主动脉细胞单细胞悬液的制备方法

1.本发明涉及细胞生物技术领域，尤其涉及一种主动脉细胞单细胞悬液的制备方法。


背景技术：

2.主动脉疾病是较为凶险的心血管疾病，常见的有主动脉夹层、壁间血肿、动脉粥样硬化、动脉瘤、马凡综合征、先天性主动脉疾患、外伤性疾患、主动脉炎症等。主动脉病变机制复杂，参与细胞种类繁多。随着单细胞测序技术的发展，对相关参与细胞的分析结果对主动脉疾病的攻克有重要的影响。但是由于主动脉血管韧性高，使得单细胞悬液的制备较为困难，很难获得效率高、活性高、功能强的单细胞以供相关病理学的研究。
3.因此，一种获得高效高质量的单细胞悬液的制备方法的出现势在必行。


技术实现要素：

4.针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种主动脉细胞单细胞悬液的制备方法，以解决相关技术中传统主动脉细胞单细胞悬液效率低获得的细胞质量差的技术问题。
5.本发明提供了一种主动脉细胞单细胞悬液的制备方法，包括：
6.s1、取主动脉血管组织，清洗，然后以第一温度于含8％～20％牛血清的1640培养基中无菌培养，备用；
7.s2、取步骤s1中备用的主动脉血管组织，剥离脂肪和结缔组织，并切碎至1～2mm3的组织碎块，备用；
8.s3、按体积比例为1:(5～8)的比值分别取步骤s2中备用的组织碎块和现配的组织消化悬浮液，混合后置于37℃的环境中进行第一次消化反应第一时长，至无成形组织碎块，过滤、离心、去除上清液，得第一细胞悬液；
9.s4、按体积比例为1：(1.8～3)的比值分别取步骤s3中得到的第一细胞悬液和胰酶，混合后置于37℃的环境中进行第二次消化反应第二时长，过滤、离心、去除上清液，得第二细胞悬液；
10.s5、将步骤s4中获得的第二细胞悬液用含10％牛血清的1640培养基重悬，得目的单细胞悬液。
11.可选地，在步骤s3中，所述组织消化悬浮液包括体积之比为(10:10:10:0:70～35:35:29:1:0)的胶原酶i：胶原酶ii：透明质酸酶：dna酶：含10％牛血清的1640培养基。
12.可选地，在步骤s1中，所述第一温度为0～4℃。
13.可选地，在步骤s1中，所述以第一温度于含8％～20％牛血清的1640培养基中无菌培养的具体步骤包括：
14.置于冰上、并于含10％牛血清的1640培养基中无菌培养。
15.可选地，在步骤s3和s4中，所述过滤、离心的具体步骤包括：
16.用100um的筛网过滤，并于转速为1500rpm下离心时间为25～45分钟。
17.可选地，在步骤s4中，所述胰酶为质量浓度为0.02％的胰酶。
18.可选地，在步骤s3中，所述第一时长为4～5小时；和/或，
19.在步骤s4中，所述第二时长为18～35分钟。
20.可选地，所述牛血清为新生牛血清。
21.相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
22.本发明技术中，通过设计主动脉细胞单细胞悬液的制备方法，拟先对主动脉血管组织进行处理，然后再通过至少二次消化反应获得其单细胞悬液，如此，以克服主动脉血管韧性高、制备主动脉血管细胞的单细胞悬液难的技术壁垒，并且得到了单细胞产率高、数量多、细胞活性高及细胞功能强的单细胞悬液，有效解决了传统主动脉细胞单细胞悬液效率低获得的细胞质量差的技术问题。
附图说明
23.图1为采用机械破碎主动脉血管组织制备得到的单细胞悬液的电镜图；
24.图2为对机械破碎主动脉血管组织制备得到的单细胞悬液的细胞测试结果数据；
25.图3至图8为本发明不同体积配比的组织消化悬浮液处理主动脉血管组织制备得到的单细胞悬液的电镜图。
26.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
27.为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，下面结合附图及实施例对本发明中的技术方案进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
28.本发明提供了一种主动脉细胞单细胞悬液的制备方法，包括：
29.s1、取主动脉血管组织，清洗，然后以第一温度于含8％～20％牛血清的1640培养基中无菌培养，备用；
30.s2、取步骤s1中备用的主动脉血管组织，剥离脂肪和结缔组织，并切碎至1～2mm3的组织碎块，备用；
31.s3、按体积比例为1:(5～8)的比值分别取步骤s2中备用的组织碎块和现配的组织消化悬浮液，混合后置于37℃的环境中进行第一次消化反应第一时长，至无成形组织碎块，过滤、离心、去除上清液，得第一细胞悬液；
32.s4、按体积比例为1：(1.8～3)的比值分别取步骤s3中得到的第一细胞悬液和胰酶，混合后置于37℃的环境中进行第二次消化反应第二时长，过滤、离心、去除上清液，得第二细胞悬液；
33.s5、将步骤s4中获得的第二细胞悬液用含10％牛血清的1640培养基重悬，得目的单细胞悬液。
34.可选地，在步骤s3中，所述组织消化悬浮液包括体积之比为(10:10:10:0:70～35:35:29:1:0)的胶原酶i：胶原酶ii：透明质酸酶：dna酶：含10％牛血清的1640培养基。例如但不限于，在一实施例中，胶原酶i：胶原酶ii：透明质酸酶：dna酶：含10％牛血清的1640培养
基的体积配比为25:25:30:1:9。
35.应当理解，上述配制的组织消化悬浮液需要通过0.22um的滤膜过滤，以除菌。
36.例如但不限于，步骤s3中按体积比例为1:6的比值分别取步骤s2中备用的组织碎块和现配的组织消化悬浮液，混合后置于37℃的环境中进行第一次消化反应4小时。在步骤s4中按体积比例为1:2的比值分别取步骤s3中得到的第一细胞悬液和胰酶，混合后置于37℃的环境中进行第二次消化反应20min。
37.可选地，在步骤s1中，所述第一温度为0～4℃。例如但不限于，所述第一温度为4℃。
38.可选地，在步骤s1中，所述以第一温度于含8％～20％牛血清的1640培养基中无菌培养的具体步骤包括：
39.置于冰上、并于含10％牛血清的1640培养基中无菌培养。
40.可选地，在步骤s3和s4中，所述过滤、离心的具体步骤包括：
41.用100um的筛网过滤，并于转速为1500rpm下离心时间为25～45分钟。例如但不限于，所述离心时间为30分钟。
42.可选地，在步骤s4中，所述胰酶为质量浓度为0.02％的胰酶。
43.可选地，在步骤s3中，所述第一时长为4～5小时。例如但不限于，所述第一时长为4.5小时。
44.可选地，在步骤s4中，所述第二时长为18～35分钟。例如但不限于，所述第二时长为20分钟。
45.可选地，所述牛血清为新生牛血清。
46.为进一步阐述本发明提供的主动脉细胞单细胞悬液的制备方法的优异效果，选用以下实施例进行详细阐述。应当理解，下列实施例仅用于说明本发明中制备方法的效果，并不限制本发明的制备方法。
47.需要说明的是，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、器材等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下列实施例组中用到的具体试剂如下：
48.胶原酶胶原酶i(sigma公司，货号为1148089，浓度为4.1mg/ml)；
49.胶原酶ii(sigma公司，货号为1148090，浓度为2.6mg/ml)；
50.透明质酸酶(sigma公司，货号为h1115000，浓度为1.6mg/ml)；
51.dna酶(sigma公司，货号为10104159001，浓度为1.0mg/ml)。
52.对照组机械破碎主动脉血管组织制备单细胞悬液
53.1、实验操作：取人的主动脉血管组织，清洗掉血液、碎片组织，然后立即放入含10％牛血清的1640培养基的培养瓶中进行无菌培养，并且将培养瓶放置于冰上，备用；取上述备用的主动脉血管组织，剥离脂肪和结缔组织，机械破碎、备用；用含10％fcs的1640培养基重悬，得主动脉血管组织单细胞悬液。对该单细胞悬液进行电镜观察，得到如图1所示的电镜图；对该单细胞悬液进行测试，得到如图2所示的细胞测试单。
54.2、结果分析：由图1可知，通过该方法获得的单细胞悬液，其细胞碎片多、细胞粘连成团的现象严重。由图2可知，通过该方法制备得到的单细胞悬液，细胞产率仅16％，细胞的平均直径在6.21um，结团率高达69.83％。
55.实施例组不同浓度组织消化悬浮液处理后得到的单细胞悬液
56.1、实验操作：
57.s1、取主动脉血管组织，清洗掉血液、碎片组织，然后立即放入含10％牛血清的1640培养基的培养瓶中进行无菌培养，并且将培养瓶放置于冰上，备用；
58.s2、取步骤s1中备用的主动脉血管组织，剥离脂肪和结缔组织，并用无菌手术剪剪碎至1～2mm3的组织碎块，转入15ml的离心管中备用；
59.s3、按体积比例为1:6的比值分别取步骤s2中备用的组织碎块和现配的组织消化悬浮液(该组织消化悬浮液各组分及其体积配比如表1所示)，混合后置于37℃的环境中振荡、以进行第一次消化反应4.5小时，至无成形组织碎块，然后通过100um筛网过滤、1500rpm下离心25～45分钟、去除上清液，得第一细胞悬液；
60.s4、按体积比例为1：2的比值分别取步骤s3中得到的第一细胞悬液和浓度为0.02％的胰酶，混合后置于37℃的环境中进行第二次消化反应20min，然后通过100um筛网过滤、1500rpm下离心25～45分钟、去除上清液，得第二细胞悬液；
61.s5、将步骤s4中获得的第二细胞悬液用含10％fcs的1640培养基重悬，得目的单细胞悬液。电镜观察，得到如图3至8的电镜图，及表1中在不同体积配比的组织消化悬浮液处理后的单细胞悬液的结果数据。
62.表1不同体积配比处理主动脉血管组织对制备得到的单细胞悬液的影响
[0063][0064]
注意：表1中组织消化悬浮液各组分体积配比指的是胶原酶i：胶原酶ii：透明质酸酶：dna酶：含10％牛血清的1640培养基的体积配比。
[0065]
2、结果分析：由图3至8可知，通过本发明中提出的主动脉细胞单细胞悬液的制备方法处理主动脉血管组织获得的单细胞悬液的细胞碎片少，且无明显细胞连接成团现象。
[0066]
由表1可知，当胶原酶i：胶原酶ii：透明质酸三者的体积占比过低、dna酶：含10％牛血清的1640培养基的占比过高时，单细胞悬液的细胞产率低，结团率高；具体地，细胞产率可低至45.09％，细胞结团率可高达60.12％。当胶原酶i：胶原酶ii：透明质酸三者的体积占比过高、dna酶：含10％牛血清的1640培养基的占比过低时，细胞产率有所提高，但不明显，细胞结团率降低；具体地，细胞产率可达47.24％，细胞结团率可至52.14％。在胶原酶i：胶原酶ii：透明质酸酶：dna酶：含10％牛血清的1640培养基的体积配比为25:25:30:1:9时，细胞产率可达95.78，细胞结团率可低至17.33％；并且从该细胞悬液分离出的细胞直径均值在11um。
[0067]
综上，通过本发明提供的主动脉细胞单细胞悬液的制备方法制备得到的单细胞悬液的单细胞产率高、细胞数量多、细胞活性高及细胞功能强等特点，其有效解决了传统主动脉细胞单细胞悬液效率低获得的细胞质量差的技术问题，对临床医学和血管细胞研究有重要意义。
[0068]
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。