一种ACE2人源化小鼠模型的快速构建方法及其应用与流程

一种ace2人源化小鼠模型的快速构建方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种ace2人源化小鼠模型的快速构建策略及其在抗新型冠状病毒sars
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cov
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2治疗药物研发中的应用。


背景技术：

2.当前针对新型冠状病毒sars
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cov
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2疫苗和抗病毒药物的研发仍然亟待加强。
3.动物模型对于理解病毒的发病机理，疫苗开发和药物筛选至关重要。因此，开发新型冠状病毒sars
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cov
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2易感的动物模型，是研发病毒疫苗和抗病毒药物的重要一环。在各类动物模型中，非人类灵长类动物（nhp）与人类更相似，对于临床效果具有更好的预判性。但是，nhp动物模型的应用受到成本高，数量少以及所需饲养设施要求高的限制，不适用于药物研发阶段的大量筛选。因此，适当的小动物模型对于研究和抗病毒治疗的发展是必不可少的。小鼠模型因为具有费用低，繁殖周期短、遗传背景明确并可以进行相应的基因编辑改造等优势，已被广泛用于研究人类冠状病毒的发病机理。人血管紧张素转换酶ii（ace2）已被确定为引发非典型肺炎的sars
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cov病毒和此次sars
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cov
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2病毒感染细胞的功能性受体。但之前的研究表明，sars
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cov
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2可以与人类，蝙蝠或猫的ace2细胞受体结合，感染细胞；但不能结合小鼠自身的ace2。先前利用sars
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cov病毒制备的小鼠模型表明，sars
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cov病毒在小鼠中的复制能力很差，需要通过连续传代适应或制备表达人类ace2的转基因小鼠来构建感染模型。因此，基于两者共同的细胞功能受体推测，sars
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cov
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2病毒易感的小鼠模型的建立很可能也需要这两种途径。但通过病毒在小鼠体内连续传代方法筛选获得适应小鼠的sars
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cov
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2病毒株，进而建立易感模型的方法周期长、失败率高并且对实验条件要求高，需要在bsl3实验室才可进行，不利于模型的快速建立和开发；通过常规转基因方式在小鼠中表达人源ace2，通常需要经过品系建系、表达鉴定等过程，至少需要9
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12个月的时间；通过基因编辑的方式在小鼠中表达人源ace2，因为基因编辑受插入片段大小的影响，进行复杂遗传操作难度大，同时品系也需要经过建系，表达验证等，制备周期不少于9
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12个月的时间。因此，如果不在前期制备相应模型，待疫情爆发很难短时间内制备所需的动物模型。
4.鉴于此，建立一种可以快速获得的sars
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cov
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2病毒易感小鼠模型，对于研究sars
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cov
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2的传播和发病机制，评估疫苗和药物的药效具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种快速构建ace2人源化动物（优选哺乳动物，优选小鼠）模型的方法及其在针对新冠病毒sars
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cov
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2药物研发中的应用。该方法利用piggybac转座子系统，高效的将人源ace2和荧光素酶基因表达框插入小鼠基因组中；通过荧光素酶活体成像系统可快速筛选获得荧光素酶和人源ace2表达的转基因小鼠；人源ace2表达的转基因小鼠为sars
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cov
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2易感模型，可以应用于针对sars
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cov
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2的药物和疫苗效果的评价。
6.转座子（transposon)是一类能在宿主基因组中变更插入位置的可移动遗传因子，其转座活性，可以将外源基因导入受体基因组。piggybac（pb）转座子系统属于dna转座子的
一种，具有转座效率高、负载量大等优点。以前的研究表明，pb转座系统被证明能够在哺乳动物细胞和小鼠中进行高效转座，并成功制备出pb转座子介导的转基因小鼠。
7.荧光素酶(luciferase)是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，以常用的荧光虫荧光素酶(fireflyluciferase)为例，其可以以荧光素（luciferin)为底物,催化底物氧化反应，产生反射光，该发射光可以为配备高灵敏度ccd相机的成像系统所捕获。因此，可以通过成像系统捕获荧光的强度反应荧光素酶的表达量。基于荧光素酶的生物发光不需要激发光，特异性强，被组织吸收少，动物体内无自发光，具有背景低、信噪比高的优点；通过活体成像系统，可以采用非侵入式方法，在动物活体状态下进行观察。
8.ace2人源化小鼠模型构建的具体方法为：构建piggybac转基因载体，该载体结构如图1所示，从左到右依次包含有piggybac转座子5'端反向重复序列（itr）、cag启动子、人源ace2编码区、核糖体接入位点（ires）、萤火称荧光素酶（luciferase）、土拨鼠肝炎转录后调控元件（wpre）、多聚腺苷化（polya）位点和3'端反向重复序列（itr）。该策略采用cag强启动子驱动人ace2的表达，cag启动子包含有cmv病毒启动子的增强子序列，鸡β
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actin的启动子以及兔β
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globin的剪接受体，是一个各组织器官广谱表达的强启动子，该启动子可驱动人ace2在各组织中广泛表达，便于sars
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cov
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2感染各类组织器官；策略中ace2和luciferase通过ires元件相互串联，均为同一个cag启动子所驱动，可以通过luciferase的表达推断人ace2的表达，而luciferase的表达可以通过给予荧光素底物，在活体成像系统下直接检测，因此可以通过活体成像系统检测luciferase表达的方式直接检测ace2的表达，从而将表达人ace2的转基因小鼠筛选出来进行后续的病毒感染和药效评价实验。ace2转基因小鼠的构建从受精卵注射到筛选获得ace2表达的小鼠模型仅需要2个月的时间，实现快速构建。
附图说明
9.为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需使用的附图做简单的介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
10.图1: ace2人源化小鼠模型构建策略及载体信息。图a为ace2人源化小鼠模型构建策略示意图；图b为构建的转基因小鼠载体示意图；图c为构建载体酶切结果。
11.图2: ace2人源化小鼠模型构建。图a为ace2人源化小鼠f0代基因型鉴定pcr产物凝胶电泳代表图(数字为小鼠编号；m为1kb dna marker)；图b为基因型鉴定阳性f0代小鼠活体成像代表图，左侧图片为小鼠背部拍摄结果，右侧图片为小鼠腹部拍摄结果（数字为小鼠编号）；图c为luciferase活体成像广泛表达的22号小鼠解剖各组织luciferase成像结果；图d为luciferase表达小鼠各组织针对ace2蛋白western blot结果（+为luciferase表达阳性小鼠，
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为野生型小鼠）。
12.图3：ace2人源化小鼠感染sars
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cov
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2病毒结果（c57
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wt为野生型小鼠，tg
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hace2为ace2人源化小鼠）。
13.图4：ace2人源化小鼠评估sars
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2中和抗体（即针对ace2的中和抗体）保护效果攻毒实验结果。图a为sars
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cov
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2病毒感染不同时间各组小鼠体重变化图；图b为sars
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cov
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2病毒感染不同时间各组小鼠存活曲线；图c为sars
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cov
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2病毒感染5天后各组存活小鼠肺组织病毒含量检测结果。
具体实施方式
14.实施例一ace2人源化小鼠模型构建。
15.1）piggybac转基因载体构建：piggybac转座子5'端反向重复序列（itr）、cag启动子、人源ace2编码区、核糖体接入位点（ires）、萤火称荧光素酶（luciferase）、土拨鼠肝炎转录后调控元件（wpre）、多聚腺苷化（polya）位点和3'端反向重复序列（itr）序列依次为seq id no:1
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8。cag启动子通过pcr扩增的方式以plvct
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ttr
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krab质粒为模板扩增获得，其余片段通过全基因合成获得。构建过程中，先通过in
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fusion的方法将两个itr及酶切位点连入pbr322载体，获得pbr322
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itr骨架载体；然后将cag启动子、合成的人源ace2片段、ires
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luciferase
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wpre
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polya通过in
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fusion的方式连接入pbr322
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itr骨架载体，获得最终的pbr322
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itr
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ace2转基因载体。载体经酶切及测序验证正确后，进行后续的转基因小鼠制备，载体酶切结果如图1c所示。
16.2）ace2转基因小鼠构建：取c57bl/6小鼠的受精卵，按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法将pbr322
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itr
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ace2质粒和转座酶pbase mrna混合后,进行受精卵显微注射，注射后的受精卵经培养箱短暂培养后，移植至受体母鼠的输卵管，获得基因修饰小鼠f0代小鼠。f0代小鼠出生后，剪尾抽提基因组，分别针对ace2和luciferase设计pcr上下游引物，通过pcr对f0代小鼠基因型进行鉴定。pcr鉴定条件如下引物信息如下：引物名称序列信息（5
’→3’
）ace2
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foratagtggttggcattgtcatcc（seqidno:9）ace2
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revtccagcggttccatcttcc（seqidno:10）pcr反应体系：pcr反应组成体积 (
µ
l)ddh2o31pcr buffer102.5 mm dntp4ace2
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for1ace2
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rev1dnapolymerase2genomic dna1总计50pcr反应程序：步骤温度（℃）时间备注1982 minꢀ29815 secꢀ36015 secꢀ
4681 min重复步骤2
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4共34个循环5685minꢀ61210minꢀpcr鉴定代表性结果如图2a所示，根据pcr鉴定结果，xx只f0代小鼠有xx只阳性，小鼠的阳性率约为30%。
17.3）luciferase和ace2表达验证：为了验证基因型鉴定阳性的小鼠中，luciferase表达，对阳性小鼠进行了活体成像检测，简要过程为：小鼠剃去腹部和背部毛发后，给予腹腔注射d
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luciferin(150ul/只，浓度为15mg/ml)，注射5分钟后对小鼠实施麻醉，注射10分钟后，将小鼠放入小动物活体成像系统（ivis lumina）检测，对不同体位小鼠的luciferase荧光信号进行采集，代表性结果如图2b所示，结果显示检测的10只基因型鉴定阳性小鼠中有6只小鼠可以检测到很强的luciferase荧光信号，2只可以检测到相对弱的荧光信号，luciferase的表达率约为80%；为了进一步确认转基因小鼠体内各组织luciferase的表达情况，发明人选择其中一只小鼠进行解剖，对各个组织的荧光表达进行了成像，结果如图2c所示，结果表明：与动物整体成像结果类似，在阳性小鼠的各个组织中均检测到luciferase的活跃表达。根据理论推测，因为ace2和luciferase受同一个cag启动子驱动，两者通过ires串联，luciferase的表达量可以反应ace2的表达，为了对luciferase阳性小鼠中ace2蛋白的表达进行验证，发明人对luciferase阳性小鼠中主要组织中ace2蛋白表达进行了western blot检测，结果如图2d所示，在luciferase阳性小鼠的主要组织中可以检测到ace2的活跃表达，而野生型小鼠中检测不到人源ace2的表达。因此，luciferase可以作为ace2表达的检测指标，利用活体成像系统可以在活体状态下对f0代ace2转基因小鼠的ace2蛋白表达进行快速筛选。
18.实施例二ace2人源化小鼠sars
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cov
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2病毒易感模型构建ace2人源化小鼠sars
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cov
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2病毒感染和检测实验在生物安全三级实验室（bsl
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3）完成，将5只luciferase表达检测阳性的f0代小鼠和5只野生型c57bl/6小鼠在生物安全柜中，通过滴鼻的方式将50μl（4.15
×
10
4 pfu）sars
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cov
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2病毒溶液滴入小鼠鼻腔中，感染4天后，取小鼠肺组织，抽提rna反转录后进行实时荧光定量pcr (realtime pcr) 检测不同组小鼠肺组织中sars
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cov
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2病毒的含量，结果如图3所示，结果表明：sars
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cov
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2病毒感染4天后，luciferase表达阳性的ace2人源化小鼠肺组织中的病毒含量约为野生型小鼠的1000倍，说明ace2人源化小鼠对新冠肺炎sars
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cov
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2病毒易感。
19.实施例三利用ace2人源化小鼠评估sars
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cov
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2中和抗体保护效果。
20.为了验证ace2人源化小鼠能否应用于针对sars
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cov
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2中和抗体、疫苗以及其他潜在药物体内效果的评估，发明人在生物安全三级实验室（bsl
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3）中，利用ace2人源化小鼠开展了给药和体内攻毒实验。将21只luciferase荧光表达检测阳性的f0代小鼠，分为四组：对照组、中和抗体低剂量组、中和抗体中剂量组和中和抗体高剂量组。通过滴鼻的方式将50μl（4.15
×
10
4 pfu）sars
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cov
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2病毒溶液滴入小鼠鼻腔中，建立sars
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cov
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2病毒感染模型，滴鼻2小时后，小鼠分别给予不同剂量的中和抗体，分组和给药情况如下表所示。
组别小鼠数量给药（感染2h后）剂量(mg/kg)给药途径
对照组6pbs
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腹腔注射中和抗体低剂量组5neutralizingantibody
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lowdose5腹腔注射中和抗体中剂量组5neutralizingantibody
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mediumdose10腹腔注射中和抗体高剂量组5neutralizingantibody
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highdose20腹腔注射
21.感染给药后，每天记录小鼠状态和体重，感染5天后，取存活小鼠肺组织，抽提rna反转录后进行realtime pcr，检测不同组小鼠肺组织中sars
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cov
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2病毒的含量。实验结果如图4所示，结果表明：病毒感染后，4组小鼠的体重均有明显下降；高剂量中和抗体给药的小鼠，感染5天后仍然全部存活，中剂量给药的存活率为80%，对照组和低剂量组存活率分别为50%和40%，且小鼠状态较差；相对于对照组，中剂量和高剂量给药组存活小鼠肺组织病毒含量显著低于对照组存活小鼠肺组织中的病毒含量。以上结果表明，在ace2人源化小鼠的sars
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cov
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2攻毒实验中，给予中剂量和高剂量的中和抗体可以有效的避免sars
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cov
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2感染导致的人源化小鼠死亡和病毒在体内的复制，说明ace2人源化小鼠可以应用于针对sars
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cov
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2中和抗体、疫苗以及其他潜在药物的体内效果评估。
22.综上所述，发明人提供了一种快速构建ace2人源化小鼠模型的方法，利用piggybac转座酶系统对ace2基因的高效转基因，结合荧光素酶报告基因和活体成像系统，可以将表达ace2的阳性转基因小鼠快速筛选出来，在f0代时即可进行相关的应用，时间只需要2
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3个月，即可完成构建；同时，发明人开展了ace2人源化小鼠进行抗sars
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2病毒药物体内药效验证的研究，提供了利用该模型进行抗sars
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2病毒药物研发的应用场景。