本发明属于抗原净化处理技术领域，具体地说涉及一种用于胚毒类抗原净化处理的方法及其应用。
背景技术：
胚毒类抗原是采用禽胚生产获得的一类抗原，用禽胚生产抗原是一种经典的抗原生产方法，在畜禽的疫苗生产中有相当一部分需要用禽胚来生产抗原，应用非常广泛。但这种生产方法也存在一些弊端，比如因为抗原收获的是禽胚的尿囊液，甚至胚体，必定存在禽胚本身的许多杂蛋白及脂类，在制备疫苗过程中，必须去除这些杂质，否则疫苗的安全性无法保证，且长期保存的稳定性较差。常规的处理方法都存在一些问题，比如简单离心处理只能将颗粒较大的杂蛋白去除；层析法处理步骤繁杂且成本较高；氯仿萃提法因为有毒性，对人体伤害较大，所以限制使用且不易于大规模生产；反复冻融法容易使抗原染菌且对病毒含量影响较大。
技术实现要素：
针对现有技术的种种不足，为了解决上述问题，现提出一种用于胚毒类抗原净化处理的方法及其应用。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于胚毒类抗原净化处理的方法，包括如下步骤：
（1）抗原预处理：用禽胚接毒后，将收获的胚体和尿囊液混合，将混合后的胚体和尿囊液进行研磨，离心，留上清液；
（2）去除脂类：向步骤（1）中获得的上清液中加入辛酸，辛酸的加入量为上清液体积的0.2-0.5%，静置后过滤去除脂类；
（3）去除杂蛋白：向步骤（2）中获得的过滤液中加入氯化钙和聚丙烯酸钠，氯化钙与过滤液的质量百分比浓度为0.2-0.8%，聚丙烯酸钠与加入氯化钙后的液体的质量百分比浓度为0.5-2.0%，静置后离心，获得的上清液即为抗原液。
优选的，步骤（1）中，将混合后的胚体和尿囊液充分研磨后，将研磨液经5000-7000rpm，离心15-30min。
优选的，步骤（2）中，首先将步骤（1）获得的上清液放置于水浴锅中升温至35-42℃，之后加入辛酸，搅拌5-10min后静置4h以上，之后将上层漂浮的脂类过滤掉。
优选的，步骤（3）中，向步骤（2）中获得的过滤液中加入氯化钙，搅拌均匀后再加入聚丙烯酸钠，搅拌均匀后，于4-8℃的条件下放置过夜，之后5000-7000rpm离心15-30min。
上述用于胚毒类抗原净化处理的方法在用樱桃谷鸭胚生产鸭病毒性肝炎抗原以及用大三花鹅胚生产小鹅瘟抗原中的应用。
优选的，用禽胚接毒后，对于仅收集禽胚尿囊液进行抗原制备的方法中，抗原净化处理的方法为：
（1）抗原预处理：用禽胚接毒后，收获禽胚尿囊液，将禽胚尿囊液冻融一次后离心取上清液；
（2）去除杂蛋白：向步骤（1）中获得的上清液中加入氯化钙和聚丙烯酸钠，静置后离心，获得的上清液即为抗原液。
上述禽胚尿囊液制备抗原的净化处理方法在用鸡胚接种鹅副粘抗原中的应用。
上述用于胚毒类抗原净化处理的方法应用于卵黄抗体的制备中。
有益效果：
（1）本发明提供的胚毒类抗原净化处理的方法操作简便、条件简单、安全环保、成本低、收率高，在大规模生产中较易实现。
（2）本发明中使用的试剂为一般常规试剂，无毒无害，便宜易得且用量少。
（3）本发明所得抗原清澈透明，杂蛋白和脂类被彻底处理，后期制备疫苗的环节无沉淀，疫苗更稳定更安全。
（4）本发明的方法条件温和，对所处理抗原的病毒含量无影响，基本不会损失抗原效价，对疫苗含量无影响。
具体实施方式
为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例1
本具体实施例中提供的用于胚毒类抗原净化处理的方法应用于樱桃谷鸭胚生产鸭病毒性肝炎抗原中，具体的净化处理方法包括如下步骤：
收获鸭胚尿囊液及胚体，经胶体磨充分研磨后，用杯式离心机7000rpm，离心20min，取上清（该步骤取样保存，标记为样a），上清液置于提前预热到37℃的水浴锅中，待上清液温度上升到37℃后，按照上清液体积的0.5%的量加入辛酸，边加边搅拌，且维持搅拌5min，之后将搅拌液置于常温静置4h，之后用灭菌纱布过滤上层脂类物质。向过滤液中加入氯化钙，氯化钙的加入量为氯化钙与过滤液的质量百分比浓度为0.3%，搅拌均匀后再缓慢加入聚丙烯酸钠，聚丙烯酸钠的加入量为聚丙烯酸钠与加入氯化钙后的液体的质量百分比浓度为0.8%，搅拌均匀后放置4-8℃冰箱过夜。将过夜后的静置液7000rpm离心20min，所得上清即为处理好的鸭肝病毒性肝炎抗原液（取样保存，标记为样b），该抗原液可直接用于制备疫苗。本实施例中所有固体保留称重，计算固含量为21%。
同时，用反复冻融法处理同批次抗原，将研磨后的抗原反复冻融3次，每次溶解后7000rpm离心20min，最后一次离心后得到的上清即为处理好的抗原液（本步骤取样保存，标记为样c），同样所有固体保留称重，计算固含量为17%。采用本具体实施例提供的抗原液净化处理的方法处理胚毒类抗原获得的固体含量为21%，而采用反复冻融法处理胚毒类抗原获得的固体含量为17%，这表明，采用本具体实施例提供的抗原液净化处理的方法处理胚毒类抗原能够去除更多的脂类及杂蛋白，表明本具体实施例提供的抗原液净化处理的方法去除脂类及杂蛋白的效果要优于反复冻融法。
用eid50检测法检测a、b、c三个样品的病毒含量，检测结果如表1所示，由表1可以看出，采用本具体实施例提供的抗原液净化处理的方法获得的样品b的抗原病毒含量与样品a的抗原病毒含量差异较小，而采用反复冻融法处理获得的样品c的抗原病毒含量与样品a的抗原病毒含量差异明显，其抗原病毒含量明显小于样品a的抗原病毒含量，表明采用本具体实施例提供的抗原液净化处理的方法处理胚毒类抗原的效果明显优于反复冻融法，通过本具体实施例提供的抗原液净化处理的方法获得的抗原液中抗原效价损失小。
实施例2
本具体实施例中提供的用于胚毒类抗原净化处理的方法应用于大三花鹅胚生产小鹅瘟抗原中，具体的净化处理方法包括如下步骤：
收获鹅胚尿囊液、胚体和尿囊膜后，用胶体磨充分研磨后用杯式离心机6000rpm，离心30min，取上清（此步骤取样保存，标记为样d），将上清液置于提前预热到42℃的水浴锅中，待上清液温度上升到42℃后，按照上清液体积0.5%的量加入辛酸，边加边搅拌，且维持搅拌10min，之后将搅拌液置于常温静置5h。用灭菌纱布过滤上层脂类物质，之后向过滤液中加入氯化钙，氯化钙的加入量为氯化钙与过滤液的质量百分比浓度为0.5%，搅拌均匀后再缓慢加入聚丙烯酸钠，聚丙烯酸钠的加入量为聚丙烯酸钠与加入氯化钙后的液体的质量百分比浓度为1.5%，搅拌均匀后放置4-8℃冰箱过夜。将过夜后的静置液6000rpm离心30min，所得上清即为处理好的小鹅瘟抗原液（取样保存，标记为样e）。本实施例中所有固体保留称重，计算固含量为26%。
同时，用氯仿萃提法处理同批次抗原，将研磨并离心后的抗原中加入终浓度为3%的氯仿，剧烈振摇2min使其充分混匀，室温反应30min，期间间断振摇3次，每次2min，再经6000rpm离心30min，小心倒出上清，避免氯仿被带入上清（上清取样保存，标记为样f）。同样保留固体称重，计算固含量为29%。
用单项琼脂扩散法检测三个样品的效价，检测结果如表2所示，由表2可以看出，采用本具体实施例提供的抗原液净化处理的方法获得的样品e的抗原琼扩效价明显优于采用氯仿萃提法处理获得的样品f的抗原琼扩效价,表明采用本具体实施例提供的抗原液净化处理的方法处理胚毒类抗原的效果明显优于氯仿萃提法处，通过本具体实施例提供的抗原液净化处理的方法获得的抗原液中抗原效价损失小,并且本发明中使用的试剂为一般常规试剂，无毒无害。
实施例3
本具体实施例中提供的用于胚毒类抗原净化处理的方法应用于鸡胚生产鹅副粘抗原中，具体的净化处理方法包括如下步骤：
本实施例中用鸡胚接种鹅副粘病毒，收获鸡胚尿囊液后，经-20℃冻融一次，再用杯式离心机5000rpm离心15min，取上清（取样标记为样g），固体收集并称重，计算固含量约为1.5%。本批抗原因为只收集尿囊液，抗原中脂类含量极少，所以可以省去辛酸处理步骤。向离心获得的上清液中加入氯化钙，氯化钙的加入量为氯化钙与过滤液的质量百分比浓度为0.2%，搅拌均匀后再缓慢加入聚丙烯酸钠，聚丙烯酸钠的加入量为聚丙烯酸钠与加入氯化钙后的液体的质量百分比浓度为0.5%，搅拌均匀后放置4-8℃冰箱过夜。将过夜后的静置液5000rpm离心15min，所得的上清液即为处理好的鹅副粘抗原液（取样标记为样h）。固体称重，计算固含量约为3.2%。
用血凝法检测两个样品的效价，结果如表3所示，由表3可以看出，采用本具体实施例提供的抗原液净化处理的方法处理去除蛋白质的过程中，抗原液中抗原血凝效价无损失。
实施例4
本具体实施例中提供的用于胚毒类抗原净化处理的方法应用于樱桃谷鸭胚生产鸭病毒性肝炎抗原中，具体的净化处理方法包括如下步骤：
收获鸭胚尿囊液及胚体，经胶体磨充分研磨后，用杯式离心机5000rpm，离心30min，取上清，上清液置于提前预热到42℃的水浴锅中，待上清液温度上升到42℃后，按照上清液体积的0.2%的量加入辛酸，边加边搅拌，且维持搅拌10min，之后将搅拌液置于常温静置8h，之后用灭菌纱布过滤上层脂类物质。向过滤液中加入氯化钙，氯化钙的加入量为氯化钙与过滤液的质量百分比浓度为0.8%，搅拌均匀后再缓慢加入聚丙烯酸钠，聚丙烯酸钠的加入量为聚丙烯酸钠与加入氯化钙后的液体的质量百分比浓度为2.0%，搅拌均匀后放置4-8℃冰箱过夜。将过夜后的静置液7000rpm离心15min，所得上清即为处理好的鸭肝病毒性肝炎抗原液，该抗原液可直接用于制备疫苗。
实施例5安全性实验
本发明所述的用于胚毒类抗原净化处理的方法应用于卵黄抗体的制备中。因此对通过该方法处理获得的抗原液的安全性验证以及效力验证均通过产蛋鸡来进行。
将实施例1-3中的8个样品乳化制备疫苗，用健康产蛋鸡评价其安全性。每个样品注射32只产蛋鸡，剂量为2ml/只，观察7天，结果如表4所示，由表4可以看出，注射样品a和d组的产蛋鸡在第三天后均出现了各别鸡萎靡，而其他组中的产蛋鸡均正常，表明通过本发明的方法获得的样品b、e、h用于疫苗生产并作用于产蛋鸡上是安全的。
实施例6效力试验
将实施例1-3中的8个样品乳化制备疫苗，免疫健康产蛋鸡验证效力试验，每个抗原免疫32只鸡，免疫程序为：第一次免疫0.5ml/只，间隔2周后第二次免疫，剂量为0.8ml/只，3周后第三次免疫，剂量为1.0ml/只。第三次免疫后，分别于14天、28天和42天取蛋检测蛋黄中相应的抗体效价。
检测结果如表5-7所示，由表5可以看出，样b组卵黄中鸭病毒性肝炎抗体效价与样a组卵黄中鸭病毒性肝炎抗体效价相当，甚至优于样a组卵黄中鸭病毒性肝炎抗体效价，两者均明显优于样c组卵黄中鸭病毒性肝炎抗体效价，表明采用本发明的净化处理方法获得的抗原液在卵黄抗体生产时的抗体效价明显优于反复冻融法。
由表6可以看出，样e组卵黄中小鹅瘟抗体效价与样d组卵黄中小鹅瘟抗体效价相当，甚至优于样d组卵黄中小鹅瘟抗体效价，两者均优于样f组卵黄中小鹅瘟抗体效价，表明采用本发明的净化处理方法获得的抗原液在卵黄抗体生产时的抗体效价明显优于氯仿萃提法。
由表7可以看出，样h组卵黄中鹅副粘抗体效价与样g组卵黄中鹅副粘抗体效价相当，但样h中去除了杂蛋白，更利于样h抗原液的保存以及后期生产。
综上所述，采用本发明的方法净化后获得的抗原液，无论在安全性和效力方面都呈现出较明显的优势。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化均囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。