一株蜡样芽孢杆菌FJ2B-137在水稻纹枯病生物防治中的应用

一株蜡样芽孢杆菌fj2b
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137在水稻纹枯病生物防治中的应用
技术领域
1.本发明属于植物病害生物防治领域，具体涉及一株蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）fj2b
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137在水稻纹枯病生物防治中的应用。


背景技术：

2.目前防治水稻纹枯病的主要方法是喷洒化学药剂杀灭纹枯病病原菌，但是其严重危害和负作用也随之而来。相比于水稻纹枯病对水稻产量的影响，化学农药残留问题对人类健康影响更大，而且还会污染土壤环境以及导致病原菌产生抗性等一系列问题。这些负面影响将成为推行绿色环保种植方式以及农业可持续发展的障碍。因此，水稻纹枯病的绿色防治成为了当今农业研究的热点之一。该病害可侵害叶鞘、叶片、茎秆和稻穗，发病部位产生大面积云纹状病斑，从而给水稻生产造成严重危害。水稻纹枯病由立枯丝核菌（rhizoctonia solani）引起，该菌不产生分生孢子而是以菌核的形式在土壤中长期存活，成为其下一次侵染水稻的初侵染源。种植抗病品种是防治植物病害最有效且最环保的手段之一，而水稻对纹枯病的水平抗病性导致至今尚未发现可用于生产的免疫或高抗品种。因此，目前生产上的当务之急是制订一套对人类健康安全、对生态环境绿色环保且可以有效防治水稻纹枯病的措施。当前生产中最受欢迎的一种代替农药的有效方法是利用有益微生物防治纹枯病。利用有益微生物进行生物防治经济有效，且无副作用，也是当今植物病理学科的研究热点之一。因此利用拮抗微生物对水稻纹枯病进行生物防治势在必行，其中利用拮抗细菌防治植物病害已显示出良好的应用前景。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于针对水稻纹枯病化学防治时产生的危害以及生防菌资源库匮乏等问题，提供从水稻田土壤中分离筛选出可用于水稻纹枯病生物防治的一株蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）fj2b
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137。
4.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一株防治水稻纹枯病的生防菌株蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）fj2b
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137，其分类命名为蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus），已于2021年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为cgmcc no.22015。
5.一种水稻纹枯病的生物菌剂，所述生防菌剂包含蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）fj2b
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137或该菌株的无菌体发酵液。
6.上述无菌体发酵液的制备方法，包括以下步骤：将蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）fj2b
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137接种到装有10 ml的lb液体培养基中，在37 ℃恒温摇床中180 r/min振荡培养12 h，获得活化菌液；然后在50 ml lb液体培养基中接种1 ml活化的菌液，37 ℃，180 r/min振荡培养24 h，获得新鲜菌液；收集新鲜菌液，在8,000 r/min条件下离心10 min，取上清，用直径为0.22 μm的无菌滤膜对其过滤，获得无菌体发酵液。
7.上述lb液体培养基组分为：每升培养基中含10 g tryptone、5 g yeast extract、5 g nacl，蒸馏水定容到1 l。上述一株蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）fj2b
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137作为生防菌株在抑制水稻纹病病原菌立枯丝核菌（rhizoctonia solani）在生物防治水稻纹枯病中的应用。
8.上述生防菌剂在水稻纹枯病防治中的应用。
9.本发明的有益效果：本发明筛选出的细菌菌株蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）fj2b
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137及其无菌体发酵液能显著抑制水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌（rhizoctonia solani）的生长和菌核的萌发。分离筛选自水稻根际土壤的该菌株不仅能有效防治水稻纹枯病，而且作为一种绿色环保的生物制剂能显著减少对农业的污染，有效改善土壤环境，从而将对环境的危害降至最低。该菌株的培养条件简单、易于保存和工业化生产等特征使其成为一种理想的生防菌剂。
10.附图说明：图1 蜡样芽孢杆菌菌株fj2b
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137的16s rdna序列的系统发育树。
11.图2 蜡样芽孢杆菌菌株fj2b
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137的菌落形态及其革兰氏染色。a为菌株蜡样芽孢杆菌fj2b
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137的菌落形态；b为蜡样芽孢杆菌菌株fj2b
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137的革兰氏染色。
12.图3 蜡样芽孢杆菌菌株fj2b
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137与水稻纹枯病立枯丝核菌（rhizoctonia solani）gd
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118的对峙培养。
13.图4 蜡样芽孢杆菌菌株fj2b
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137的无菌体发酵液对水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌（rhizoctonia solani）gd
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118生长的抑制作用。 a为水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌（rhizoctonia solani）gd
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118在含细菌菌株fj2b
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137无菌体发酵液和无菌水作为对照的pda培养基上的菌落形态；b为水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌（rhizoctonia solani）gd
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118在含细菌菌株fj2b
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137无菌体发酵液和无菌水作为对照的pda培养基上的菌落直径。
14.图5蜡样芽孢杆菌菌株fj2b
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137无菌体发酵液对水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌（rhizoctonia solani）gd
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118菌核萌发菌丝的影响。
具体实施方式
15.下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，在此发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
16.实施例1 水稻根际土壤微生物的分离先取10 g采集于福建省农业科学院水稻研究所黄山试验基地的水稻根际土壤土样，加入到90 ml的无菌水中，振荡20 min。取1 ml该液体到无菌试管中，然后加入9 ml无菌水，得到浓度为原液的土液，标记为10
‑1；按照该方法再取1 ml前述标记为 10
‑1的稀释液加入到9 ml的无菌水中得到浓度为原液10
‑2的稀释液，接下来按此依次倍比稀释，制成10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4和10
‑5不同稀释度的样液；最后取200 μl稀释度为10
‑5的稀释液，均匀涂布在lb固体培养基（10 g/l tryptone、5 g/l yeast extract、5 g/l nacl、15 g/l agar）上；放于37 ℃恒温培养，待平板上形成菌落后，取单一菌落在新的平板上做分区划线培养，并进行编号。
17.实施例2 生防菌的筛选和细菌菌株fj2b
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137的鉴定
首先在pda平板中央接种立枯丝核菌（rhizoctonia solani），然后将pda平板分为4个区，每个区中央点接种一株细菌；然后置于29 ℃黑暗条件下恒温培养2 d。在2 d后观察立枯丝核菌（rhizoctonia solani）和细菌之间是否有抑菌带形成。接下来对形成抑菌带的细菌与立枯丝核菌（rhizoctonia solani）做进一步对峙培养，从而最终确定生防效果好的细菌，每个处理3次重复，整个实验重复三次。最终发现对立枯丝核菌（rhizoctonia solani）生长有明显抑制作用的是菌株fj2b
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137。
18.利用分子生物学方法对细菌fj2b
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137分类学地位进行初步确定。首先是获得细菌菌株fj2b
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137的新鲜菌液，提取该菌株的gdna；然后以gdna作为模板，使用通用引物27
‑
f (5
′‑
agagtttgatcctggctcag
‑3′
) 和1492
‑
r (5
′‑
ggttaccttgttacgactt
‑3’
)pcr扩增16s rdna基因，条件如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min；所得pcr产物由铂尚生物科技 (福州) 有限公司测序，测得该细菌菌株的16s rdna序列 (seq id no.1) 在ncbi 网站上进行blast比对，发现其与蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）同源性最高，相似度达99%。利用mega 7软件进行序列分析，并构建系统发育树，结果表明菌株fj2b
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137与蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）亲缘关系最近（图1）。
19.对fj2b
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137单菌落划线培养观察该菌落形态，结果显示：菌株fj2b
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137菌落为圆形或近圆形，其菌落表面粗糙且稍干燥，在pda平板上表面为灰白色（图2 a）。按照革兰氏染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司) 的步骤对细菌fj2b
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137进行染色。具体步骤如下：先将菌液涂片固定，取新鲜的fj2b
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137菌液10 μl轻轻涂在载玻片上，均匀涂开；然后加100 μl结晶紫充分染色1 min，用蒸馏水冲洗掉玻片表面的结晶紫；接下来加100 μl碘液染色1 min，盖上盖玻片，用蒸馏水冲洗，并用酒精灯烘干水分；再加脱色液摇动载玻片20 s~30 s，让涂有菌液区域能够充分脱色，蒸馏水冲洗并风干；加番红染色1 min，蒸馏水冲洗并风干；最后在油镜下观察并拍照。结果显示：细菌菌株 fj2b
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137革兰氏染色为蓝色，细胞呈棒状，由此可见细菌菌株fj2b
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137为革兰氏阳性菌（图2b）。最后结合前述分子生物学鉴定的结果判定细菌菌株fj2b
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137为蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）。
20.实施例3：细菌菌株fj2b
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137及其无菌体发酵液对立枯丝核菌（rhizoctonia solani）菌丝生长和菌核萌发的影响1. 细菌菌株fj2b
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137对立枯丝核菌（rhizoctonia solani）菌丝生长的影响本实例利用对峙培养的方法，即将水稻纹枯病立枯丝核菌（rhizoctonia solani）与细菌菌株fj2b
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137接种到同一pda培养基的培养皿中共同培养，观察该细菌菌株对立枯丝核菌（rhizoctonia solani）菌丝生长的抑制作用。具体步骤如下：首先将细菌菌株fj2b
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137和由华南农业大学周而勋教授馈赠的水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌（rhizoctonia solani）gd
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118菌株分别接种在lb液体培养基和pda培养基上进行活化；接下来将在 pda培养基上培养2 d 的水稻纹枯病病原菌取直径为5 mm的菌饼接种于距pda培养皿边缘三分之一位置处，同时取10 μl上述活化后新鲜且均匀的fj2b
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137菌液接种在与立枯丝核菌（rhizoctonia solani）gd
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118对称的另一端距边缘三分之一位置的地方；用等量灭菌水作为对照。待加入的10 μl新鲜fj2b
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137菌液和对照无菌水都完全干燥后，放于29 ℃恒温培养箱倒置培养。由于立枯丝核菌（rhizoctonia solani） gd
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118生长速度快，所以每隔两小时观察菌丝生长情况，并测量抑菌带宽。结果显示：在29 ℃恒温培养36 h后，与对照组相
比，在细菌菌株fj2b
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137与水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌（rhizoctonia solani）gd
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118的菌丝之间可观察到有明显的抑菌带，平均抑菌带宽为4.10 mm（图3）。统计分析结果显示对照组与处理组二者的抑菌带宽具有显著性差异（p=0.001<0.05），表明细菌菌株fj2b
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137对立枯丝核菌（rhizoctonia solani）菌丝生长的抑制效果显著。
21.2. 细菌菌株fj2b
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137无菌体发酵液对立枯丝核菌（rhizoctonia solani）菌丝生长的影响首先将蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）fj2b
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137接种到装有10 ml的lb液体培养基中，在37 ℃恒温摇床中180 r/min振荡培养12 h，获得活化菌液，然后取1 ml活化的菌液转接到装有50 ml lb液体培养基的摇瓶中，37 ℃，180 r/min摇床培养24 h，获得新鲜菌液；接下来在超净台中将菌液等量分装到2个50 ml无菌离心管中，于4 ℃，8,000 r/min的条件下离心10 min，在超净台中取上清，弃沉淀。将获得的上清液用直径为0.22 μm的无菌滤膜过滤，获得无菌体发酵液，然后将其分装后置于4 ℃冰箱保存；随后取 1 ml的菌株fj2b
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137的无菌体发酵液加入到9 ml温度约 45 ℃的pda培养基中，用枪吹打混匀，倒板；待混有无菌体发酵液的pda培养基凝固后，在平板中央接种水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌（rhizoctonia solani）gd
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118，置于29 ℃倒置培养，每隔四小时取出，测量立枯丝核菌（rhizoctonia solani）的菌落直径，并记录数据；同时以1 ml无菌水与9 ml的pda培养基混合物作为对照。每个处理包括三次重复，整个实验重复三次。结果显示：立枯丝核菌（rhizoctonia solani）gd
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118在对照组和含有fj2b
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137菌株无菌体发酵液的培养基上的菌落直径分别为55.70 mm和42.33 mm，统计分析结果显示对照组与处理组二者的菌落直径具有显著性差异（p<0.05)（图4）。根据抑菌率公式得出fj2b
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137菌株的抑菌率为26.37%。由此可见菌株fj2b
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137的无菌体发酵液对立枯丝核菌（rhizoctonia solani）菌丝生长具有显著抑制作用。
22.3. 细菌菌株fj2b
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137对立枯丝核菌（rhizoctonia solani）菌核萌发菌丝指数的影响首先收集立枯丝核菌（rhizoctonia solani）gd
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118的菌核，即将水稻纹枯病立枯丝核菌gd
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118接种到pda培养基上，29 ℃恒温培养，每隔一天取出观察菌核生长情况，培养 5 d 后，使用无菌的镊子挑选出大小均匀、生长状态良好且无任何污染的菌核，去除菌核表面残留的培养基；然后将处理干净的菌核放在无菌水中反复冲洗干净，每次清洗完一个菌核换一次清洗液，再将菌核放在无菌干燥的滤纸上自然晾干。将前述获得的新鲜无菌体发酵液置于超净台上，倒于无菌培养皿中，将预处理好的菌核用无菌镊子按压浸泡在菌株fj2b
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137无菌体发酵液中，用无菌水处理作为对照组，室温浸泡30 min。然后将浸泡的菌核取出，放在无菌滤纸上自然晾干；接下来将经过无菌体发酵液处理过的菌核接种在pda培养基上，每板呈对称均匀接种四个菌核，放于29 ℃恒温箱培养；随后每隔半小时取出于显微镜下观察菌核菌丝萌发情况。统计萌发菌丝级数，然后计算萌发菌丝指数（萌发菌丝指数=∑（各级萌发菌丝级数
×
各级代表值）/(调查总数
×
最高级代表值)
×
100），萌发菌丝分级标准：0级，菌丝萌发数为1根；1级菌丝萌发数为1~20根；2级，萌发菌丝数为21~50根；3级，萌发菌丝数为51~80根；4级，萌发菌丝数为81~140根；5级，萌发菌丝数为141根及以上。每个处
理包括三次重复，整个实验重复三次。结果如图5所示：在29 ℃恒温培养1 h后，经过对照组无菌水和菌株fj2b
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137无菌体发酵液处理的立枯丝核菌（rhizoctonia solani）gd
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118菌核萌发菌丝指数分别为71.67%和43.33%，统计分析表明对照组与处理组二者的萌发菌丝指数具有显著性差异 (p=0.018<0.05)。以上结果表明，与经过无菌水处理的对照组相比，立枯丝核菌（rhizoctonia solani）gd
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118菌核经过细菌fj2b
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137无菌体滤液处理后其萌发菌丝指数显著下降。由此可见菌株fj2b
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137对立枯丝核菌（rhizoctonia solani）菌核菌丝的萌发有显著的抑制效果（图5）。
23.综上所述，生防菌株蜡样芽孢杆菌（bacillus cereus）fj2b
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137无菌体发酵液能抑制立枯丝核菌（rhizoctonia solani）菌核的萌发和生长，为生物防治水稻纹枯病提供了菌株资源，具有现实意义。
24.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。