。
50.如图3所示，突变型由于在236delg碱基的缺失，导致翻译的提前终止。翻译产物为无实际功能的一个alpha螺旋结构。
51.实施例2、孟买血型fut1236delg等位基因的检测制品和检测方法
52.一、dna模板的制备。
53.采用购置的试剂盒提取全血基因组dna，具体步骤如下：
54.(1)取200μl edta抗凝的全血样本，加入20μlproteinase k溶液，混匀。
55.(2)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清变亮。
56.(3)加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此刻可能会出现絮状沉淀。
57.(4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都转入一个吸附柱cb3中。12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
58.(5)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
59.(6)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
60.(7)重复步骤(6)。
61.(8)12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
62.(9)将吸附柱cb3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空加入50μldnasefree去离子水，室温放置2
‑
5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
63.(10)用1％琼脂糖凝胶电泳来评估dna提取效果，nanodrop nd
‑
1000超微量紫外可见核酸蛋白分析仪检测dna浓度和纯度。
64.二、236delg等位基因检测方法。
65.1、仪器
66.geneamppcrsytem9700型pcr仪(美国abi公司)、syngene
‑
gcxx9型凝胶成像仪(美国syngene公司)、凝胶电泳仪(北京六一公司)。
67.2、试剂
68.血液基因组dna提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，2
×
taqpcrmastermix5ul(北京天根生化科技有限公司)，引物由江苏伟禾生物技术公司合成。
69.3、引物设计
70.根据美国国家生物信息中心(ncbi)genbank记录的fut1(序列号：ng_007510.1)，通过oligo6.0引物软件设计引物，最终确定2对特异性寡核苷酸引物序列：
71.236delg
‑
f5
’‑
cagcaccctgcttccctctccgc
‑3’
72.440wild
‑
r5
’‑
gtactcctccgacatccagtcg
‑3’
扩增大小为250bp；
73.236wild
‑
f5
’‑
cagcaccctgcttccctctccgg
‑3’
，
74.440wild
‑
r5
’‑
gtactcctccgacatccagtcg
‑3’
扩增大小为250bp。
75.同时，引入1对管家基因β
‑
actin的引物作为dna样本扩增阳性对照，β
‑
actin的引物对序列如seq id no:4
‑
no:5所示，具体为：
76.上引物：bactinf：5
’‑
cattaaggagaagctgtgctac
‑3’
(seq id no:4)下引物：bactinr：5
’‑
gaaggtagtttcgtggatg
‑3’
(seq id no:5)
77.扩增产物片段长度为200bp。
78.等位基因检测引物序列及反应特异性见表1。
79.表1.236delg等位基因检测引物序列及反应特异性。
[0080][0081][0082]
注：*f＝正向引物；r＝反向引物。
[0083]
#引物核苷酸序的位置参考fut1标准序列(序列号：ng_007510.1)。
[0084]
4、反应条件。
[0085]
(1)反应总体积：10μl，包括dna模板50ng，正反向引物各为0.4μm，extaqdnapolymerase0.25u(takara)，25mmtaps缓冲液(ph9.3)，50mmkcl，3mmmgso4，1μgnuclease
‑
freebsa，dntpmixture各0.2mm。95℃预变性2min；95℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸10min，冷却至4℃。
[0086]
(2)反应总体积：10μl，包括dna模板50ng，正反向引物终浓度各为0.4μm，2
×
taqpcrmastermix5ul(tiangen)。95℃预变性2min；95℃变性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；最后72℃延伸10min，冷却至4℃。
[0087]
5、等位基因检测。
[0088]
用1.5％琼脂糖凝胶电泳，以150v电泳15min，凝胶紫外成像，扩增效果如图1所示。
[0089]
判断原则为：
[0090]
236delg等位基因携带者样本呈现明亮清晰的236delg特异性扩增产物条带，而非携带者样本则没有236delg特异性扩增产物条带；
[0091]
被检样本既有236delg特异性扩增产物条带又有440wild特异性扩增产物条带，证明其为杂合型236delg等位基因携带者；只有236delg特异性扩增产物条带而没有440wild特异性扩增产物条带，证明其为纯合型236delg等位基因携带者。
[0092]
由图1可知，
[0093]
待测样本1分别采用野生型引物和突变型引物检测，结果分别泳道1和泳道2，表明待测样本1存在440wild特异性扩增产物条带，但没有236delg特异性扩增产物条带，判断待测样本1为野生型；
[0094]
待测样本2分别采用野生型引物和突变型引物检测，结果分别泳道3和泳道4，表明待测样本2不存在440wild特异性扩增产物条带，存在236delg特异性扩增产物条带，判断待测样本2为突变型，且为纯合型236delg等位基因携带者；
[0095]
待测样本3分别采用野生型引物和突变型引物检测，结果分别泳道5和泳道6，表明待测样本3存在440wild特异性扩增产物条带，同时存在236delg特异性扩增产物条带，判断待测样本3为突变型，且为杂合型236delg等位基因携带者。
[0096]
经测序验证，图2a为待测样本3的杂合突变型结果；图2b为待测样本1的野生型结果，测序结果与本发明的判断结果一致，表明本发明判断正确，该方法可靠。
[0097]
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。