一种具包容性且精准鉴定并挖掘稻瘟病Pi2/Pi9广谱持久抗病基因簇的技术体系

一种具包容性且精准鉴定并挖掘稻瘟病pi2/pi9广谱持久抗病基因簇的技术体系
技术领域
1.本发明属于农业生物技术领域，更具体地，涉及一套具有包容性且精确鉴别 并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇的技术体系。


背景技术：

2.水稻是世界上最重要的粮食作物之一，由稻瘟病菌(pyriculariaoryzae)引起 的稻瘟病是水稻生产最严重的障碍之一，每年都造成大量的粮食损失。从环境保 护及农业可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有 效的方法。传统的水稻抗病育种依赖于对育种材料抗性表型的直接鉴定，这不仅 要求育种者必须具备丰富的接种、调查经验，而且还容易受到环境以及人为因素 的影响，鉴定结果容易造成误差，而且目标基因，特别是同类目标基因聚合的选 择效率很低甚或不可能。随着分子标记鉴定技术的发展，其准确、可靠且不受环 境影响等优点使该技术的应用价值及前景越来越受到关注。在植物育种方面，通 过开发与目标基因紧密连锁的分子标记，特别是在基因内部开发其功能特异性的 分子标记，对目标基因进行选择可靠性高，由此大大加快了育种工作的目的性及 效率。
3.一般地，在寄主植物抗病基因与病原菌无毒基因漫长的
‘
军备竞赛’过程中， 抗病基因以进化成本最低的“复等位基因家族”或“基因簇”(gene cluster)的形式， 产生新的抗病特异性才能跟上无毒基因快速变异的步伐。也就是说，在病原菌长 期而强烈的选择压力下，上述
‘
基因簇’一般地产生功能性/非功能性的单倍型 (haplotype)分化；如果是在育种计划中长期使用的广谱持久抗性
‘
基因簇’，在功 能性单倍型中会进一步分化为不同的亚单倍型(sub
‑
haplotype)；而在亚单倍型 中则进一步分化为具有不同抗病特异性的功能基因(functional resistance gene) (zhai et al.2011,new phytologist,189:321
‑
334)。
4.在上述“单倍型
‑
亚单倍型
‑
功能基因”等三级进化历程中都存在明显而清晰 的核苷酸多态性，包括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,snp)以 及多核苷酸多态性(即插入/缺失，insertion/deletion,indel)。在此，将功能基因内 部的snp及indel统称为功能性核苷酸多态性。由此一方面，不同抗源品种鉴 定到的抗病基因经常聚集于同一基因簇中，另一方面，广谱持久抗源品种通常在 多个基因簇中同时存在功能性的抗病基因。以稻瘟病抗病基因为例，在目前报道 的100余个主效基因中，据信至少40％是已知基因的等位基因甚或同一基因；这 些基因主要聚集于水稻染色体1(pi37簇)，2(pib簇)，6(pi2/pi9簇)，8(pi36簇)， 9(pii簇)，11(pik簇)以及12(pita簇)等基因簇中，其中染色体6，11及12的 基因簇是广谱持久抗性基因的主要来源(sharma et al.2012,agricultural research1:37
‑
52；liu and wang 2016,national science review 3:295
‑
308)。
5.如上所述，位于染色体6近着丝粒区域的pi2/pi9基因簇是在全球水稻抗病 育种计划中应用广泛的广谱持久抗源(liu and wang 2016,national sciencereview 3:295
‑
308；wu et al.2016,molecular breeding,36:12)。迄今在该基因簇中 先后分离、克隆了6个抗病基因：pi9(qu et al.2006,genetics,172:1901
‑
1914)；pi2, piz
‑
t(zhou et al.2006,molecular plant
‑
microbe interactions,19:1216
‑
1228)；pi50 (su et al.2015,theoretical and applied genetics,128:2213
‑
2225)；pigm(deng et al. 2017,science,355:962
‑
965)；pizh(实为piz
‑
t；xie et al.2019,philosophicaltransactions of the royal society b biological sciences,374:20180308)。为了把上 述广谱持久抗源基因利用于水稻抗病育种计划中，科研工作者先后开发了一系列 的分子标记【pi2(alam et al.2015,proceedings of the national academy of scienceof india,section b,biological science,9:19)；pi9(scheuermann and jia 2016, phytopathology,106:871
‑
876；zhou et al.2020,rice,13:80)；pi2,pi9(tian et al. 2016,rice,9:19)；pi9,pi2,piz
‑
t,pigm(tian et al.2020,plant disease,104: 1932
‑
1938)】，以提高其利用效率。
6.由于pi2/pi9基因簇是继pik抗病等位基因家族之后，在水稻抗病育种计划 中又一重要的广谱抗源而正在被广泛利用(tian et al.2020,plant disease,104: 1932
‑
1938；xiao et al.2020,rice,13:6；zhou et al.2020,rice,13:80)，在稻瘟病菌 持续而强烈的选择压力下，在“单倍型
‑
亚单倍型
‑
功能基因”等三级进化层面都产 生了复杂而多样的变异。但是，这些研究成果都没有形成具有可操作性的、能广 泛应用于生产实践的技术体系。换言之，上述抗病基因分子标记研究成果几乎都 是针对特定基因的特定位点而零散开发的，彼此之间不具有清晰的可比性及逻辑 性。对于复杂的基因组区域、复杂的基因簇而言，由此产生的3个突出而现实的 问题是：(1)任何没有基于其进化层次而设计的分子标记都难以鉴别在复杂的基 因组区域、复杂的基因簇容易产生测序错误等问题；(2)任何没有基于其进化层 次而设计的分子标记都难以避免因分子标记的技术局限性而产生标记假阳性的 问题(特定片段/位点相同并不代表供试品种就含有与目标基因完全一致的基因)； (3)任何没有基于其进化层次而设计的分子标记都难以构成一个具有包容性及可 比性的技术体系而在复杂基因簇中不断地挖掘、鉴定并命名新基因，以及鉴别在 复杂基因簇中容易产生的“等位基因”、“异名同质基因”、“同名异质基因”以及“真 假目标基因”等问题。


技术实现要素：

7.本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一套具有包容性且精准 鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇的技术体系。该技术体系根据该基因家族 存在清晰的“单倍型
‑
亚单倍型
‑
功能基因”等三级分化而设置其三级检测标记；其 功能性单倍型/非功能性单倍型检测的最优单倍型特异性分子标记组合为 pi2/9
‑
f/n
p/a(933～1239)
及pi2/9
‑
f/n
p/a(3808～4033)
；其功能性单倍型之亚单倍型(pi2/zt, pi50/gm,pi9,piz)检测的最优亚单倍型特异性分子标记组合为 pi2/zt/z
‑
subh
a2726g/t
,pi2/zt/50/gm
‑
subh
c6739a
,pi9/z
‑
subh
c7793t
；其功能性单倍型 之pi2/zt亚单倍型之广谱持久抗性基因pi2检测的最优目标基因特异性分子标记 组合为pi2
cag7902tgt/cgt
及pi2
t7992g
；其功能性单倍型之pi2/zt亚单倍型之广谱持 久抗性基因piz
‑
t检测的最优目标基因特异性分子标记为pi2/zt
gac7905ttc/tta
及 pizt/50/gm
tg8028ct
；其功能性单倍型之pi50/gm亚单倍型之抗性基因pi50/pigm 检测的最优目标基因
特异性分子标记组合为pi50/gm
a7746g
及pi50/gm
g8626c
；其功 能性单倍型之pi9亚单倍型之广谱持久抗性基因pi9检测的最优目标基因特异性 分子标记组合为pi9
t7257c
及pi9/z
t6709g
；其功能性单倍型之piz亚单倍型之新型 抗性基因piz检测的最优目标基因特异性分子标记组合为pi9/z
t6709g
及piz
a7099g
； 任一检测标记不符合本技术体系的鉴定结果都不是相应的目标基因而推断为该 基因簇可能的新基因。
8.本发明的第二目的是提供一种稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇序列比较及其特异 性序列的鉴定方法。
9.本发明的第三目的是提供一种稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇之功能性/非功能性 单倍型特异性分子标记及其鉴定方法。
10.本发明的第四目的在于提供上述稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型 之亚单倍型(pi2/zt,pi50/gm,pi9,piz)特异性分子标记及其鉴定方法。
11.本发明的第五目的在于提供上述稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型 之pi2/zt亚单倍型之广谱持久抗性基因pi2的特异性分子标记及其鉴定方法。
12.本发明的第六目的在于提供上述稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型 之pi2/zt亚单倍型之广谱持久抗性基因piz
‑
t的特异性分子标记及其鉴定方法。
13.本发明的第七目的在于提供上述稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型 之pi50/gm亚单倍型之广谱持久抗性基因pi50/pigm的特异性分子标记及其鉴定 方法。
14.本发明的第八目的在于提供上述稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型 之pi9亚单倍型之广谱持久抗性基因pi9的特异性分子标记及其鉴定方法。
15.本发明的第九目的在于提供利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻 瘟病pi2/pi9抗病基因簇功能基因的技术体系从该基因簇中鉴别未克隆的广谱持 久抗性基因piz的特异性分子标记的开发及其应用
16.本发明的第十目的在于提供利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻 瘟病pi2/pi9抗病基因簇功能基因的技术体系从该基因簇中甄别真假特异性基因 组区域及snp的应用及实例。
17.本发明的第十一目的在于提供利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘 稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇功能基因的技术体系从未知的稻种资源群体中鉴别并 挖掘其新旧功能基因的应用及实例。
18.本发明的第十二目的在于提供利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘 稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇功能基因的技术体系从稻种资源中甄别该基因簇存在 的“等位基因”(pi2/piz
‑
t)的应用及实例。
19.本发明的第十三目的在于提供利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘 稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇功能基因的技术体系从稻种资源中甄别该基因簇存在 的“异名同质基因”(pi50/pigm)的应用及实例。
20.本发明的第十四目的在于提供利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘 稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇功能基因的技术体系从稻种资源中甄别该基因簇存在 的“同名异质基因”[piz(fukunishiki)/piz(irblz
‑
fu)]的应用及实例。
[0021]
本发明的第十五目的在于提供利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘 稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇功能基因的技术体系与其他标记体系鉴别能力比较的 实例。
[0022]
本发明目的通过以下技术方案(技术路线图如图1所示)实现：
[0023]
本发明提供了稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇之序列比较及特异性序列的鉴定方法(图2～10)。其中，
[0024]
从美国国家生物技术信息中心(nationalcenterofbiotechnologyinformation,ncbi；http://www.ncbi.nlm.nih.gov)等公共数据库中检索并下载了9个测序参考品种之稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇的序列，其中，5个已经分离克隆的稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇功能基因的基因组序列(atg
‑
tga之间；全文同)之ncbi登录号为：
[0025]
pi2:dq352453.1；
[0026]
piz
‑
t:dq352040.1；
[0027]
pi50:kp985761.1；
[0028]
pigm:ku904633.2；
[0029]
pi9:dq285630.1。
[0030]
为了便于序列比对分析，加入了4个测序参考感病品种日本晴(nipponbare,npb),一见钟情(hitomebore,htm),沈农265(shennong265,sn265),绥粳18(suijing18,sj18)相应的基因组序列；
[0031]
通过生物信息学方法进行序列比较分析，结果表明，
[0032]
(1)在pi2/pi9抗病基因簇中，各个品种/成员之间存在较大的序列多样性，但是功能性基因/非功能性基因之间仍然存在清晰的单倍型(haplotype；亦称单元型)分化(典型位置如标记#1及#2，以及附加标记#17及#18所示)；
[0033]
(2)在pi2/pi9抗病基因簇功能性单倍型中，进一步存在明显的亚单倍型(sub
‑
haplotype；亦称亚单元型)的分化(典型位置如标记#3～#5所示)；
[0034]
(3)上述pi2/pi9抗病基因簇5个功能性家族成员都存在功能特异性snp(典型位置如标记#6～#14所示)。
[0035]
本发明提供了pi2/pi9抗病基因簇之功能性/非功能性单倍型的特异性分子标记及其鉴定方法(图3)。其中，
[0036]
(1)单倍型特异性分子标记的设计：根据上述pi2/pi9抗病基因簇序列的比对结果，针对功能性/非功能性单倍型分化清晰的基因组区域，开发了单倍型特异性最优的一对p/a标记：#1，pi2/9
‑
f/n
p/a(933～1239)
及#2，pi2/9
‑
f/n
p/a(3808～4033)
；
[0037]
标记说明：#1及#2，为标记的编号；f/n，功能性(functional)/非功能性(non
‑
functional)；p/a，存在(presence；目标基因型)/缺失(absence；非目标基因型)；933～1239，意为#933～1239基因组区段，如此类推；
[0038]
(2)对18个不同类型的供试品种进行了检测，由此可以将其划分为如下2种类型的基因型(单倍型)：
[0039]
功能性单倍型品种：ck1,c101a51；ck2,irblz5
‑
ca；ck3,toride1；ck4,irblzt
‑
t；ck5,nib
‑
e1；ck6,gumeizao4；ck7,75
‑1‑
127；ck8,irbl9
‑
m；ck9,fukunishiki；
[0040]
非功能性单倍型品种：ck10,irblz
‑
fu；ck11,nipponbare；ck12,shennong265；ck13,suijing18；ck14,sasanishiki；ck15,koshihikari；ck16,shin2；ck17,aichiasahi；ck18,fujisaka5；
[0041]
特别地，含有pi9的ck7，ck8之序列严重错误，应该是与nipponbare等非功能性单
倍型品种完全不同的功能性单倍型品种；而非功能性单倍型品种可被 排除于后续的检测中。
[0042]
供试品种说明：18个参考品种之信息如上所述，非必要时，以下恕不赘述。
[0043]
本发明提供了pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型之亚单倍型的特异性分子 标记及其鉴定方法(图4)。其中，
[0044]
(1)亚单倍型特异性分子标记的设计：根据上述pi2/pi9抗病基因簇序列的 比对结果，选择最优的3个snp(a2726g/t,c6739a,c7793t)设计为亚单倍型 特异性分子标记组合，亦即#3,pi2/zt/z
‑
subh
a2726g/t
；#4,pi2/zt/50/gm
‑
subh
c6739a
； #5,pi9/z
‑
subh
c7793t
；
[0045]
标记说明：基因符号为斜体，表示功能基因；基因符号为正体，表示单倍型 或亚单倍型；以pi2/zt/z
‑
subh
a2726g/t
为例，意为pi2/piz
‑
t/piz之共同的亚单倍型 特异性snp；subh,sub
‑
haplotype之略；如此类推；
[0046]
(2)利用上述标记组合，对上述9个功能性单倍型供试品种进行了检测，由 此可以将该基因簇所有已知的6个功能基因(含未克隆基因的piz；全文同)划 分为如下4种类型的基因型(亚单倍型)：
[0047]
pi2/zt亚单倍型品种：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；ck3, toride 1(piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；
[0048]
pi50/gm亚单倍型品种：ck5,nib
‑
e1(pi50)；ck6,gumeizao 4(pigm)；
[0049]
pi9亚单倍型品种：ck7,75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)；
[0050]
piz亚单倍型品种：ck9,fukunishiki(piz)；
[0051]
特别地，piz为未克隆基因，与pi2/piz
‑
t具有相同的snp#2726a；pi50/pigm 之#6739a为测序错误，应为#6739c；pi50/pigm之#7793t为测序错误，应为 #7793c。
[0052]
本发明提供了pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型之pi2/zt亚单倍型之广谱 持久抗性基因pi2的特异性分子标记及其鉴定方法(图5)。其中，
[0053]
(1)pi2特异性分子标记的设计：根据上述pi2/pi9抗病基因簇序列的比对结 果，选择最优的2个snp设计为pi2功能特异性分子标记组合：#6, pi2
cag7902tgt/cgt
(上带，非目标基因；下带，目标基因)及#7,pi2
t7992g
(上带，非 目标基因；下带，目标基因)；
[0054]
(2)对上述9个功能性单倍型供试品种进行了检测，结果表明，上述2个pi2 特异性分子标记都可以将pi2区分于该基因簇所有已知的功能基因：
[0055]
目标基因品种：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；
[0056]
非目标基因品种：ck3,toride 1(piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；ck5,nib
‑
e1 (pi50)；ck6,gumeizao 4(pigmr)；ck7,75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)； ck9,fukunishiki(piz)；
[0057]
特别地，piz
‑
t之#7992t为测序错误，应为#7992g。
[0058]
本发明提供了pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型之pi2/zt亚单倍型之广谱 持久抗性基因piz
‑
t的特异性分子标记及其鉴定方法(图6)。其中，
[0059]
(1)piz
‑
t特异性分子标记的设计：根据上述pi2/pi9抗病基因簇序列的比对结 果，并未发现目标基因piz
‑
t特异性的snp，但是一个最优组合 (gac7905ttc/tta,tg8028ct)却能将目标基因piz
‑
t与该基因簇所有的功能 基因区分开来；将二者组合为piz
‑
t的特异性分子标记：#8,pi2/zt
gac7905ttc/tta
(上 带，非目标基因；下带，目标基因)；#9,
pizt/50/gm
tg8028ct
(上带，非目标基因； 下带，目标基因)；
[0060]
(2)对上述9个功能性单倍型供试品种进行了检测，结果表明，上述piz
‑
t 特异性分子标记组合可以将piz
‑
t区分于该基因簇所有已知的功能基因：
[0061]
目标基因品种：ck3,toride 1(piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；
[0062]
非目标基因品种：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；ck5,nib
‑
e1 (pi50)；ck6,gumeizao 4(pigm)；ck7,75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)；ck9, fukunishiki(piz)；
[0063]
特别地，piz
‑
t之#7905ttc为测序错误，应为#7905gtc；pi50/pigm之 #8028ct为测序错误，应为#8028tg。
[0064]
本发明提供了pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型之pi50/gm亚单倍型之广 谱持久抗性基因pi50/pigm的特异性分子标记及其鉴定方法(图7)。其中，
[0065]
(1)pi50/pigm特异性分子标记的设计：根据上述pi2/pi9抗病基因簇序列的 比对结果，选择最优的2个snp(a7746g,g8626c)将其设计为pi50/pigm功能特 异性分子标记组合：#10,pi50/gm
a7746g
(上带，目标基因；下带，非目标基因)及 #11,pi50/gm
g8626c
(上带，目标基因；下带，非目标基因)；
[0066]
(2)对上述9个功能性单倍型供试品种进行了检测，结果表明，上述2个 pi50/pigm特异性分子标记都可以将pi50/pigm区分于该基因簇所有已知的功能 基因：
[0067]
目标基因品种：ck5,nib
‑
e1(pi50)；ck6,gumeizao 4(pigm)；
[0068]
非目标基因品种：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；ck3,toride 1 (piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；ck7,75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)；ck9, fukunishiki(piz)；
[0069]
特别地，pi50/pigm为“异名同质基因”(详见下述实施例12)。
[0070]
本发明提供了pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型之pi9亚单倍型之广谱持 久抗性基因pi9的特异性分子标记及其鉴定方法(图8)。其中，
[0071]
(1)pi9特异性分子标记的设计：根据上述pi2/pi9抗病基因簇序列的比对结 果，选择最优的的2个snp(t6709g,t7257c)将其设计为pi9特异性分子标记组 合：#12，pi9
t7257c
(上带，非目标基因；下带，目标基因)及#13，pi9/z
t6709g
(上 带，非目标基因；下带，目标基因)；
[0072]
(2)对上述9个功能性单倍型供试品种进行了检测，结果表明，上述pi9特 异性分子标记组合可以将pi9区分于该基因家族所有已知的功能基因：
[0073]
目标基因品种：ck7,75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)；
[0074]
非目标基因品种：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；ck3,toride 1 (piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；ck5,nib
‑
e1(pi50)；ck6,gumeizao 4(pigm)；ck9, fukunishiki(piz)。
[0075]
本发明提供了利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗 病基因簇功能基因的技术体系从该基因簇中鉴别未克隆的广谱持久抗性基因piz 的特异性分子标记的开发及其应用(图9)。其中，
[0076]
(1)piz特异性分子标记的设计：由于目标基因piz尚未分离、克隆，不能进 行pi2/pi9抗病基因簇序列的比对。但是根据该技术体系对pi2/pi9抗病基因簇的 单倍型、亚单倍
型，以及5个已知功能基因的鉴定结果，发现piz属于功能性单 倍型之piz亚单倍型；其中存在2个目标基因piz相关的snp(t6709g,a7099g)； 将其设计为piz特异性分子标记组合：pi9/z
t6709g
(上带，非目标基因；下带，目 标基因)及piz
a7099g
(上带，目标基因；下带，非目标基因)；
[0077]
(2)对上述9个功能性单倍型供试品种进行了检测，结果表明，上述piz特 异性分子标记组合可以将piz区分于该基因家族所有已知的功能基因：
[0078]
目标基因：ck9,fukunishiki(piz)；
[0079]
非目标基因：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；ck3,toride 1 (piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；ck5,nib
‑
e1(pi50)；ck6,gumeizao 4(pigm)；ck7, 75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)。
[0080]
特别地，piz为未克隆基因，与pi9具有相同的snp#6709t；piz
a7099g
为其 特异性分子标记，但仍需与单倍型、亚单倍型以及功能特异性标记pi9/z
t6709g
作 综合判断。
[0081]
本发明提供了利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9 抗病基因簇功能基因的技术体系从该基因簇中甄别真假特异性基因组区域及 snp的实例(图10)。其中，
[0082]
(1)在进行功能性单倍型/非功能性单倍型的检测中，发现含有pi9的ck7 及ck8之序列存在严重错误，二者都是与nipponbare等非功能性单倍型品种完 全不同的功能性单倍型品种；
[0083]
(2)在进行目标基因piz
‑
t的检测中，发现piz
‑
t之#7905ttc为测序错误， 应为#7905gtc；pi50/pigm之#8028ct亦为测序错误，应为#8028tg。
[0084]
特别地，由于pi2/pi9抗病基因簇是位于水稻第6染色体之近着丝粒区域， 整体测序质量不高，造成整个基因簇存在大量的测序错误(详见下述实例分析)。
[0085]
该实例鉴证了本技术体系具有严谨的可比性以及纠错能力，这是有别于普通 标记技术的优越性之一。
[0086]
本发明提供了利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9 抗病基因簇功能基因的技术体系从未知的稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧功 能基因的实例(图11)。其中，
[0087]
(1)供试品种组成：8个pi2/pi9抗病基因簇功能基因携带者作为对照品种 (ck1
‑
8)；ck1,c101a51(pi2)；ck2,toride 1(piz
‑
t)；ck3,nib
‑
e1(pi50)；ck4, gumeizao 4(pigm＝pi50)；ck5,75
‑1‑
127(pi9)；ck6,irbl9
‑
m(pi9)；ck7, fukunishiki(piz)；ck8,2561(piz)；cv1
‑
15为古老的籼稻品种；cv16
‑
30为现代的 籼稻品种；cv31
‑
45为古老的粳稻品种；cv46
‑
60为现代的粳稻品种(zhai et al. 2011,new phytologist,189:321
‑
334；hua et al.2012,theor appl genet 125: 1047
‑
1055；chai et al.2012,rice,in press)；
[0088]
(2)pi2/pi9抗病基因簇之功能性/非功能性单倍型的鉴定(图11a)：在60个 供试品种中，12个功能性单倍型品种(红色标示)：cv14,cv18,cv21,cv22, cv27,cv28,cv29,cv30,cv49,cv52,cv59,cv60；其余48个为非功能性单倍 型品种(黑色标示)而被排除于后续的检测中。
[0089]
(3)pi2/pi9抗病基因簇之亚单倍型的鉴定(图11b)：在12个功能性单倍型供 试品种中，
[0090]
5个为pi2/zt亚单倍型品种(红色标示)：cv28,cv29,cv30,cv52,cv59；
[0091]
1个为pi50/gm亚单倍型品种(蓝色标示)：cv60；
[0092]
pi9亚单倍型品种(绿色标示)：没有；
[0093]
6个为piz亚单倍型品种(浅蓝色标示)：cv14,cv18,cv21,cv22,cv27, cv49；
[0094]
(4)pi2/pi9抗病基因簇功能基因的鉴定：在12个功能性单倍型供试品种中，
[0095]
目标基因pi2携带品种(红色标示；图11c)：cv28,cv29,cv30；
[0096]
目标基因piz
‑
t携带品种(蓝色标示；图11d)：cv52,cv59；
[0097]
目标基因pi50/pigm携带品种(绿色标示；图11e)：cv60；
[0098]
目标基因pi9携带品种(浅蓝色标示；图11f)：没有；
[0099]
目标基因piz携带品种(浅红色标示；图11g)：没有；
[0100]
未知新基因piz
‑
mwz携带品种(紫色标示；图11a
‑
g)：cv14；
[0101]
未知新基因piz
‑
tfb携带品种(紫色标示；图11a
‑
g)：cv18,cv21,cv22, cv27,cv49。
[0102]
特别地，单倍型
‑
亚单倍型
‑
功能基因等三级标记检测的结果分别以独立的彩 色系列标示之。
[0103]
由于最新挖掘的2个未知新基因的基因型既与已知的6个功能基因(含piz) 的不同，它们之间彼此亦不相同，因此，被分别命名为piz
‑
mwz(maweizhan, cv14),piz
‑
tfb(tianfengb,cv27)。
[0104]
该实例鉴证了本技术体系具有强大的包容性及可比性，因为在piz未分离克 隆的条件下，通过单倍型及亚单倍型分析，挖掘了6个piz亚单倍型品种；继而 通过比较该体系中一系列的已知功能基因特异性标记的基因型，鉴证了6个piz 亚单倍型品种都不含有已知的功能基因piz，而是属于piz亚单倍型的2种类型 的新基因piz
‑
mwz及piz
‑
tfb。
[0105]
本发明提供了利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗 病基因簇功能基因的技术体系从稻种资源中甄别该基因簇存在的等位基因 (pi2/piz
‑
t)的实例(图5,6,12)。其中，
[0106]
(1)前期的克隆研究工作表明，pi2/piz
‑
t是该基因簇的等位基因，二者 【pi2(ck1,2)；piz
‑
t(ck3,4)】之间只有8个氨基酸的不同(zhou et al.2006, molecular plant
‑
microbe interactions,19:1216
‑
1228)，且集中于基因组区域 #7902～#8029内(图5,6)；
[0107]
(2)在该技术体系中，2个单倍型特异性标记对18个参考品种的鉴定实例， 结果表明二者携带品种没有差异，皆为功能性单倍型品种(图12a)；
[0108]
(3)在该技术体系中，3个亚单倍型特异性标记对9个功能性单倍型参考品 种的鉴定实例，结果表明二者携带品种也没有差异(图12b)；
[0109]
(4)在该技术体系中，基于pi2特异性snp开发的标记对9个功能性单倍 型参考品种的鉴定实例，结果表明piz
‑
t之#7905ttc为测序错误，应为#7905gtc (图6；图12c)；
[0110]
(5)在该技术体系中，基于piz
‑
t特异性相关snp开发的标记对9个功能性 单倍型参考品种的鉴定实例，结果表明pi50/pigm之#8028ct为测序错误，应为 #8028tg，piz
‑
t与pi50/pigm没有差异，但是与pi2有差异(图6；图12d)；
[0111]
(6)在该技术体系中，基于pi2/pi50/pigm特异性snp开发的标记对9个功 能性单
倍型参考品种的鉴定实例，结果表明在#7902位点，pi2(cag)与piz
‑
t(tgt) 及pi50/pigm(cgt)的snp是真实的，该位点为pi2特异性snp(图5；图12e)；
[0112]
(7)在该技术体系中，基于pi2/piz
‑
t特异性snp开发的标记对9个功能性 单倍型参考品种的鉴定实例，结果表明piz
‑
t之#7992t为测序错误，应为#7992g， pi2与pi50/pigm及piz
‑
t都有差异，该位点实为pi2特异性snp(图5；图12f)；
[0113]
(8)特别地，针对pi2/piz
‑
t特异性indel(7919)开发的标记对5个功能基因 以及3个非功能性基因的鉴定实例，结果表明pi2之indel(7919)为测序错误， 二者相同，都没有缺失，而与其他功能基因及非功能性基因有差异(有缺失；图 12f)；
[0114]
综上所述，该技术体系具有系统而严谨的包容性、可比性以及纠错能力，避 免了因为原始数据或者参考序列错误而作出的误判。具体之，真正能够鉴别 pi2/piz
‑
t的是基于1个正确和2个错误的原始数据或者参考序列snp而开发的 特异性分子标记：pi2
cag7902tgt/cgt
,pi2
t7992g
,pizt/50/gm
tg8028ct
(图12)。
[0115]
本发明提供了利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗 病基因簇功能基因的技术体系从稻种资源中甄别该基因簇存在的“异名同质基 因”(pi50/pigm)的实例(图13)。其中，
[0116]
(1)一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇功能基因 的技术体系，综合结果表明在该技术体系中二者【pi50(ck5)/pigm(ck6)】之间 没有差异，但是二者可以通过其共同的特异性分子标记组合(pi50/gm
a7746g
, pi50/gm
g8626c
)清晰地区别于该基因簇其他的功能基因(图13a～g)；
[0117]
(2)基于pi50/pigm之间唯一特异性序列开发的分子标记 (pi50/pigm
indel(5031)
)对pi2/pi9抗病基因簇之6个已知功能基因进行鉴证，结果表 明该基因簇所有功能基因之间没有差异，该特异性序列是测序错误造成的(图 13h)。
[0118]
综上所述，该技术体系具有系统而严谨的包容性、可比性以及纠错能力。具 体之，一系列特异性分子标记检测的结果表明，二者确实是“异名同质基因”。
[0119]
本发明提供了利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗 病基因簇功能基因的技术体系从稻种资源中甄别该基因簇存在的“同名异质基 因”[piz(fukunishiki)/piz(irblz
‑
fu)]的实例(图14)。其中，
[0120]
(1)如上所述，piz为该基因簇中尚未被分离克隆的功能基因。在18个参考 品种中，ck9(fukunishiki，piz供体品种)与ck10(irblz
‑
fu；由fukunishiki 开发的piz单基因系)具有亲缘谱系关系，都是piz的携带者(tsunematsu et al. 2000,breed sci,50:229
‑
234)。
[0121]
(2)但是，利用2个单倍型特异性标记对18个参考品种进行鉴定，结果表 明，ck9与该基因簇其他功能基因相同，属于功能性单倍型品种；而ck10则与 该基因簇其他功能基因不相同，属于非功能性单倍型品种(图14a)；
[0122]
(3)为了确认上述结果，选择2个单倍型特异性附加标记对18个参考品种 进行鉴定，结果表明二者仍然存在差异，ck9仍然属于功能性单倍型品种，而 后者仍被确认为非功能性单倍型品种(图14b)；
[0123]
(4)为了进一步确认ck9是否为piz的携带者，利用2个piz功能特异性 分子标记对9个功能性单倍型品种进行鉴定，结果表明ck9确实含有该基因簇 的功能基因piz(图9；
14c)。
[0124]
(5)为了进一步确认供试材料是否存在混杂的问题，将ck9与2个不同来源的ck10进行了比较鉴定，结果表明ck9确实与“ck10原种”相同，而与混杂的ck10不同(图14d)。
[0125]
综上所述，该技术体系具有系统而严谨的包容性、可比性以及纠错能力。具体之，一系列特异性分子标记检测的结果表明，ck9及“ck10原种”是piz的携带者，而“ck10混杂者”不是piz的携带者(可能含有其他抗病基因)。总之，二者携带的确实是“同名异质基因”。
[0126]
本发明提供了利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇功能基因的技术体系与其他标记体系鉴别能力比较的实例(图11，15)。其中，
[0127]
(1)如上所述稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇是最重要的广谱持久抗源，科学家针对1～2个，至多4个功能基因开发其特异性标记，以提高其利用效率【pi2(alametal.2015,proceedingsofthenationalacademyofscienceofindia,sectionb,biologicalscience,9:19)；pi9(scheuermannandjia2016,phytopathology,106:871
‑
876；zhouetal.2020,rice,13:80)；pi2,pi9(tianetal.2016,rice,9:19)；pi9,pi2,piz
‑
t,pigm(tianetal.2020,plantdisease,104:1932
‑
1938)】；
[0128]
(2)从上述主要参考文献中，选择最新且最具鉴别能力的他方标记体系(tianetal.2020,plantdisease,104:1932
‑
1938)，以上述60个稻种资源之12个功能性单倍型品种(图11)为模板进行鉴定比较(图15)。结果表明，本发明之技术体系与其他标记体系(包括他方标记体系，下同)相比，具有如下突出而确切的创新性及有益效果：
[0129]
(a)利用一级标记进行功能性/非功能性单倍型分析，为后续功能基因的挖掘及鉴别划出了清晰的功能性单倍型界限。在该实例中，从供试的60个稻种资源中去除了48个非功能性单倍型品种之后，仅对12个功能性单倍型品种进行了后续的检测分析(图11)，由此一方面大大提高了工作的效率(5倍)，另一方面大大减少了因功能性/非功能性单倍型序列激烈分化而产生遗传背景的干扰，使检测效果更清晰。这是任何其他标记检测体系所无法比拟的有益效果之一；
[0130]
(b)利用二级标记进行功能性单倍型品种之亚单倍型分析，进一步为后续各个功能基因的鉴别划出了清晰的亚单倍型界限。在该实例中，12个功能性单倍型品种被进一步划分为4种亚单倍型，其中cv28～30,cv52,cv59被划分为pi2/zt亚单倍型品种；cv60为pi50/gm亚单倍型品种；cv14,18,21,22,27,49为piz亚单倍型品种；没有pi9亚单倍型品种(图15
‑
a1)。这也是任何其他标记检测体系所无法比拟的有益效果之一。
[0131]
(c)利用成对的三级标记进行功能性单倍型品种之亚单倍型之功能基因分析，为各个功能基因的鉴别划出了清晰的功能基因界限。在该实例中，分别为5个功能基因(如上所述pi50＝pigm,合并为1个基因)遴选了一对最优的功能特异性标记组合，彼此相互独立却互为比对而构成一套严谨的鉴别体系。这也是任何其他标记检测体系所无法比拟的有益效果之一。
[0132]
比较实例1(检测体系的类型):如上所述，本发明之技术体系由“单倍型
‑
亚单倍型
‑
功能基因”等三级检测标记组成。由于其契合了目标基因家族的进化轨迹及模式，且开放性地包含了主要功能基因的功能特异性基因组区域及snp，各个标记独立而具有强大的包容性、严谨的逻辑性以及精确的可比性。由此实现了由上述测序错误而产生的真假特异
性基因组区域及snp，以及由于上述标记检测体 系不严谨而产生的“异名同质基因”、“同名异质基因”或者“真假基因”的 甄别。而在其他标记体系中，仅仅针对已知且少数的目标基因进行检测而不具有 包容性、逻辑性及可比性，无以开展目标基因以外的挖掘及鉴别工作。因此，本 发明之技术体系具有系统而严谨的鉴别能力及纠错能力。无疑地，本发明之技术 体系具有更加强大而广泛而精确的检测能力。
[0133]
比较实例2(标记的类型):在本发明之技术体系中，所有标记皆为在各个参考 功能基因的编码区开发的功能特异性分子标记；而在他方标记体系中，只有一个 是同类型的标记，另外2个则是编码区以外开发的分子标记。无疑地，我方的标 记更具功能特异性及准确性。此外，为了提高基因组区域分化严重之目标基因检 测的可靠性，本发明之技术体系构建了多引物pcr检测体系(#7标记；图15
‑
a2)， 以避免像他方标记体系那样，出现个别样本无法检测的情况(图15
‑
b2)。
[0134]
比较实例3(新基因的挖掘):在本发明之技术体系中，上述cv14等6个品 种被划分为piz亚单倍型(图15
‑
b1)；但是，在一系列功能基因分析的综合结果表 明，上述6个品种都不是的piz携带者，而是其等位基因的携带者【piz
‑
mwz (cv14)；piz
‑
tfb(cv18,21,22,27,49)；图15
‑
a2～6】。而在他方标记体系中，由 于该体系不具有包容性及可比性，在原始文献中检测的目标基因并没有包括piz 及pi50，由此，与ck7，ck8基因型相似的上述6个品种都与其既定的4个目 标基因(pigm,pi9,pi2,piz
‑
t)的不同，既不能推断其为功能基因的携带者，更不 能鉴别其为2个piz等位基因的携带者(图15
‑
b1～3)。无疑地，我方检测的结果更 具包容性、可比性及准确性。
[0135]
比较实例4(已知基因的鉴别):在本发明之技术体系中，cv52,59被推断为 pi2/zt亚单倍型之piz
‑
t基因携带者，2个层次检测的结果清晰而一致(图15
‑
a1～6)。 而在他方标记体系中，由于检测标记不具有层次性及逻辑性，cv52被判断为piz
‑
t 携带者，而cv59则被推断为未知基因的携带者(图15
‑
b1～3)。无疑地，我方检 测的结果更具逻辑性及严谨性。
[0136]
结论：本发明之技术体系具有任何其他标记检测体系所无法比拟的上述创新 性及有益效果。
[0137]
本发明提供的“一种具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因 簇功能基因的技术体系”具有重要的应用价值：利用该技术体系可以在没有任何 基因组序列信息，以及在没有接种鉴定信息的条件下，实现对大量的禾本科植物 包括但不限于水稻种质资源及其育种材料进行pi2/pi9抗病基因簇功能基因的精 准鉴别，同时挖掘更具应用价值的新型功能基因。由此对提高植物种质资源利用 的目的性及效率，提高抗病育种工作的目的性及效率，以及提高抗病品种的合理 布局并延长其使用寿命等应用方面起到无可替代的作用。
[0138]
与现有技术相比，本发明具有如下突出的创新性及有益效果：
[0139]
(1)有别于一般的分子标记专利技术，仅仅针对于特定目标基因的检测，本 发明之技术体系由“单倍型
‑
亚单倍型
‑
功能基因”等三级检测标记组成，由此为后 续功能基因的挖掘及鉴别分别划出了清晰的“功能性单倍型界限
‑
亚单倍型界限
‑ꢀ
功能基因界限”，使每一个检测对象都被界定于清晰且具逻辑性的层次及界限中。 由此实现了对检测对象的开放性全覆盖，进而在没有基因组序列信息、没有抗性 鉴定信息以及没有遗传转化的条件下，实现对未知种质资源群体具有包容性的挖 掘、鉴别及利用。在本发明实施例记载的个
案中，仅从60个随机选择的水稻种 质资源中就筛选出12个品种分别含有功能性目标基因，其中6个品种分别含有 2种新类型的piz等位基因(piz
‑
mwz,piz
‑
tfb)。由此说明，本发明之技术体系 具有确切的开放性及包容性。
[0140]
(2)有别于一般的分子标记专利技术，仅仅针对于目标基因特定基因组区域 dna多态性而进行的检测，本发明之技术体系由“单倍型
‑
亚单倍型
‑
功能基因
”ꢀ
等三级检测标记组成。由于其契合了目标基因家族的进化轨迹及模式，且开放性 地包含了主要的功能性特异性基因组区域及snp，各个标记独立而具有严谨的逻 辑性。由此实现了由上述测序错误而产生的真假特异性基因组区域及snp的甄 别。在本发明实施例记载的个案中，大部分的功能特异性标记都是由测序错误的 特异性基因组区域及snp而开发、鉴证的。因此，本发明之技术体系具有系统 而严谨的序列纠错能力。
[0141]
(3)有别于一般的分子标记专利技术，仅仅针对于目标基因特定基因组区域 一个及少数几个snp的检测，本发明之技术体系由“单倍型
‑
亚单倍型
‑
功能基因
”ꢀ
等三级检测标记组成。由于其契合了目标基因家族的进化轨迹及模式，且开放性 地包含了主要的功能特异性基因组区域及snp，各个标记独立而具有严谨的逻辑 性。由此实现了由上述标记检测体系不系统、不严谨而产生的“异名同质基因”、
ꢀ“
同名异质基因”或者“真假基因”的精准甄别。因此，本发明之技术体系具有严谨 而强大的鉴别及纠错能力。
[0142]
(4)由于复杂的抗病簇是在各种植物病害系统中普遍存在的、寄主植物与病 原物长期协同进化的结果，因此，本发明之技术体系由“单倍型
‑
亚单倍型
‑
功能基 因”等三级检测标记组成之思路及技术手段同样适合于其他植物病害系统抗病基 因的挖掘及鉴定，具有显著的开放性及通用性，即使在海量信息的后基因组时代。 换言之，即使拥有海量的基因组信息，如果没有本发明技术体系之思路及技术手 段，任何普通的分子标记专利技术都不具有包容性且精准鉴别并挖掘复杂的抗病 簇功能基因的能力。
附图说明
[0143]
图1.一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇功能基 因之技术体系的开发及应用的路线图。
[0144]
图2.pi2/pi9抗病基因簇的序列比较及其特异性序列的鉴定。其中，
[0145]
2a.已克隆的pi2,piz
‑
t,pi50,pigm,pi9等5个功能基因在ncbi的基因登录 号分别为：dq352453.1,dq352040.1,kp985761.1,ku904633.2,dq285630.1；为 了便于序列比对分析，加入了4个测序参考感病品种日本晴(nipponbare,npb), 一见钟情(hitomebore,htm),沈农265(shennong 265,sn265),绥粳18(suijing 18,sj18)相应的基因组序列；
[0146]
2b.所有已经验证的单倍型，亚单倍型及功能基因的特异性基因组区域或 snp都已经编号(按标记使用顺序)并绿色标注(详见图2～10)。
[0147]
特别地，由于上述9条参考序列已经公开，因此该图在下述“说明书附图
”ꢀ
中仅仅显示其第一张，以便结合图3～10全面地了解pi2/pi9抗病基因簇的特异性 序列及其标记信息。
[0148]
图3.pi2/pi9抗病基因簇家族之功能性/非功能性单倍型特异性分子标记的开 发及应用
[0149]
3a
‑
b:2个单倍型特异性的最优基因组区域；
(pi50)；ck6,gumeizao 4(pigm)；ck7,75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)；ck9, fukunishiki(piz)。
[0170]
特别地，piz
‑
t之#7992t为测序错误，应为#7992g。
[0171]
图6.pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型之pi2/zt亚单倍型之广谱持久抗性 基因piz
‑
t特异性分子标记的开发及应用
[0172]
6a:1个pi2/zt功能特异性的最优snp；
[0173]
6b:1个pizt/pi50/gm功能特异性的最优snp；
[0174]
6c:2个piz
‑
t功能特异性标记组合【#8,pi2/zt
gac7905ttc/tta
(上带，非目标基 因；下带，目标基因)及#9,pizt/50/gm
tg8028ct
(上带，非目标基因；下带，目标基 因)】对9个功能性参考品种的鉴定实例，其中，
[0175]
目标基因品种：ck3,toride 1(piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；
[0176]
非目标基因品种：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；ck5,nib
‑
e1 (pi50)；ck6,gumeizao 4(pigm)；ck7,75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)；ck9, fukunishiki(piz)。
[0177]
特别地，piz
‑
t之#7905ttc为测序错误，应为#7905gtc；pi50/pigm之 #8028ct为测序错误，应为#8028tg。
[0178]
图7.pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型之pi50/gm亚单倍型之抗病基因 pi50/pigm特异性分子标记的开发及应用
[0179]
7a:2个pi50/pigm功能特异性的最优snp；
[0180]
7b:2个pi50/pigm功能特异性标记【#10,pi50/gm
a7746g
(上带，目标基因； 下带，非目标基因)及#11,pi50/gm
g8626c
(上带，目标基因；下带，非目标基因)】 对9个功能性参考品种的鉴定实例，其中，
[0181]
目标基因品种：ck5,nib
‑
e1(pi50)；ck6,gumeizao 4(pigm)；
[0182]
非目标基因品种：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；ck3,toride 1 (piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；ck7,75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)；ck9, fukunishiki(piz)。
[0183]
特别地，二者为“异名同质基因”(详见下述实施例12)。
[0184]
图8.pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型之pi9亚单倍型之广谱持久抗性基 因pi9特异性分子标记的开发及应用
[0185]
8a:1个pi9功能特异性的最优snp；
[0186]
8b:1个pi9/piz功能特异性的最优snp；
[0187]
8c:2个pi9功能特异性标记【#12,pi9
t7257c
(上带，非目标基因；下带，目 标基因)及#13,pi9/z
t6709g
(上带，非目标基因；下带，目标基因)】对9个功能性 参考品种的鉴定实例，其中，
[0188]
目标基因品种：ck7,75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)；
[0189]
非目标基因品种：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；ck3,toride 1 (piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；ck5,nib
‑
e1(pi50)；ck6,gumeizao 4(pigm)；ck9, fukunishiki(piz)。
[0190]
图9.利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因 簇功
能基因的技术体系从该基因簇中鉴别未克隆的广谱持久抗性基因piz的特 异性分子标记的开发及其应用
[0191]
9a:1个pi9/piz功能特异性的最优snp；
[0192]
9b:1个piz功能特异性的最优snp；
[0193]
9c:2个piz功能特异性标记【#13,pi9/z
t6709g
(上带，非目标基因；下带，目 标基因)及#14,piz
a7099g
(上带，目标基因；下带，非目标基因)】对9个功能性参 考品种的鉴定实例，其中，
[0194]
目标基因：ck9,fukunishiki(piz)；
[0195]
非目标基因：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；ck3,toride 1 (piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；ck5,nib
‑
e1(pi50)；ck6,gumeizao 4(pigm)；ck7, 75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)。
[0196]
特别地，piz为未克隆基因，与pi9具有相同的snp#6709t；piz
a7099g
为其 特异性分子标记。
[0197]
图10.利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因 簇功能基因的技术体系从该基因簇中甄别真假特异性基因组区域及snp的实例
[0198]
10a:1个pi2/pi9抗病基因簇单倍型特异性的最优基因组区域；
[0199]
10b:基于上述最优基因组区域开发的单倍型特异性标记【#1, pi2/9
‑
f/n
p/a(933～1239)
；有带，目标基因型；无带，非目标基因型】对18个参考品 种进行鉴定，结果表明，含有pi9的ck7及ck8之序列严重错误，应该是与 nipponbare等非功能性单倍型序列完全不同的功能性单倍型序列；
[0200]
10c:1个pi2/pizt功能特异性的最优snp；
[0201]
10d:1个pizt/pi50/pigm功能特异性的最优snp；
[0202]
10e:基于上述2个snp开发的功能特异性标记【#8,pi2/zt
gac7905ttc/tta
(上 带，非目标基因；下带，目标基因)及#9,pizt/50/gm
tg8028ct
(上带，非目标基因； 下带，目标基因)】对9个功能性单倍型之参考品种的鉴定实例，结果表明，piz
‑
t 之#7905ttc为测序错误，应为#7905gtc；pi50/pigm之#8028ct亦为测序错误， 应为#8028tg。
[0203]
图11.利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因 簇功能基因的技术体系从未知的稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧功能基因的 实例
[0204]
11a:pi2/pi9抗病基因簇之功能性/非功能性单倍型的鉴定，其中，
[0205]
ck1,c101a51(pi2)；ck2,toride 1(piz
‑
t)；ck3,nib
‑
e1(pi50)；ck4, gumeizao 4(pigm＝pi50)；ck5,75
‑1‑
127(pi9)；ck6,irbl9
‑
m(pi9)；ck7, fukunishiki(piz)；ck8,2561(piz)；
[0206]
cv1～60为常规水稻种质资源(zhai et al.2011,new phytologist,189:321
‑
334； hua et al.2012,theor appl genet 125:1047
‑
1055；chai et al.2012,rice,in press)。 其中，12个功能性单倍型品种为：cv14,maweizhan(mwz)；cv18,shufeng 101； cv21,xianhui 297；cv22,lu28s；cv27,tianfeng b(tfb)；cv28,r217；cv29, gui r215；cv30,gui r231；cv49,jinghu b；cv52,pino.4；cv59,npb
‑
pizt； cv60,npb
‑
pita2；
[0207]
11b:pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型之亚单倍型的鉴定，其中，
[0208]
pi2/zt亚单倍型：cv28～30,cv52,59；
[0209]
pi50/gm亚单倍型：cv60；
[0210]
pi9亚单倍型：无；
[0211]
piz亚单倍型：cv14,18,21,22,27,49；
[0212]
11c
‑
g:pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型之3个亚单倍型之3个已知抗病 基因以及2个新型抗病基因的鉴定，其中，
[0213]
pi2携带品种：cv28～30；
[0214]
piz
‑
t携带品种：cv52,59；
[0215]
pi50/pigm携带品种：cv60；
[0216]
新型piz
‑
mwz携带品种：cv14；
[0217]
新型piz
‑
tfb携带品种：cv18,21,22,27,49；
[0218]
特别地，在piz未分离克隆的条件下，通过单倍型及亚单倍型分析，挖掘了 6个piz亚单倍型品种；然而通过比较该体系中一系列的已知功能基因特异性标 记的基因型，鉴证了6个piz亚单倍型品种都不含有已知的功能基因piz，而是 属于piz亚单倍型之2种类型的新基因piz
‑
mwz及piz
‑
tfb。
[0219]
图12.利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因 簇功能基因的技术体系从稻种资源中鉴别该基因簇存在的等位基因(pi2/piz
‑
t) 的实例。其中，
[0220]
12a:2个单元型特异性标记对18个参考品种的鉴定实例，结果表明二者【pi2 (ck1,2)；piz
‑
t(ck3,4)】没有差异；
[0221]
12b:3个亚单元型特异性标记对9个功能性单元型参考品种的鉴定实例，结 果表明二者仍然没有差异；
[0222]
12c:基于pi2特异性snp开发的标记对9个功能性单元型参考品种的鉴定 实例，结果表明piz
‑
t之#7905ttc为测序错误，应为#7905gtc；
[0223]
12d:基于piz
‑
t特异性snp开发的标记对9个功能性单元型参考品种的鉴定 实例，结果表明pi50/pigm之#8028ct为测序错误，应为#8028tg，piz
‑
t与 pi50/pigm没有差异，但是与pi2有差异；
[0224]
12e:基于pi2/pi50/pigm特异性snp开发的标记对9个功能性单元型参考 品种的鉴定实例，结果表明在#7902位点，pi2(cag)与piz
‑
t(tgt)及pi50/pigm (cgt)皆有差异，该位点为pi2特异性snp；
[0225]
12f:基于pi2/piz
‑
t特异性snp开发的标记对9个功能性单元型参考品种的 鉴定实例，结果表明piz
‑
t之#7992t为测序错误，应为#7992g，pi2与pi50/pigm 及piz
‑
t都有差异，该位点实为pi2特异性snp；
[0226]
12g:特别地，针对pi2/piz
‑
t特异性indel(7919)开发的标记对5个功能基因 以及3个非功能性基因的鉴定实例，结果表明pi2之indel(7919)为测序错误， 二者相同，都没有缺失，而与其他功能基因及非功能性基因有差异。结论：
[0227]
(a)在复杂的基因簇或者基因家族中，不能仅仅依靠1个或几个特异性标记 来作判断，特别是在测序质量不高的状况下；
[0228]
(b)通过一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇功能 基因的技术体系即可根据综合结果作出准确的判断。
[0229]
图13.利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因 簇功能基因的技术体系从稻种资源中甄别该基因簇存在的“异名同质基因
”ꢀ
(pi50/pigm)的实例。其中，
[0230]
13a～g:一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇的技 术体系，结果表明在该技术体系中二者【pi50(ck5)/pigm(ck6)】没有差异；
[0231]
13h:基于pi2/pigm之间唯一特异性序列开发的分子标记对pi2/pi9抗病基因 簇之6个已知功能基因的鉴证，结果表明该特异性序列是测序错误，亦即该基因 簇所有功能基因之间没有差异。
[0232]
结论：二者确实是“异名同质基因”(pi50＝pigm)。
[0233]
图14.利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因 簇功能基因的技术体系从稻种资源中甄别该基因簇存在的“同名异质基因”[piz (fukunishiki)/piz(irblz
‑
fu)]的实例。其中，
[0234]
14a:2个单元型特异性标记对18个参考品种的鉴定实例，结果表明二者 (ck9/ck10)存在差异，前者为功能性单倍型品种，后者为非功能性单倍型品种；
[0235]
14b:2个单元型特异性附加标记对18个参考品种的鉴定实例，结果表明二 者仍然存在差异，前者为功能性单倍型品种，后者为非功能性单倍型品种。亦即 后者不含有pi2/pi9抗病基因簇之功能基因；
[0236]
14c:2个piz功能特异性分子标记对pi2/pi9抗病基因簇之6个已知功能基 因的鉴证，结果表明ck9确实含有该基因簇的功能基因piz。
[0237]
14d:为了进一步确认供试材料是否存在混杂的问题，将ck9与2个不同来 源的ck10进行了比较鉴定，结果表明ck9确实与“ck10原种”相同，而与“ck10 混杂者”不同(图14d)。
[0238]
综上所述，该技术体系具有系统而严谨的包容性、可比性以及纠错能力。具 体之，一系列特异性分子标记检测的结果表明，ck9及“ck10原种”是piz的 携带者，而“ck10混杂者”不是piz的携带者(可能含有其他抗病基因)。总之， 供试的ck9与“ck10混杂者”携带的确实是“同名异质基因”。
[0239]
图15.利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因 簇功能基因的技术体系与其他标记体系鉴别能力比较的实例。其中，
[0240]
15a1～6:本发明之技术体系对60个稻种资源之12个功能性单倍型品种(如图4 所述)的亚单倍型，以及6个功能基因的鉴定；
[0241]
15b1～3:他方标记体系(tian et al.2020,plant disease,104:1932
‑
1938)对60个稻 种资源之12个功能性单倍型品种(cv14,18,21,22,27～30,49,52,59,60)的鉴 定；新型抗病基因,紫色标示。
[0242]
特别地，他方标记体系在原始文献中检测的目标基因并没有包括piz及pi50， 由此，与ck7，ck8基因型相似的上述6个品种都与其既定的4个目标基因 (pigm,pi9,pi2,piz
‑
t)的不同，因此，既不能推断其为功能基因的携带者，更不 能鉴别其为2个piz功能基因的携带者(删除线标示)。
[0243]
品种信息如上图11所述。
具体实施方式
[0244]
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步的阐述，所述实施例 只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方 法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，皆为 可从商业途径得到的试剂和材料。
[0245]
在实施例中所用的所有水稻品种：ck1～18(如上所述)；以及cv1
‑
60皆为申 请人实验室收集、保存，并在本研究领域中常用且已在包括但不限于上述文献中 公开【zhai et al.2011,new phytologist 189:321
‑
334, https://nph.onlinelibrary.wiley.com；hua et al.2012,theor appl genet 125: 1047
‑
1055,https://www.springer.com/journal/122；chai et al.2021,rice, https://thericejournal.springeropen.com(发表中)；附件图表可在各自杂志网站获 得】。
[0246]
本专利开发及应用的技术路线图如图1所示。
[0247]
实施例1:稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇的序列比较及其特异性序列的鉴定(图 2～10)
[0248]
一、实验方法
[0249]
从上述美国国家生物技术信息中心等公共数据库中检索并下载5个已经克 隆的稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇之功能基因的基因组序列，
[0250]
pi2的ncbi登录号为：dq352453.1；
[0251]
piz
‑
t的ncbi登录号为：dq352040.1；
[0252]
pi50的ncbi登录号为：kp985761.1；
[0253]
pigm的ncbi登录号为：ku904633.2；
[0254]
pi9的ncbi登录号为：dq285630.1。
[0255]
为了便于序列比对分析，加入了4个测序参考感病品种日本晴(nipponbare, npb),一见钟情(hitomebore,htm),沈农265(shennong 265,sn265),绥粳18 (suijing 18,sj18)相应的基因组序列。
[0256]
各个基因atg～tag的范围参考ncbi注释。
[0257]
通过常规的生物信息学方法进行序列比较分析。
[0258]
二、实验结果
[0259]
序列比较结果如图2～10所示，结果表明：
[0260]
(1)pi2/pi9抗病基因簇的序列存在明显的功能性单倍型(pi2,piz
‑
t,pi50, pigm,pi9)与非功能性单倍型(npb,htm,sn265,sj18)的基因组分化(典型位 置如图3之标记#1及#2，以及附加标记#17及#18所示)；
[0261]
(2)pi2/pi9抗病基因簇的序列在功能性单倍型中，进一步存在明显的亚单倍 型(pi2/zt,pi50/gm,pi9,piz)的分化(典型位置如图4之标记#3～5所示)；
[0262]
(3)上述pi2/pi9抗病基因簇之功能基因(含尚未克隆的piz)都存在功能特 异性snp及其组合(典型位置如标记图5～9之标记#6～#14所示)。
[0263]
特别地，pi2/pi9抗病基因簇的序列存在严重的基因组特异性区域及snp的 错误(下述)。
[0264]
此外，由于上述9条参考序列已经公开，因此图2仅在“说明书附图”中显 示其第一
张，以便结合图3～10全面地了解pi2/pi9抗病基因簇的特异性序列及其 标记信息。
[0265]
实施例2：pi2/pi9抗病基因簇之功能性/非功能性单倍型特异性分子标记的开发 及应用(图3)
[0266]
一、实验方法
[0267]
此实施例的实验方法主要参考申请人已发表的论文(yuan et al.2011,theorappl genet 122:1017
‑
1028；zhai et al.2011,new phytologist 189:321
‑
334；hua etal.2012,theor appl genet,125:1047
‑
1055；chai et al.2021,rice,in press)。
[0268]
【以下参考文献与上述的相同，恕不赘述】。
[0269]
简述之：
[0270]
(1)单倍型特异性分子标记的设计：根据上述pi2/pi9抗病基因簇序列的比 对结果，针对功能性/非功能性单倍型分化清晰的基因组区域，利用引物设计软 件primer primer 5.0设计p/a(presence/absence；存在/缺失)标记。引物序列如下：
[0271]
对于#1标记(有带，含功能基因；无带，不含功能基因)：
[0272]
seq id no.1(pi2/9
‑
f/n
p/a(933～1239)
‑
f；5
’‑3’
)：
[0273]
gctgctgccgacgagaccag；
[0274]
seq id no.2(pi2/9
‑
f/n
p/a(933～1239)
‑
r；5
’‑3’
)：
[0275]
aggggctttgttgcttaacatat。
[0276]
对于#2标记(有带，含功能基因；无带，不含功能基因)：
[0277]
seq id no.3(pi2/9
‑
f/n
p/a(3808～4033)
‑
f；5
’‑3’
)：
[0278]
ggtcaaaattaacatcaaactggg；
[0279]
seq id no.4(pi2/9
‑
f/n
p/a(3808～4033)
‑
r；5
’‑3’
)：
[0280]
gatagtgtttattttacgtctgttt。
[0281]
标记说明如上所述。
[0282]
(2)单倍型特异性分子标记的检测：利用上述一组引物对上述18个水稻参 考品种进行pcr扩增。pcr扩增体系(20.0μl)如下：
[0283][0284]
【以下pcr扩增体系与上述的相同，恕不赘述】
[0285]
pcr扩增条件为：94℃预变性3min，随后进行30～40个循环(一般为35循 环，视检测对象可适当调整)的pcr扩增[94℃变性30sec，退火30sec(#1/62℃， #2/55℃)，72℃延伸30sec)]，最后72℃延伸5min，pcr产物置于4℃冰箱保存 备用。
[0286]
【除了退火温度之外，以下pcr扩增条件与上述的相同，恕不赘述】
[0287]
取0.25μlpcr产物，加入0.25μlddh2o和5μl10xloading并混匀，用微量进样器取1.5～2μl产物在8％～12％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳(250v,20～120min)，之后，按照常规的检测方法进行分子标记的拍照、记录。
[0288]
【以下分子标记检测程序与上述的相同，恕不赘述】
[0289]
二、实验结果
[0290]
各个分子标记的大小如图3所示，结果表明，18个供试品种呈现清晰的基因型(单倍型)：
[0291]
功能性单倍型品种：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；ck3,toride1(piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；ck5,nib
‑
e1(pi50)；ck6,gumeizao4(pigm)；ck7,75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)；ck9,fukunishiki(piz)；
[0292]
非功能性单倍型品种：ck10,irblz
‑
fu(pi2/9null)；ck11,nipponbare(pi2/9null)；ck12,shennong265(pi2/9null)；ck13,suijing18(pi2/9null)；ck14,sasanishiki(pi2/9null)；ck15,koshihikari(pi2/9null)；ck16,shin2(pi2/9null)；ck17,aichiasahi(pi2/9null)；ck18,fujisaka5(pi2/9null)；m,dl
‑
500。
[0293]
特别地，含有pi9的ck7，ck8之序列严重错误，应该是与nipponbare等非功能性单元型品种完全不同的功能性单元型品种(详见下述实施例10)。而含有piz的ck10原本应该与其供体品种ck9(fukunishiki)一样，属于功能性单元型品种，检测结果却是非功能性单元型品种，如此“同名异质”之错误可能是种子混杂造成的(详见下述实施例13)。
[0294]
在后续的检测、鉴定中，将去除非功能性单倍型的供试品种ck10～18。
[0295]
实施例3:pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型之亚单倍型特异性分子标记的开发及应用(图4)
[0296]
一、实验方法
[0297]
(1)亚单倍型特异性分子标记的设计：根据上述pi2/pi9抗病基因簇序列的比对结果，针对功能性单倍型之亚单倍型清晰的snp，根据caps及dcaps(derivedcleavedamplifiedpolymorphicsequences；neffetal.2002,trendsingenetics18:613
‑
615)标记的设计原理，先利用在线软件dcapsfinder2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)进行caps及dcaps标记的引物设计；然后利用引物设计软件primerprimer5.0进行标记设计的确认。
[0298]
【以下分子标记及引物设计程序与上述的相同，恕不赘述】。
[0299]
引物序列如下：
[0300]
对于#3标记(上带,pi50/gm/9；下带,pi2/zt/z)：
[0301]
seqidno.5(pi2/zt/z
‑
subh
a2726g/t
‑
f；5
’‑3’
)：
[0302]
cagaatatgccatcgaatacgcgctgcttt；
[0303]
seqidno.6(pi2/zt/z
‑
subh
a2726g/t
‑
r；5
’‑3’
)：
[0304]
cggacggatgacgacggcacgactga。
[0305]
对于#4标记(上带,pi9；双带,pi2/zt/50/gm/z)：
[0306]
seqidno.7(pi2/zt/50/gm
‑
subh
c6739a
‑
f；5
’‑3’
)：
[0307]
tgtcagaatgggagaaattctatgtgca；
[0308]
seqidno.8(pi2/zt/50/gm
‑
subh
c6739a
‑
r；5
’‑3’
)：
[0309]
tacctactagacgattccttttgatttcaa。
[0310]
对于#5标记(上带,pi9/z；双带,pi2/zt/50/gm)：
[0311]
seq id no.9(pi9/z
‑
subh
c7793t
‑
f；5
’‑3’
)：
[0312]
gcaatcaaagagctggggcagttaagcatg；
[0313]
seq id no.10(pi9/z
‑
subh
c7793t
‑
r；5
’‑3’
)：
[0314]
gagggaagagagcttctcaatggctgcat。
[0315]
(2)亚单倍型特异性分子标记的检测：利用上述3组引物，按照上述pcr扩 增体系(退火温度：#3/64℃，#4/56℃，#5/60℃)，对9个功能性单倍型的水稻供 试品种进行pcr扩增并将其产物置于4℃冰箱保存备用。
[0316]
取出上述pcr产物，分别利用限制性内切酶nla iii(#3),apa li(#4),sph i (#5)进行酶切，反应体系(10.0μl)如下：
[0317][0318]
在37℃条件下酶切5小时后，向上述每管酶切产物中加入10μl 10x loading 并混匀，按照上述实验程序对酶切样品进行基于聚丙烯酰胺凝胶的电泳检测、拍 照、记录。
[0319]
【以下pcr扩增产物酶切体系(除了taq i之酶切温度为65℃外，其余皆为 37℃)与上述的相同，恕不赘述】
[0320]
二、实验结果
[0321]
各个分子标记的大小如图4所示，结果表明，9供试品种呈现4种清晰的基 因型(亚单倍型)：
[0322]
pi2/zt亚单倍型品种：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；ck3, toride 1(piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；
[0323]
pi50/gm亚单倍型品种：ck5,nib
‑
e1(pi50)；ck6,gumeizao 4(pigm)；
[0324]
pi9亚单倍型品种：ck7,75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)；
[0325]
piz亚单倍型品种：ck9,fukunishiki(piz)。
[0326]
标记说明如上所述；
[0327]
特别地，piz为未克隆基因，与pi2/piz
‑
t具有相同的snp#2726a；pi50/pigm 之#6739a为测序错误，应为#6739c；pi50/pigm之#7793t为测序错误，应为 #7793c。
[0328]
实施例4：pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型之pi2/zt亚单倍型之广谱持久抗性 基因pi2特异性分子标记的开发及应用(图5)
[0329]
一、实验方法
[0330]
(1)pi2特异性分子标记的设计：根据上述pi2/pi9抗病基因簇序列的比对结 果，选择其中最优的2个snp(cag7902tgt/cgt,t7992g)设计为pi2功能特 异性分子标记pi2
cag7902tgt/cgt
及pi2
t7992g
，引物序列如下：
[0331]
对于#6标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：
[0332]
seq id no.11(pi2
cag7902tgt/cgt
‑
f；5
’‑3’
)：
[0333]
tcgacaaaggaaaaatgtaagatactt；
[0334]
seq id no.12(pi2
cag7902tgt/cgt
‑
r；5
’‑3’
)：
[0335]
agtaggggaggaggagatgaa。
[0336]
对于#7标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：
[0337]
seq id no.13(pi2
t7992g
‑
f1；5
’‑3’
)：
[0338]
tctccatgtggatgctgcaga；
[0339]
seq id no.14(pi2
t7992g
‑
f2；5
’‑3’
)：
[0340]
tctccatgtggatgctgtgga；
[0341]
seq id no.15(pi2
t7992g
‑
f3；5
’‑3’
)：
[0342]
tctctatgtgaatgctgcgga；
[0343]
seq id no.16(pi2
t7992g
‑
r；5
’‑3’
)：
[0344]
gttttgaatactagcttctccccaag。
[0345]
特别地，由于#7标记位于基因组序列严重分化之区域，为了确保检测结果 的稳定性及可靠性，该标记由3条正向引物与1条反向引物搭配进行pcr检测。
[0346]
(2)pi2特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述pcr扩增体 系及扩增条件(退火温度：#6/62℃，#7/50℃)，对9个功能性单倍型的水稻供试 品种进行pcr扩增并将其产物置于4℃冰箱保存备用。
[0347]
取出上述pcr产物，按照上述酶切体系，分别利用限制性内切酶psti(#6)以 及eco ri(#7)进行酶切；并按照上述实验程序对酶切样品进行基于聚丙烯酰胺 凝胶的电泳检测、拍照及记录。
[0348]
二、实验结果
[0349]
各个分子标记的大小如图5所示，结果表明，2个pi2特异性分子标记皆可 将目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因：
[0350]
目标基因品种：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；
[0351]
非目标基因品种：ck3,toride 1(piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；ck5,nib
‑
e1 (pi50)；ck6,gumeizao 4(pigm)；ck7,75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)；ck9, fukunishiki(piz)。
[0352]
特别地，piz
‑
t之#7992t为测序错误，应为#7992g。
[0353]
实施例5：pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型之pi2/zt亚单倍型之广谱持久抗性 基因piz
‑
t特异性分子标记的开发及应用(图6)
[0354]
一、实验方法
[0355]
(1)piz
‑
t特异性分子标记的设计：根据上述pi2/pi9抗病基因簇家族序列的比 对结果，并未发现目标基因特异性的snp，但是遴选了2个最优的snp组合 (gac7905ttc/tta,tg8028ct)，按照上述程序设计为piz
‑
t特异性分子标记 pi2/zt
gac7905ttc/tta
及pizt/50/gm
tg8028ct
。引物序列如下：
[0356]
对于#8标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：
[0357]
seq id no.17(pi2/zt
gac7905ttc/tta
‑
f；5
’‑3’
)：
[0358]
gatactttatgcagccattgag；
[0359]
seq id no.18(pi2/zt
gac7905ttc/tta
‑
r；5
’‑3’
)：
[0360]
tagaatctaggcactcaagtgt。
[0361]
对于#9标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：
[0362]
seq id no.19(pizt/50/gm
tg8028ct
‑
f；5
’‑3’
)：
[0363]
atgcctaactggattgagcagctcg；
[0364]
seq id no.20(pizt/50/gm
tg8028ct
‑
r；5
’‑3’
)：
[0365]
agatgaaggaccatgaggttgggcagt。
[0366]
(2)piz
‑
t特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述pcr扩增体 系及扩增条件(退火温度：#8/56℃，#9/62℃)，对9个功能性单倍型的水稻供试 品种进行pcr扩增并将其产物置于4℃冰箱保存备用。
[0367]
取出上述pcr产物，按照上述酶切体系，分别利用限制性内切酶hinfi(#8) 以及apa li(#9)进行酶切；并按照上述实验程序对酶切样品进行基于聚丙烯酰 胺凝胶的电泳检测、拍照及记录。
[0368]
二、实验结果
[0369]
各个分子标记的大小如图6所示，结果表明，该特异性分子标记组合可将目 标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因：
[0370]
目标基因品种：ck3,toride 1(piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；
[0371]
非目标基因品种：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；ck5,nib
‑
e1 (pi50)；ck6,gumeizao 4(pigm)；ck7,75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)；ck9, fukunishiki(piz)。
[0372]
特别地，piz
‑
t之#7905ttc为测序错误，应为#7905gtc；pi50/pigm之 #8028ct为测序错误，应为#8028tg。
[0373]
实施例6：pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型之pi50/gm亚单倍型之抗性基因 pi50/pigm特异性分子标记的开发及应用(图7)
[0374]
一、实验方法
[0375]
(1)pi50/pigm特异性分子标记的设计：根据上述pi2/pi9抗病基因簇序列的 比对结果，选择其中最优的2个snp(a7746g,g8626c)设计为pi50/pigm特异 性分子标记pi50/gm
a7746g
及pi50/gm
g8626c
。引物序列如下：
[0376]
对于#10标记(上带，目标基因；下带，非目标基因)：
[0377]
seq id no.21(pi50/gm
a7746g
‑
f；5
’‑3’
)：
[0378]
tgcaggttctagagtatgtagatatcc；
[0379]
seq id no.22(pi50/gm
a7746g
‑
r；5
’‑3’
)：
[0380]
gaagagagcttctcaatggctg。
[0381]
对于#11标记(上带，目标基因；下带，非目标基因)：
[0382]
seq id no.23(pi50/gm
g8626c
‑
f；5
’‑3’
)：
[0383]
cgaatgataggtcagtcactctcta；
[0384]
seq id no.24(pi50/gm
g8626c
‑
r；5
’‑3’
)：
[0385]
agcttgagctgtgcctatctctt。
[0386]
(2)pi50/pigm特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述pcr 扩增体系及扩增条件(退火温度：#10/52℃，#11/58℃)，对9个功能性单倍型的 水稻供试品种进行
pcr扩增并将其产物置于4℃冰箱保存备用。
[0387]
取出上述pcr产物，按照上述酶切体系，分别利用限制性内切酶hpa ii(#10) 以及nla iii(#11)进行酶切，并按照上述实验程序对酶切样品进行基于聚丙烯酰 胺凝胶的电泳检测、拍照及记录
[0388]
二、实验结果
[0389]
各个分子标记的大小如图7所示，结果表明，该特异性分子标记组合可将目 标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因：
[0390]
目标基因品种：ck5,nib
‑
e1(pi50)；ck6,gumeizao 4(pigm)；
[0391]
非目标基因品种：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；ck3,toride 1 (piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；ck7,75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)；ck9, fukunishiki(piz)。
[0392]
特别地，pi50/pigm为“异名同质基因”(详见下述实施例13)。
[0393]
实施例7：pi2/pi9抗病基因簇之功能性单倍型之pi9亚单倍型之广谱持久抗性基 因pi9特异性分子标记的开发及应用(图8)
[0394]
一、实验方法
[0395]
(1)pi9特异性分子标记的设计：根据上述pi2/pi9抗病基因簇序列的比对结 果，选择最优的2个snp(t7257c,t6709g)设计为pi9特异性分子标记组合： pi9
t7257c
及pi9/z
t6709g
；引物序列如下：
[0396]
对于#12标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：
[0397]
seq id no.25(pi9
t7257c
‑
f；5
’‑3’
)：
[0398]
atgggagatggctctgatttagtt；
[0399]
seq id no.26(pi9
t7257c
‑
r；5
’‑3’
)：
[0400]
gcacaacaatgcaatacggtcg。
[0401]
对于#13标记(上带，非目标基因；下带，目标基因)：
[0402]
seq id no.27(pi9/z
t6709g
‑
f；5
’‑3’
)：
[0403]
atgtggtcgtctaccattagcaa；
[0404]
seq id no.28(pi9/z
t6709g
‑
r；5
’‑3’
)：
[0405]
tccaggcttgggtttatttctagt。
[0406]
(2)pi9特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述pcr扩增体 系及扩增条件(退火温度：#12/62℃，#13/60℃)，对9个功能性单倍型的水稻供 试品种进行pcr扩增并将其产物置于4℃冰箱保存备用。
[0407]
取出上述pcr产物，按照上述酶切体系，分别利用限制性内切酶xbai(#12) 以及nla iii(#13)进行酶切，并按照上述实验程序对酶切样品进行基于聚丙烯酰 胺凝胶的电泳检测、拍照及记录。
[0408]
二、实验结果
[0409]
各个分子标记的大小如图8所示，结果表明，上述特异性分子标记组合可将 目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因：
[0410]
目标基因品种：ck7,75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)；
[0411]
非目标基因品种：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；ck3,toride 1 (piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；ck5,nib
‑
e1(pi50)；ck6,gumeizao 4(pigm)；ck9, fukunishiki(piz)。
[0412]
特别地，piz为未克隆的功能基因，却与pi9基因具有相同的snp(#6709t)。
[0413]
实施例8：利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因 簇功能基因的技术体系从该基因簇中鉴别未克隆的广谱持久抗性基因piz的特 异性分子标记的开发及其应用(图9)
[0414]
一、实验方法
[0415]
(1)piz特异性分子标记的设计：piz是pi2/pi9抗病基因簇中尚未分离克隆的、 序列未知的功能基因。但是，在本发明之技术体系中仍然发现了2个目标基因piz特异性相关的snp组合(t6709g,a7099g)；按照上述程序将其设计为piz 特异性分子标记pi9/z
t6709g
及piz
a7099g
。引物序列如下：
[0416]
对于#13标记(如上所述)：
[0417]
对于#14标记(上带，目标基因；下带，非目标基因)：
[0418]
seq id no.29(piz
a7099g
‑
f；5
’‑3’
)：
[0419]
atcaaccgaagtatgattcaacga；
[0420]
seq id no.30(piz
a7099g
‑
r；5
’‑3’
)：
[0421]
tcagagccatctcccattggtac。
[0422]
(2)piz特异性分子标记的检测：利用上述2组引物，按照上述pcr扩增体 系及扩增条件(退火温度：#13/60℃，#14/57℃)，对9个功能性单倍型的水稻供 试品种进行pcr扩增并将其产物置于4℃冰箱保存备用。
[0423]
取出上述pcr产物，按照上述酶切体系，分别利用限制性内切酶nla iii(#13) 以及kpni(#14)进行酶切，并按照上述实验程序对酶切样品进行基于聚丙烯酰 胺凝胶的电泳检测、拍照及记录。
[0424]
二、实验结果
[0425]
各个分子标记的大小如图9所示，结果表明，上述piz特异性分子标记组合 可将目标基因区分于该基因家族所有已知的功能基因：
[0426]
目标基因：ck9,fukunishiki(piz)；
[0427]
非目标基因：ck1,c101a51(pi2)；ck2,irblz5
‑
ca(pi2)；ck3,toride 1 (piz
‑
t)；ck4,irblzt
‑
t(piz
‑
t)；ck5,nib
‑
e1(pi50)；ck6,gumeizao 4(pigm)；ck7, 75
‑1‑
127(pi9)；ck8,irbl9
‑
m(pi9)。
[0428]
特别地，piz为未克隆基因，与pi9具有相同的snp#6709t；piz
a7099g
为其 特异性分子标记。
[0429]
实施例9：利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因 簇功能基因的技术体系从该基因簇中甄别真假特异性基因组区域及snp的实例 (图3～10)
[0430]
由于pi2/pi9抗病基因簇是位于水稻第6染色体之近着丝粒区域，整体测序 质量不高，造成整个基因簇存在大量的测序错误
[0431]
一、实验方法
[0432]
本发明之技术体系由14个基本的特异性标记组成，其开发及检测如上所述 (图3～9；实施例2～8)。
[0433]
二、实验结果
[0434]
各个分子标记甄别出来的特异性基因组区域及真假snp如上所述，典型的 个案如图10所示。结果表明，含有pi9的ck7及ck8之特异性基因组区域严 重错误，应该是与nipponbare等非功能性单元型序列完全不同的功能性单元型 序列(图10a～b)；而piz
‑
t之#7905ttc为snp错误，应为#7905gtc；pi50/pigm 之#8028ct亦为snp错误，应为#8028tg(图10c～e)。
[0435]
结论：本发明之技术体系由“单倍型
‑
亚单倍型
‑
功能基因”等三级检测标记组 成。由于其契合了目标基因家族的进化轨迹及模式，且开放性地包含了主要的功 能性特异性基因组区域及snp，各个标记独立而具有严谨的逻辑性。因此，本发 明之技术体系具有系统而严谨的序列纠错能力。
[0436]
实施例10：利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基 因簇功能基因的技术体系从未知的稻种资源群体中鉴别并挖掘其新旧功能基因 的实例(图11)
[0437]
一、实验方法
[0438]
(1)本发明之技术体系由“单倍型
‑
亚单倍型
‑
功能基因”等三级检测标记之14 个基本的特异性标记组成。其中，功能性/非功能性单倍型，以及功能性单倍型 之亚单倍型检测需按照先后顺序推进，而后续的各个功能基因的检测则没有先后 顺序之分。整套技术体系的检测程序及方案如上所述(图3～9；实施例2～8)，恕 不赘述(下同)。
[0439]
(2)利用上述技术体系对60个随机选择的稻种资源(cv1～60；zhai et al. 2011,new phytologist,189:321
‑
334；hua et al.2012,theor appl genet 125: 1047
‑
1055；chai et al.2012,rice,in press)进行pi2/pi9抗病基因簇功能基因的鉴 别及挖掘；8个功能基因携带品种作为参考品种(如上所述)。
[0440]
(3)利用常规的基于pcr技术的同源基因克隆技术(zhai et al.2011,newphytologist,189:321
‑
334；hua et al.2012,theor appl genet 125:1047
‑
1055)，分离 克隆新型的功能基因并进行测序。
[0441]
二、实验结果
[0442]
(1)在基于一级标记的功能性单倍型/非功能性单倍型检测中，60个供试品 种被分类为：
[0443]
功能性单倍型品种：12个(如上所述)
[0444]
非功能性单倍型品种：48个
[0445]
特别地，在后续的检测中，排除48个非功能性单倍型品种。
[0446]
(2)在基于二级标记的功能性单倍型/非功能性单倍型检测中，12个功能性 单倍型品种被进一步分类为：
[0447]
5个pi2/zt亚单倍型品种(红色标示)：cv28,cv29,cv30,cv52,cv59；
[0448]
1个pi50/gm亚单倍型品种(蓝色标示)：cv60；
[0449]
6个piz亚单倍型品种(浅蓝色标示)：cv14,cv18,cv21,cv22,cv27, cv49；
[0450]
没有pi9亚单倍型品种(绿色标示)。
[0451]
(3)在基于三级标记的功能基因检测中，12个功能性单倍型供试品种被进一 步鉴别为：
[0452]
目标基因pi2携带品种(红色标示；图11c)：cv28,cv29,cv30；
[0453]
目标基因piz
‑
t携带品种(蓝色标示；图11d)：cv52,cv59；
[0454]
目标基因pi50/pigm携带品种(绿色标示；图11e)：cv60；
[0455]
目标基因pi9携带品种(浅蓝色标示；图11f)：没有；
[0456]
目标基因piz携带品种(浅红色标示；图11g)：没有；
[0457]
未知新基因piz
‑
mwz携带品种(紫色标示；图11a～g)：cv14；
[0458]
未知新基因piz
‑
tfb携带品种(紫色标示；图11a
‑
g)：cv18,cv21,cv22,cv27,cv49。
[0459]
特别地，“单倍型
‑
亚单倍型
‑
功能基因”等三级标记检测的结果分别以独立的彩色体系标示之。
[0460]
(4)利用常规的基于pcr技术的同源基因克隆方法，分离克隆了piz(genbankmz570866),piz
‑
mwz(genbankmz570867),piz
‑
tfb(genbankmz570868)等3个新型的功能基因
[0461]
特别地，由于最新挖掘的2个未知新基因的基因型既与已知的6个功能基因(含piz)的不同，它们之间彼此亦不相同，因此，被分别命名为piz
‑
mwz(maweizhan,cv14),piz
‑
tfb(tianfengb,cv27)。
[0462]
该实例鉴证了本技术体系具有强大的包容性及可比性，因为在piz未分离克隆的条件下，通过单倍型及亚单倍型分析，挖掘了6个piz亚单倍型品种；继而通过比较该体系中一系列的已知功能基因特异性标记的基因型，鉴证了6个piz亚单倍型品种都不含有已知的功能基因piz，而是属于piz亚单倍型的2种类型的新基因piz
‑
mwz及piz
‑
tfb。
[0463]
实施例11：利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇功能基因的技术体系从稻种资源中鉴别该基因簇存在的等位基因(pi2/piz
‑
t)的实例(图3～6,12)
[0464]
(1)前期的克隆研究工作表明，pi2/piz
‑
t是该基因簇的功能基因，二者【pi2(ck1,2)；piz
‑
t(ck3,4)】之间只有8个氨基酸的不同(zhouetal.2006,molecularplant
‑
microbeinteractions,19:1216
‑
1228)，且集中于基因组区域#7902～#8029(图5,6)。
[0465]
(2)供试品种由18个参考品种(ck1～18)组成(图3；实施例2)。
[0466]
(3)在基于一级标记的功能性单倍型/非功能性单倍型检测中，二者携带品种没有差异，皆为功能性单倍型品种(图12a)；
[0467]
(4)在基于二级标记的亚单倍型检测中，二者携带品种仍然没有差异，皆为pi2/zt亚单倍型品种(图12b)；
[0468]
(5)在基于pi2特异性snp开发的三级标记对9个功能性单倍型参考品种的鉴定中发现，piz
‑
t之#7905ttc为测序错误，应为#7905gtc(图6；图12c)；
[0469]
(6)在基于piz
‑
t特异性snp开发的三级标记对9个功能性单倍型参考品种的鉴定中发现，pi50/pigm之#8028ct为测序错误，应为#8028tg，piz
‑
t与pi50/pigm没有差异，但是与pi2有差异(图6；图12d)；
[0470]
(7)在基于pi2/pi50/pigm特异性snp开发的三级标记对9个功能性单倍型参考品种的鉴定中发现，在#7902位点，pi2(cag)与piz
‑
t(tgt)及pi50/pigm(cgt)的snp是真实的，该位点实为pi2特异性snp(图5；图12e)；
[0471]
(8)在基于pi2/piz
‑
t特异性snp开发的三级标记对9个功能性单倍型参考 品种的鉴定中发现，piz
‑
t之#7992t为测序错误，应为#7992g，pi2与pi50/pigm 及piz
‑
t都有差异，该位点实为pi2特异性snp(图5；图12f)；
[0472]
(9)特别地，针对pi2/piz
‑
t特异性indel(7919)开发的三级标记(#15附加 标记)对5个功能基因以及3个非功能性基因的鉴定中发现，pi2之indel(7919) 为测序错误，二者相同，都没有缺失，而与其他功能基因及非功能性基因有差异 (有缺失；图12g)；
[0473]
对于#15附加标记(上带，目标基因；下带，非目标基因)：
[0474]
seq id no.31(pi2/zt
indel(7919)
‑
f；5
’‑3’
)：
[0475]
atgtggatgctgcaggaatctc；
[0476]
seq id no.32(pi2/zt
indel(7919)
‑
r；5
’‑3’
)：
[0477]
gatgaaatagaatctaggcactca。
[0478]
综上所述，该技术体系具有系统而严谨的包容性、可比性以及纠错能力，避 免了因为原始数据或者参考序列错误而作出的误判。具体之，真正能够鉴别 pi2/piz
‑
t的是基于1个正确和2个错误的原始数据或者参考序列snp开发的特 异性分子标记：pi2
cag7902tgt/cgt
,pi2
t7992g
,pizt/50/gm
tg8028ct
(图12)。
[0479]
实施例12：利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因 簇功能基因的技术体系从稻种资源中甄别该基因簇存在的“异名同质基因
”ꢀ
(pi50/pigm)的实例(图3～4,13)
[0480]
有别于一般的分子标记专利技术，仅仅针对于目标基因特定基因组区域 dna多态性而进行的检测，本发明之技术体系由“单倍型
‑
亚单倍型
‑
功能基因
”ꢀ
等三级检测标记组成。由于其契合了目标基因家族的进化轨迹及模式，而且开放 性地包含了主要的功能特异性基因组区域及snp，各个标记独立但具有严谨的逻 辑性。由此实现了对簇内功能基因的精准鉴别。
[0481]
(1)前期的克隆研究工作表明，pi50(su et al.2015,theoretical and appliedgenetics,128:2213
‑
2225)与pigm(deng et al.2017,science,355:962
‑
965)被判断 为该基因簇不同的功能基因，因为按照基因命名国际规则，不同基因才能被命名 为不同的名称。
[0482]
(2)同样地，供试品种由18个参考品种(ck1～18)组成(图3；实施例2)。
[0483]
(3)由上述技术体系之一套14个特异性标记检测的结果皆证明，二者【pi50 (ck5)/pigm(ck6)】之间没有差异，但是二者可以通过其共同的特异性分子标记 组合(pi50/gm
a7746g
,pi50/gm
g8626c
)清晰地区别于该基因簇其他的功能基因(图13a
‑
g)；
[0484]
(4)基于pi50/pigm之间唯一特异性序列开发的三级标记(#16附加标记； pi50/pigm
indel(5031)
)对pi2/pi9抗病基因簇之6个已知功能基因进行鉴证，结果表 明该基因簇所有功能基因之间没有差异，说明该特异性序列是测序错误造成的 (图13h)。
[0485]
对于#16附加标记(供试品种皆无差异)：
[0486]
seq id no.33(pi50/pigm
indel(5031)
‑
f；5
’‑3’
)：
[0487]
tggtggtgtgctttttcttt；
[0488]
seq id no.34(pi50/pigm
indel(5031)
‑
r；5
’‑3’
)：
[0489]
tagccctatgagattattatccg。
[0490]
综上所述，该技术体系具有系统而严谨的包容性、可比性以及纠错能力。具 体之，一系列特异性分子标记检测的结果表明，二者确实是“异名同质基因”。
[0491]
实施例13：利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因 簇功能基因的技术体系从稻种资源中甄别该基因簇存在的“同名异质基因”[piz (fukunishiki)/piz(irblz
‑
fu)]的实例(图3,9,14)
[0492]
有别于一般的分子标记专利技术，仅仅针对于目标基因特定基因组区域 dna多态性而进行的检测，本发明之技术体系由“单倍型
‑
亚单倍型
‑
功能基因
”ꢀ
等三级检测标记组成。由于其契合了目标基因家族的进化轨迹及模式，而且开放 性地包含了主要的功能特异性基因组区域及snp，各个标记独立但具有严谨的逻 辑性。由此实现了对不同来源的种质资源而产生“同名异质基因”的精准鉴别。
[0493]
(1)如上所述，piz为该基因簇中尚未被分离克隆的功能基因。在18个参考 品种中，ck9(fukunishiki，piz供体品种)与ck10(irblz
‑
fu；由fukunishiki 开发的piz单基因系)具有亲缘谱系关系，都是piz的携带者(tsunematsu et al. 2000,breed sci,50:229
‑
234)。
[0494]
(2)但是，利用2个单倍型特异性标记对18个参考品种进行鉴定，结果表 明，ck9与该基因簇其他功能基因相同，属于功能性单倍型品种；而ck10则与 该基因簇其他功能基因不相同，属于非功能性单倍型品种(图3,14a)；
[0495]
(3)为了确认上述结果，选择2个单倍型特异性附加标记(#17,18附加标记) 对18个参考品种进行鉴定，结果表明二者仍然存在差异，ck9仍然属于功能性 单倍型品种，而后者仍被确认为非功能性假品种(图14b)；
[0496]
对于#17参考标记(上带，非功能性单倍型；下带及双带，功能性单倍型)：
[0497]
seq id no.35(pi2/9
‑
f/n
g7720a
‑
f；5
’‑3’
)：
[0498]
ggaataggtaagttgcgagacat；
[0499]
seq id no.36(pi2/9
‑
f/n
g7720a
‑
r；5
’‑3’
)：
[0500]
attggagggaagagagcttctca。
[0501]
对于#18参考标记(上带，功能性单倍型；双带，非功能性单倍型)：
[0502]
seq id no.37(pi2/9
‑
f/n
t8045g
‑
f；5
’‑3’
)：
[0503]
gatgcctaactggattgagca；
[0504]
seq id no.38(pi2/9
‑
f/n
t8045g
‑
r；5
’‑3’
)：
[0505]
gccccaagtatcagcatggtt。
[0506]
(4)为了进一步确认ck9是否为piz的携带者，利用2个piz功能特异性 分子标记对9个功能性单倍型品种进行鉴定，结果表明ck9确实含有该基因簇 的功能基因piz(图9；14c)；
[0507]
(5)为了进一步确认供试材料是否存在混杂的问题，将ck9与2个不同来源 的ck10进行了比较鉴定，结果表明ck9确实与“ck10原种”相同，而与“ck10 混杂者”不同(图14d)。
[0508]
综上所述，该技术体系具有系统而严谨的包容性、可比性以及纠错能力。具 体之，一系列特异性分子标记检测的结果表明，ck9及“ck10原种”是piz的 携带者，而“ck10混杂者”不是piz的携带者(可能含有其他抗病基因)。总之， ck9与“ck10混杂者”携带的确实是“同名异质基因”。
[0509]
实施例14：利用上述一套具有包容性且精准鉴别并挖掘稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇功能基因的技术体系与其他标记体系鉴别能力比较的实例(图11,15)
[0510]
(1)如上所述稻瘟病pi2/pi9抗病基因簇是最重要的广谱持久抗源，科学家针对1～2个，至多4个功能基因开发其特异性标记，以提高其利用效率【pi2(alametal.2015,proceedingsofthenationalacademyofscienceofindia,sectionb,biologicalscience,9:19)；pi9(scheuermannandjia2016,phytopathology,106:871
‑
876；zhouetal.2020,rice,13:80)；pi2,pi9(tianetal.2016,rice,9:19)；pi9,pi2,piz
‑
t,pigm(tianetal.2020,plantdisease,104:1932
‑
1938)】；
[0511]
(2)从上述主要参考文献中，选择最新且最具鉴别能力的他方标记体系(tianetal.2020,plantdisease,104:1932
‑
1938)，以上述60个稻种资源之12个功能性单倍型品种(图11)为模板进行鉴定比较(图15)，结果表明，本发明之技术体系与其他标记体系(包括他方标记体系，下同)相比,具有如下突出而确切的创新性及有益效果：
[0512]
(a)利用一级标记进行功能性/非功能性单倍型分析，为后续功能基因的挖掘及鉴别划出了清晰的功能性单倍型界限。在该实例中，从供试的60个稻种资源中淘汰了48个非功能性单倍型品种，仅对12个功能性单倍型品种进行后续的检测分析(图11)，由此一方面大大提高了工作的效率(5倍)，另一方面大大减少了因功能性/非功能性单倍型序列激烈分化而产生遗传背景的干扰，使检测效果更清晰。这是任何其他标记检测体系所无法比拟的有益效果之一；
[0513]
(b)利用二级标记进行功能性单倍型品种之亚单倍型分析，进一步为后续各个功能基因的鉴别划出了清晰的亚单倍型界限。在该实例中，12个功能性单倍型品种被进一步划分为4种亚单倍型，其中cv28～30,cv52,cv59被划分为pi2/zt亚单倍型品种；cv60为pi50/gm亚单倍型品种；cv14,18,21,22,27,49为piz亚单倍型品种；没有pi9亚单倍型品种(图15
‑
a1)。这也是任何其他标记检测体系所无法比拟的有益效果之一。
[0514]
(c)利用成对的三级标记进行功能基因分析，为各个功能基因的鉴别划出了清晰且可比对的功能基因界限。在该实例中，分别为5个功能基因(如上所述pi50＝pigm,合并为1个基因)遴选了一对最优的功能特异性标记组合，彼此相互独立却互为比对而构成一套严谨的鉴别体系。这也是任何其他标记检测体系所无法比拟的有益效果之一。以下仅选择4个比较实例作进一步的说明。
[0515]
比较实例1(检测体系的类型):如上所述，本发明之技术体系由“单倍型
‑
亚单倍型
‑
功能基因”等三级检测标记组成。由于其契合了目标基因家族的进化轨迹及模式，且开放性地包含了主要功能基因的功能特异性基因组区域及snp，各个标记独立而具有强大的包容性、严谨的逻辑性以及精确的可比性。由此实现了由上述测序错误而产生的真假特异性基因组区域及snp，以及由于上述标记检测体系不严谨而产生的“异名同质基因”、“同名异质基因”或者“真假基因”的甄别。而在参考的标记体系中，仅仅针对已知且少数的目标基因进行检测而不具有包容性、逻辑性及可比性，无以开展目标基因以外的挖掘及鉴别工作。因此，本发明之技术体系具有系统而严谨的鉴别能力及纠错能力。无疑地，我方的技术体系具有更加强大而广泛而精确的检测能力。
[0516]
比较实例2(标记的类型):在本发明之技术体系中，所有标记皆为在各个参考功能基因的编码区开发的功能特异性分子标记；而在他方标记体系中，只有一个是同类型的
标记，另外2个则是编码区以外开发的分子标记。无疑地，我方的标 记更具功能特异性及准确性。此外，为了提高基因组区域分化严重之目标基因检 测的可靠性，本发明之技术体系构建了多引物pcr检测体系(#7标记；图15
‑
a2)， 以避免像他方标记体系那样，出现个别样本无法检测的情况(图15
‑
b2)。
[0517]
比较实例3(新基因的挖掘):在本发明之技术体系中，上述cv14等6个品 种被划分为piz亚单倍型(图15
‑
b1)；但是，在一系列功能基因分析的综合结果表 明，上述6个品种都不是piz的携带者，而是其等位基因的携带者【piz
‑
mwz (cv14)；piz
‑
tfb(cv18,21,22,27,49)；图15
‑
a2～6】。而在他方标记体系中，由 于该体系不具有包容性及可比性，在原始文献中检测的目标基因并没有包括piz 及pi50，由此，与ck7，ck8基因型相似的上述6个品种都与其既定的4个目 标基因(pigm,pi9,pi2,piz
‑
t)的不同，既不能推断其为功能基因的携带者，更不 能鉴别其为2个piz等位基因的携带者(图15
‑
b1～3)。无疑地，我方检测的结果 更具包容性、可比性及准确性。
[0518]
比较实例4(已知基因的鉴别):在本发明之技术体系中，cv52,59被推断为 pi2/zt亚单倍型之piz
‑
t基因携带者，2个层次检测的结果清晰而一致(图15
‑
a1～6)。 而在他方标记体系中，由于检测标记不具有层次性及逻辑性，cv52被判断为piz
‑
t 携带者，而cv59则被推断为未知基因的携带者(图15
‑
b1～3)。无疑地，我方检 测的结果更具逻辑性及严谨性。
[0519]
结论：本发明之技术体系具有任何其他标记检测体系所无法比拟的创新性及 有益效果。
[0520]
上述实例从不同角度实证了本发明之技术体系具有包容性且精准鉴别并挖 掘pi2/pi9抗病基因簇功能基因非凡的能力及效果。
[0521]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。