一种检测食管癌标志物P16抗原表位氨基酸序列及应用

一种检测食管癌标志物p16抗原表位氨基酸序列及应用
技术领域
1.本发明属于免疫学技术领域，是一种用于制备食管癌早期诊断试剂。


背景技术：

2.大量研究表明，血清或血浆中的肿瘤相关抗原能诱导机体产生抗原表位,在肿瘤患者血清中既存在肿瘤抗原,也存在针对该肿瘤抗原的抗原表位。因此，既可以利用抗体检测肿瘤抗原,也可以利用抗原检测肿瘤抗原表位，但利用肿瘤抗原表位检测肿瘤的特异性和敏感性均比利用肿瘤抗原检测肿瘤要高得多。很多肿瘤相关抗原不仅在肿瘤患者体内存在，在正常人体内也存在，因此检测肿瘤相关抗原作为诊断依据可信性差。而抗原表位在正常人体内含量很低检测不到或根本不存在，若体内抗原表位水平明显增高，则表明体内存在异常免疫情况，表明体内相关抗原水平发生波动，预示疾病的存在或原有疾病加重。
3.近年来的研究表明，在恶性肿瘤体积发展到可用现代影像学技术检出之前3
‑
5年，患者血中可出现高浓度的肿瘤相关抗原抗原表位。因此，检测血中肿瘤相关抗原抗原表位具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值，是肿瘤临床诊断领域的重点发展方向之一。在国外已有诊断肺癌和乳腺癌的早期诊断试剂盒市售。然而，目前所报道的抗体检测方法敏感度低，特异性差，假阴性比率可高达50％以上，其主要原因是由于每一种肿瘤相关抗原抗原表位在患者中的阳性检测率平均在10％左右，如何提高诊断试剂敏感度是当前需要亟待解决的关键问题。比较行之有效的方法是寻找新的可充当肿瘤标志物的抗原表位，然后与现有已知的抗原表位组合成具有敏感度高和特异性强的诊断试剂盒。
4.多重肿瘤抑制基因p16，又名p35，位于人类9号染色体的短臂(9p21)，编码分子量为16kd的蛋白—p16，此蛋白位于细胞浆和细胞核内。除脑、骨骼和肌肉外，广泛地表达于各种组织器官。在功能上，p16对细胞周期起负性调节作用，可以抑制细胞周期关键酶
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cdk4和cdk6，阻止细胞从g1期进入s期。肿瘤患者常合并p16基因的突变、异常或缺失，从而影响p16蛋白的功能，p16表达异常会直接导致细胞恶性增殖。当患者接受化疗、放疗后，肿瘤细胞死亡会释放出大量的p16蛋白的碎片，诱导免疫系统产生抗原表位。在国内关于胃腺癌、卵巢浆液性囊腺癌及子宫内膜癌的研究中发现，癌组织中p16基因表达呈上升趋势，但到了癌症中、晚期其表达率反而低于癌症早期，这提示p16可能成为区分病变的良恶性和病情严重性以及预后判断的有效指标。


技术实现要素：

5.本发明提供一种检测食管癌标志物p16抗原表位氨基酸序列及应用，通过自行设计的p16的抗原表位多肽，检测食管癌患者血清及血浆中抗原表位水平并开发相应的试剂，预测肿瘤发生的危险性，并为肿瘤新药研究提供可靠的数据。。
6.本发明采取的技术方案是：提供一种检测食管癌标志物p16抗原表位的氨基酸序列为seq id no.1：n
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sdtavnidnflsryaeqhrnelqmqlta
‑
c。
7.其纯度>95％，ph>7.0。
8.本发明所述的p16抗原多肽在制备食管癌早期诊断试剂盒中的应用。
9.本发明利用自行设计的p16蛋白的线性多肽，采用elisa法检测食管癌患者血清及血浆中抗p16蛋白的特异性自身igg抗体，该反应具有高特异性和高灵敏性。自身igg抗体水平升高表明肿瘤患者体内p16蛋白的表达量增加，预示患者可能出现原发性或继发性肿瘤，可以预测肿瘤发生与复发的危险性，指导临床医生对肿瘤的早期诊断，p16抗原多肽可用于制备肿瘤早期诊断试剂盒。
附图说明
10.图1是p16抗原多肽与血浆igg结合的sbi曲线图；
11.图2是p16抗原多肽检测食管癌的roc曲线图。
具体实施方式
12.p16蛋白质氨基酸序列为seq id no.1：
13.n
‑
sdtavnidnflsryaeqhrnelqmqlta
‑
c
14.抗原抗体的结合实际上只发生在抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间，两者在空间结构和空间构型上完全互补。因此抗原决定簇就可以代表整个蛋白与抗体结合的状态与亲和特性。另外，以重组蛋白为抗原，要经过载体构建、转染、表达、筛选、纯化等繁琐的过程，蛋白空间结构复杂，抗原表位不易暴露，因此抗原抗体结合的特异性差。另外，elisa法的高灵敏性对纯化技术的稳定性要求极高，成本昂贵。
15.遵循以下原则设计线性多肽抗原：
①
选择细胞膜蛋白表面区域；
②
选择不形成a
‑
helix的序列；
③
两端的肽段比中间的排列合理；
④
避免蛋白内部重复；
⑤
避免同源性强的肽段；
⑥
序列中尽量避免cys和glu，不可以有太多的pro，但有1
‑
2个pro利于肽链结构稳定，对产生特异性抗体有益。此外，该多肽抗原必须含有人类白细胞二类抗原(hla)系统的限制性表位，包括hla
‑
dr,hla
‑
dp and hla
‑
dq的限制性表位。这些表位可被90％以上华人群体的hla二类抗原系统所识别。
16.基于以上抗原设计原则及p16蛋白的生物学特性，本发明利用生物信息学和多个表位预测模拟软件，分析与抗原性相关的参数，设计了的线性氨基酸序列为seq id n0.1。
17.elisa法检测抗原表位
18.(1)酶标板设计：每份血浆样本各设人p16抗原多肽双复孔，山羊多肽对照抗原(gag)双复孔和阴性对照双复孔(nc)。gag抗原与人类蛋白质组无同源性，目的是减低非特异性结合反应的干扰，gag的工作浓度范围10
‑
20μg/ml。
19.(2)包被：抗原多肽用包被液(ph7.0～7.4 0.01m pbs/0.1％nan3)包被于96孔酶标板(costar,美国)，每孔100μl，两条p16抗原多肽混合为包被浓度7.5～15.0μg/ml，gag包被浓度为15～20μg/ml，4℃过夜。
20.(3)一抗/血浆孵育：0.01m pbs/0.005％tween
‑
20清洗每孔3遍，利用分析液(0.01m pbs+1％bsa)将血浆1:100稀释，每孔100μl,25℃孵育2～3h；
21.(4)二抗孵育：0.01m pbs/0.005％tween
‑
20清洗每孔5遍，利用分析液(同前)稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人igg(美国，sigma)，每孔加200μl，25℃孵育2h；辣根过氧化物酶标记的羊抗人igg elisa工作范围：1:20000～1:50000。
22.(5)显色：0.01m pbs/0.005％tween
‑
20清洗每孔5遍，利用3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺(tmb)过氧化物酶的底物(invtrogen，美国)，每孔加100μl，室温避光15～30min。
23.(6)检测：每孔加50μl 10％h2so4为反应终止液，10min内使用酶标仪(bioteck elx800，美国)检测od值，检测波长为450nm，参考波长为630nm。
24.质控各样本设双复孔，取平均od值。od值离散度判定：离散度＝od1
‑
od2/od1+od2，离散度≤0.1，为有效结果；离散度>0.1,为无效结果。取100份健康人血清等体积混合作为质控血(quality control,qc)，代表人群的普遍情况，每板均设2个qc血浆孔，以qc血浆孔的od值变异水平判定结果的稳定性，批间变异cv＝所有批次qc孔sd/所有批次qc孔od均值<20％。批内变异cv＝每日各板qc孔sd/每日各板qc孔均值<10％。
25.数据分析采用spss22.0 for windows进行统计学分析。采用特异结合指数(specific binding index，sbi)来判定p16抗原多肽与血浆抗原表位的结合程度，sbi＝p16od值
–
nc od/gag od值
–
nc od，nc为各样本的阴性对照。roc曲线是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以真阳性率(灵敏度)为纵坐标，假阳性率(1
‑
特异度)为横坐标绘制的曲线。roc曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在au>0.5的情况下，au越接近于1，说明诊断准确度越好。roc曲线将灵敏度与特异性以图示方法结合在一起，可准确反映某分析方法特异性和敏感性的关系，是试验准确性的综合代表。该发明采用analyse
‑
it for microsoft excel软件绘制roc曲线，计算曲线下面积(au)，以健康人sbi平均值+2sd判为阳性，判定灵敏度和特异度；进行秩和(z)检验，检验一类错误水准为a＝0.05。
26.实施例1p16抗原多肽与血清及血浆igg结合的过程
27.由图1可知，p16浓度5～10μg/ml时，随着浓度的增大，sbi值逐渐下降，当p16抗原多肽浓度10～15μg/ml时，随着浓度的增大，sbi值逐渐上升。此sbi结合曲线表明，当p16抗原多肽为5μg/ml(0.5μg/well)的较低浓度时，96孔酶标板的板底没有被铺满，导致非特异性反应高，所以此时sbi值偏高，为假阳性结果；随着p16抗原多肽浓度增高，抗原逐渐铺满整个板底，其阻断作用显现，非特异性反应逐渐减小，到10μg/ml时非特异性反应最低，此时p16抗原多肽与igg抗体的特异性结合开始出现，并随着抗原浓度的增高逐渐增强，至15μg/ml时结合力最强，之后趋于平稳。此sbi结合曲线充分展现了p16抗原多肽与血浆中自身igg抗体的特异性结合反应过程。
28.实施例2试剂盒制备
29.1、试剂配制如下：
30.抗原包被缓冲液：
31.叠氮钠0.1g
32.pbs(0.01m，ph7.4) 100ml 4℃保存
33.0.1m pbst洗涤缓冲液(1000ml体积)：
34.nacl 8g
35.kcl0.2g
36.na2hpo4.12h2o 2.9g
37.k h2po
4 0.2g
38.tween
‑
20 0.5ml
39.4℃保存,临用前稀释10倍
40.样品稀释分析液：
41.bsa1.0g
42.0.01mpbs up to 100ml
‑
20℃保存
43.终止缓冲液：
44.浓h2so410.9ml
45.蒸馏水89.1ml
46.up to 100ml室温保存
47.工作抗原：
48.p16多肽抗原5mg
49.67％乙酸1ml
50.‑
20℃保存，临用前用包被液稀释至7.5～15μg/ml
51.参比抗原：
52.gag 5mg
53.67％乙酸1ml
54.临用前用包被液稀释至20μg/ml，
‑
20℃保存
55.二抗标准液：
56.hrp
‑
igg工作范围：1:30000～1:50000
57.‑
20℃保存
58.底物显色液：
59.3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺(tmb)100μl/well
60.‑
4℃保存
61.2、操作
62.(1)包被：工作抗原及参比抗原用包被液稀释至工作浓度，包被于酶标板，4℃过夜。
63.(2)加血浆(一抗):酶标板应用洗涤缓冲液清洗3遍，利用分析液将血浆稀释至合适浓度，一般为1:200～1:500，每孔100μl,25℃或室温孵育2～3h；
64.(3)二抗孵育：洗涤缓冲液清洗3～5遍，利用分析液稀释二抗标准液igg，每孔加200μl，25℃/室温孵育2h；
65.(4)显色：洗涤缓冲液清洗3～5遍，每孔加100μl底物显色液，室温避光15～30min。
66.(5)检测：每孔加50μl终止液，10min检测，波长为450nm，参考波长为630nm。
67.实施例3食管癌患者p16自身igg抗体检测
68.1、样本来源：收集400份肿瘤患者及健康人血浆样本。健康组200例，年龄,平均年龄为52.9
±
28.24岁。食管癌组200例,平均年龄为60.27
±
8.33岁。健康组与食管癌组在性别、年龄匹配，具有可比性(p>0.05)。
69.2、检测结果：由表1可知，食管癌患者血浆中p16抗原多肽的igg抗体roc曲线下面积(au)为0.682，灵敏度为26.0％，特异度为90％。图2为p16抗原多肽检测食管癌的roc曲线。在食管癌患者igg自身抗体的检测中，食管癌患者血浆中的p16自身抗体表达与健康对照组相比具有显著差异(p＝0.000)。在分期统计中，早期和晚期均出现显著性表达差异，见表2。以上数据充分表明，利用本发明所设计的抗原多肽检测得到的食管癌患者抗原表位
igg水平与正常健康组比较有显著性统计学差异。
70.表1食道癌与肺癌患者中p16自身igg抗体检测roc曲线分析结果
[0071][0072]
表2食道癌与健康人中p16自身igg抗体检测对比分析结果
[0073][0074]
a
自身抗体检测水平用sbi(mean
±
sd)表示；
[0075]
b student’s t检验；
[0076]
c
食管癌p16 igg水平与健康组p16 igg水平对比。