一株具有抑制肾结石形成能力的植物乳杆菌及其应用

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株具抑制肾结石形成能力的植物乳杆菌，特别涉及功能性乳酸菌及其制品研发领域。

技术背景

肾结石是世界范围内常见的泌尿系统疾病之一，可引起疼痛、尿路感染、慢性肾脏病，甚至肾功能丧失，其患病率在全球范围内逐年增加。草酸钙结石是最主要的结石类型，约占80%。只有少数肾草酸钙结石是由原发性高草酸尿症引起的，大多数肾草酸钙结石患者的成因仍不清楚。常规治疗方法包括药物治疗、体外冲击波碎石术和输尿管软镜碎石术等，虽然这些治疗方法能成功地除掉大部分肾结石，但手术后的复发率仍很高，5年后的复发率高达53%，且给患者带来了极大的经济和生理负担。目前主要预防手段还是传统的增加饮水量及限制易致石成分的摄入，但是效果并不明显。因此，寻找新的治疗或/和预防肾草酸钙结石的方法迫在眉睫。

哺乳动物因为缺乏草酸生物转化的酶。其草酸的新陈代谢主要依赖于其有限的吸收、排泄和微生物降解，草酸在胃肠道中被微生物降解从而减少了血液中的草酸，因此被认为是降低肾脏疾病的风险的重要因素。以往的研究主要集中在少数几种草酸降解菌上，如乳杆菌属(lactobacillus)、双歧杆菌属(bifidobacterium)和草酸杆菌属(oxalobacterformiges)。sadaf等发现肠道微生物中的草酸杆菌可以通过草酰辅酶a脱羧酶和甲酰辅酶a转移酶将草酸降解为甲酸；hatch等人的研究指出服用草酸杆菌后，高草酸尿大鼠尿草酸排泄量减少。近年来，出现了一些关于肠道微生物与肾结石之间相关性的报道：广西医科大学的研究团队通过对肾结石患者和健康人粪便进行16srrna基因测序发现，肾结石患者肠道菌群的物种丰度和多样性显著降低，且与健康人的肠道菌群的结构有明显的差异，某些促炎性细菌的丰度显著升高。意大利andreaticinesi团队运用从宏基因组的方法分析特发性钙结石患者（sf）的肠道菌群组成和功能，鉴定出5个与sf和尿草酸相关的类群，包括多种之前未发现的可降解草酸类群，发现sf粪便中，与草酸降解相关的菌群基因及含有这些基因的分类群总含量下降，与uoe呈负相关，指出肠-肾轴可能参与了肾结石的形成。

益生菌在治疗泌尿系统相关疾病方面显示出巨大潜力。据lieske等人报道，摄入益生菌可以控制慢性肾病患者的氧化应激和全身炎症。campieri等人研究显示服用乳酸菌还可降低肾结石患者的尿草酸水平，提示补充含有乳酸菌的益生菌可能是治疗肾结石的潜在策略。

乳酸菌（lacticacidbacteria，lab）是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称。乳酸菌作为益生菌的一类，被美国食品和药品监督管理局（fda）认定是高度安全的食品级微生物。植物乳杆菌作为乳酸菌家族的一员，广泛存在于发酵食品中，其具有调节肠道菌群平衡、降低胆固醇水平，心血管疾病发病率等多种益生功能。目前已在体外实验中证实植物乳杆菌有降解草酸的能力，不少重组植物乳杆菌经动物实验证明其具有抑制结石形成的能力，paul等人的研究中发现重组益生菌显著降低了大鼠尿中的草酸、钙、尿素和肌酐水平，肾结晶较少，表明植物乳杆菌分泌的oxdc能够降解实验大鼠肠道草酸，从而防止草酸结石的形成。sasikumar等研究中植物乳杆菌重组菌株wcfs1oxdc和nc8oxdc在体外可降解70-77%草酸，大鼠尿中草酸、钙、尿酸、肌酐及血清尿酸、尿素氮/肌酐比值显著降低，肾匀浆中草酸含量显著降低，肾结晶极少。重组菌株能够通过增加肠道草酸降解而减少尿中草酸排泄量和草酸晶体沉积，但这些经过基因改造的重组细菌，今后应用于临床治疗及益生菌食用产品的安全性有待商榷，也面临相关法规的限制。此外，也有极少数其他类别天然乳酸菌经动物试验证实具有减少结石形成的能力，kwak等发现lactobacilluscaseihy2743和lactobacilluscaseihy7201联合治疗后，尿草酸盐排泄量下降，大鼠肾脏晶体减少，但这两株菌的生理特性并未见详细报道，其作用机制也不清楚，且未在ncbi中查询到其基因组序列信息。综上，目前分离自人体且未经基因改造的植物乳杆菌在减少肾草酸钙结石形成方面的应用鲜见报道。

有越来越多的证据表明，肠道微生物代谢在肾结石形成中起作用，乳酸菌可以作为预防泌尿结石的潜在治疗策略。因此，筛选抑制肾结石能力较高的乳酸菌，并对其体内抑制肾结石形成能力进行评估，并将其应用于功能性食品领域及临床治疗的辅助疗法具有极大的潜力，而且对人体健康也具有非常重要的意义。

众所周知，草酸是形成草酸钙结石的重要因素，人体草酸主要分为外源性草酸和内源性草酸。内源性草酸组成血液草酸的85%～90%，血液内的草酸5%～10%分泌到肠腔；外源性草酸中的90%～98%与肠道中钙离子结合形成草酸钙，随粪便排出体外或被肠道中微生物降解。可见肠道及肠道微生物在草酸分解代谢中发挥着重要的作用。本申请是基于前期关于草酸钙肾结石与肠道微生物的研究课题得出的最新结果。

技术实现要素：

本发明旨在提供一株具有抑制肾结石形成能力的植物乳杆菌（lactiplantibacillusplantarum）j-15及其应用。

本发明目的还在于：提供一株具有抑制肾结石形成能力的植物乳杆菌（lactiplantibacillusplantarum）j-15的基因组合。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

植物乳杆菌j-15于2021年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏编号为cgmccno.22140。

所述植物乳杆菌j-15，是从四川省成都市一健康人粪便中分离获得。所述的样本采集范畴考量的主要因素包括样粪便采样前三个月内未使用抗生素或免疫抑制剂且无炎症性肠病、无肠易激综合症、无消化道感染、无消化系统肿瘤、没有进行肠道手术或者腹泻或者便秘的年龄一致的人员。

本发明从粪便中得到分离获得植物乳杆菌j-15的具体步骤如下：将粪便样本暂存于4℃冰箱，实验时取出用无菌棉拭子取中间部分约2g置于装有已事先配制好的18ml无菌pbs管中，加入无菌玻璃珠，在温度为37℃，转速为180rpm的摇床上摇10min混匀后梯度稀释至10^-4。选取10^-2，10^-3，10^-4三个稀释度，每个稀释度吸取100μl在gam培养基上进行涂布，重复三次。随后分别放入37℃兼性厌氧培养箱，培养约3天。然后根据菌落形态特征挑取不同细菌于gam培养基上多次纯化，并转至液体培养基中进行扩大培养，提取dna，pcr扩增后送公司测序，ncbi进行菌种比对鉴定。采用终浓度30%的甘油进行保种，置于-80℃保藏。本申请是在传统分离流程基础上，在前期引入了分离培养基预测这一步骤，不仅仅是局限于使用通用培养基来进行细菌的广泛分离、盲筛，而且有目的，有依据的结合生物信息学方法来预测目标微生物的培养基配方。根据16srdna的系统进化相似性，和已知培养基的物种来推断其相似性高的近缘物种的培养基。此方法大大提升了分出目的菌的概率和成功率。

本发明所述植物乳杆菌j-15，在mrs琼脂培养基上生长速度较快，菌落较大，形态特征明显，菌落为乳白色，不透明，表面光滑，边缘整齐，触媒阴性，对菌体形态进行镜检，革兰氏染色呈紫色，杆状。

本发明所述植物乳杆菌j-15，通过耐酸、耐胆盐试验表明其对酸和胆盐有一定的耐受能力。

所述植物乳杆菌j-15，草酸盐降解实验表明其对草酸钠具有一定的降解能力。

所述植物乳杆菌j-15，对大多数抗生素敏感，对个别抗生素有一定耐受能力。

所述植物乳杆菌j-15，通过动物试验表明该菌株能够降低肾结石大鼠尿草酸及尿钙水平，缓解肾脏病理状况，减少肾结晶的形成。

所述植物乳杆菌j-15，通过采用细菌通用引物16srdna的27f/1492r对其基因组总dna为模板进行pcr扩增，拼接得到由1465bp碱基对组成的目的基因序列，如sequencelisting所示。将测序得到的基因序列输入ezbiocloud数据库进行比对，其与细菌16srrna基因数据库库中的标准菌株lactiplantibacillusplantarumatcc14917相似率达100%，据此16srrna相似度，可初步鉴定该菌株为植物乳杆菌（l.plantarum）。然后，采用全基因组测序的方法对j-15基因组中全部基因及相关调控信息进行了探知。

与现有技术相比，本发明的创新性在于：

1、本发明提供的植物乳杆菌l.plantarumj-15为生物信息学与传统培养方法相结合筛选获得。由于微生物分离筛选具有无法预知及不确定性，同样的样本在不同批次的实验中未必能分离到相同微生物，即便使用选择性培养基及特定温度条件也不一定能培养出目的菌属；且即便分离到了目的菌属，由于种间及菌株特异性，同属同种的微生物生物特性也会不一样，常常出现比对结果为同属且同种的微生物，其不同菌株之间呈现出较大的生物学特性及功能差异，而根据菌株形态特征人为对菌株进行挑选纯化过程中往往随机性较大，同样形态特征的菌株也可能为不同类别的菌，所以整个分菌过程结果不可预测。据此，本发明在传统分离培养方法的基础上结合新技术新方法进行了升级优化，前期先将采集的健康人和肾结石患者粪便样本进行高通量16s扩增子测序，对健康人与肾结石患者粪便样本的细菌类别及丰度进行比较及差异分析，找出可能影响肾结石形成的关键细菌类别。然后使用knmodo（knownmediadatabase）网站，根据关建细菌的16srdna的序列来预测培养该菌的培养基配方。再将这些培养基配方应用于人体粪便细菌的分离培养，经人为选择性挑选固体培养基上长出来的菌落纯化，获得此株对肾结石有抑制效果的植物乳杆菌j-15。此法有别于传统微生物分离培养，做到了有依据的预测目标微生物的培养基配方，将基于16srdna的微生物多样性数据与目标菌株的分离培养有机衔接起来，大大加速从生态研究到微生物资源挖掘的进程。该法可将基于16srdna的微生物多样性数据与目标菌株的分离培养有机衔接起来，大大加速从生态研究到微生物资源挖掘的进程，本发明在前期通过高通量测序初步锁定可能与肾结石形成有关的微生物类别，然后根据相关类别细菌的16srdna的序列来预测培养该菌的培养基配方，可更加高效、明确地对相应菌株进行分离，大大提高分得该类菌的概率。

2、本发明提供的植物乳杆菌l.plantarumj-15，分离筛选自健康人粪便样本，属于人源植物乳杆菌，且未经基因改造，来自于将要应用的原生微生态环境，安全可靠更易适应人体环境。因为该菌株本身就来源于人体内，且宿主是一健康人，故本身具有较高的安全性，后期应用于临床肾结石患者的辅助治疗也不易发生排异情况及其他不良反应，且对人体肠道有更好的适应性，更容易定植。而其他来源的菌株，首先安全性需要进一步评估，且仅动物实验可能都不太够，动物和人多少有一定的差异，故即便动物实验未发现危害性，也不能完全保证应用于人体没有危险，故具有更多的风险。

3、目前尚未见对肾结石形成有抑制效果植物乳杆菌的全基因组测序报道。l.plantarumj-15经过上述步骤从粪便中分离获得，序列经全基因组测序获得。该菌株后续可通过喷雾干燥、包埋技术制作成乳酸菌菌剂或胶囊等不同形式，给患者施用，应用于临床上草酸钙肾结石的辅助治疗。

与现有技术相比，本发明的优点和益处在于：

1、本发明提供的植物乳杆菌l.plantarumj-15在mrs琼脂培养基上生长良好，对酸和胆盐有一定的耐受能力，对抗生素有一定耐受能力。在恶劣环境中具有较好的存活能力，易于在肠道中定植。

2、本发明提供的植物乳杆菌l.plantarumj-15，与其他两株y104和y96两个其他种的乳酸菌相比，来源于不同的样本，虽然均是从人粪便中分离得到，但基因序列不同。通过与其他两株比较，能够为我们在前期实验时挑选出降解草酸能力更强的菌株来应用于后面的动物实验，增大我们发现体内有抑制肾结石形成效果菌株的可能性。分离自人粪便的乳酸菌一同进行体外草酸盐降解试验中，表现出更强的草酸盐降解能力，在无除草酸钠以外其它碳源的培养基中，其体外草酸钠降解率达3.51%，具有较强的应用潜力，即其体外的草酸降解能力表明了其应用在后面动物试验中的更大可能性和成功率。如前所述，体外试验的草酸盐降解率并不能直接指示其对肾结石的抑制效果，已经表明了其降解草酸盐的能力。

3、本发明提供的植物乳杆菌l.plantarumj-15，动物试验表明该菌株能够减少大鼠肾结晶的形成，降低肾草酸钙结石模型大鼠尿草酸水平，以及尿液中ca的含量。因此，具有极大的开发潜能，对人体健康具有十分重要的意义。

4、本发明提供的植物乳杆菌l.plantarumj-15不仅在体外能够降解一定量的草酸盐，在大鼠体内也能有效减少肾结晶的形成。因此，不仅可应用于功能性食品领域，在临床辅助治疗上也具有实际应用价值。根据he染色和切片结果，（确实观察到了，参见图2），灌胃了j-15的大鼠体内肾结晶明显减少，而且检测结果显示大鼠尿液中ca含量降低。由于草酸盐可与ca结合形成草酸钙，累积可导致草酸钙型肾结石，而当体内可与ca形成草酸钙的游离草酸盐减少后，随尿液排出的ca离子就会增多，该结果从另一方面证实了j-15抑制肾草酸钙结石形成的效果。

5、本发明提供的植物乳杆菌l.plantarumj-15经全基因组测序表明其具有较好的碳水化合物代谢、膜转运及对环境的适应能力，除体外及体内实验外，还从基因水平揭示了植物乳杆菌l.plantarumj-15独特的遗传特征及潜在生物学功能。通过全基因组测序，可以获知菌株的基因及相关调控信息，为研究该菌株特有的生物学特征提供分子生物学基础；后续通过比较基因组分析，还可以为研究菌株种内及种间的功能差异、进化关系提供理论指导。不同的菌株具有不同的基因，不同的基因会导致其表现出不同的功能，当菌株表现出某种较好的功能时，可通过反向关注其基因来探寻原因。从j-15的全基因组测序结果可以看出，其具有较好的碳水化合物代谢、膜转运及对环境的适应能力，这是其能够在寡营养培养基中存活且利用草酸盐的原因，也是其能通过强酸高胆盐的体内环境，并顺利定植在肠道的原因。

附图说明

图1为本发明植物乳杆菌j-15在mrs琼脂培养基上的菌落形态图。

图2为本发明实施例5中各组大鼠肾脏经he染色在光学显微镜下的形态图（×5），其中ck为对照组，m为模型组，a为处理组）。

图3为本发明实施例3中检测草酸盐浓度的离子色谱图。

图4为本发明实施例6中的cgview基因组圈图。

图5为本发明实施例6中的go分类统计柱状图。

图6为本发明实施例6中的cog分类统计柱状图。

图7为本发明实施例6中的kegg分类统计柱状图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。但本发明的保护范围不限于下述的实施例，凡在本发明原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，培养基中所涉及的百分比，均为质量体积比。

实施例1

植物乳杆菌j-15的分离、筛选及分子生物学鉴定

1.材料准备

人粪便样品由四川省成都市一健康人提供；

通用引物对由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，27f/1492r序列如下：

27f：agagtttgatcmtggctcag

1492r：tacggytaccttgttacgactt

mrs液体培养基：葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉6.0g，吐温801.0ml，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，纯水1l，ph6.2±0.2（加1.6%-1.8%琼脂为固体培养基）。

2.具体方式

符合条件的健康人粪便样品。样品称取1.0g，于装有9ml无菌水的离心管中快速充分搅拌，使样品完全分散。吸取悬液，10倍梯度稀释分别涂布于mrs固体培养基上，置于兼性厌氧培养箱中37℃培养48h，肉眼观察挑取不同形态和大小的单菌落，平板划线纯化3次。采用天根细菌基因组dna提取试剂盒提取菌株dna，细菌通用引物27f/1492r扩增16srrna，将测得的16srrna序列进行ncbiblast比对，与ezbiocloud中的lactiplantibacillusplantarum标准菌株atcc14917相似率达100%，初步鉴定该菌株为一株lactiplantibacillusplantarum，即植物乳杆菌。将纯化好的菌株保存于终浓度为30%（v/v）的甘油中，-80℃冷冻保存备用。

将所述植物乳杆菌j-15划线于mrs琼脂培养基上，37℃兼性厌氧环境中倒置培养48h后，对菌株的菌落形态进行观察，如图1所示，菌落呈乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明，触媒阴性。

实施例2

植物乳杆菌j-15主要生理特征的检测

pbs缓冲液：磷酸二氢钾0.20g，磷酸氢二钠1.15g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，加入800ml纯水搅拌溶解，浓盐酸调至相应ph值，定容至1l。

1、耐酸试验：将活化三代的菌株l.plantarumj-15以1%的接种量分别接种至ph为4.0、3.0、2.0的pbs缓冲液中，37℃静置培养3h，梯度稀释平板法测定乳酸菌活菌数。

2、耐胆盐试验：将活化三代的乳酸菌以1%的接种量分别接种至含0.1%、0.2%、0.3%的牛胆盐的mrs液体培养基中，37℃静置培养5h，梯度稀释平板法测定乳酸菌活菌数。

耐酸和耐胆盐结果见表1。从表1可知，植物乳杆菌j-15对酸和胆盐有一定的耐受性，可在ph4.0和0.1%胆盐浓度下存活，存活率分别为53.60%，3.5%，随ph值的下降和胆盐浓度的增加，活菌数逐渐减少，在ph2.0和0.3%胆盐浓度下存活率为11.40%和0.14%。

乳酸菌在人体内发挥益生作用的前提是其可在人体肠道中存活并定殖，而乳酸菌能否在人体内存活定殖主要与其耐酸耐胆盐能力有关，将决定其能否耐受胃的高酸度和十二指肠的高胆盐浓度，因此耐酸耐胆盐能力是筛选益生性乳酸菌的一个重要指标。

实施例3

为探明j-15的草酸盐降解特性，对j-15在体外对草酸钠的降解能力进行了测试。将另两株从人粪便中分离出的乳酸菌y96和y104一同进行测试对比。

草酸盐降解试验：将j-15接种于含10mmol/l草酸钠浓度的自行改良设计的tm液体培养基中，在37℃下培养9天，并用离子色谱仪（ic）检测第0天和第9天时培养基中草酸盐离子浓度，计算草酸盐的分解利用率，草酸盐浓度的离子色谱图如图3所示。

tm液体培养基：磷酸氢二钾2.0g，磷酸二氢钠2.0g，硫酸铵2.0g，氯化镁0.58g，硫酸锰0.25g，纯水1l

降解率（%）＝（1-a1/a0）×100%

式中：a0为接种乳酸菌后的初始草酸钠浓度；a1为培养9天后的草酸钠浓度

植物乳杆菌j-15在无除草酸钠以外其他碳源的培养基中对草酸盐的降解率为3.51%，优于其他两株乳酸菌，通过比较（参见表2），植物乳杆菌j-15为三株所试验菌株中草酸盐降解效果最佳，说明j-15可以在无其他碳源的条件下利用草酸盐进行自身生长代谢，具有较强的草酸降解能力。

实施例4

耐药性实验的目的为了对j-15这一潜在的益生菌菌株的体外安全性进行评估，对该菌株的抗生素敏感性进行了测定。

试验采用滤纸片法研究植物乳杆菌j-15对四环素、氨苄西林、磺胺甲基异恶唑、利福平、红霉素、萘啶酮酸、氯霉素等7种抗生素的的耐受性，将活化后的j-15充分混匀后取100μl菌液于mrs固体培养基上，用涂抹棒涂匀晾干，用镊子将药敏片贴于涂抹菌液后的mrs固体培养基，置于37℃恒温培养箱培养24h，测量抑菌圈直径，试验重复三次，取三次平均值作为最终结果。结果判定按照美国临床和试验室标准协会(clinicalandlaboratorystandardsinstitute,clsi)标准。植物乳杆菌j-15的抗生素敏感性试验结果如表3所示。

试验结果表明j-15对氨苄西林和萘啶酮酸有一定的耐药性，对四环素、利福平中度敏感，对磺胺甲基异恶唑、红霉素、氯霉素敏感。

实施例5动物模型试验

1.实验动物及分组

6-7周龄spf级雄性spraguedawley（sd）大鼠40只，体重210-230g。所有大鼠基础饲料适应性喂养7d，sd大鼠及基础饲料均购于成都达硕生物科技有限公司。随机分为3个组（参见表4）：对照组（ck）、模型组（m）、处理组（a），每组6只大鼠，按不同方式（分组及饲喂方式见表3）灌胃28天，0.5ml/只/天。实验结束后用戊巴比妥进行腹腔注射法麻醉，麻醉给药量为30mg戊巴比妥/kg大鼠。对腹主动脉取血，解剖取双肾、盲肠内容物、尿液等。

2.实验内容

（1）肾脏切片制作与观察

解剖大鼠时，肉眼观察各组大鼠肾脏外观并拍照；将肾脏用无菌pbs清洗后置于4%多聚甲醛溶液中固定，经脱水，石蜡包埋、切片后he染色，普通光学显微镜观察结果，根据快速草酸钙动物模型五级分类法，按晶体有无、数量、聚合度和部位而分为（+++）、（++）、（+）、（±）、（－），其中（－）级为成石阴性，（±）、（+）、（++）、（+++）级为成石阳性，统计结果见表5。

图2是显微镜下放大5倍观察到的部分肾组织结晶截图，观察发现除对照组外，其它组大鼠肾脏均有不同程度的结石形成，可见肾小管显著扩张，髓质、皮质或乳头均有不同程度的晶体沉积。比较结石模型组和实验组（处理组）的肾髓质结石情况，结石组（模型组）的肾髓质内布满大量的结晶，实验组a结晶较少。

3）尿液指标的检测

尿液具体检测指标见下：ca，mg，k，p，na，肌酐，尿酸，草酸，枸橼酸。

由表6结果可以看出ck组尿草酸含量最低，m组与ck组存在显著性差异，p<0.05，a组尿草酸含量相较m组大幅降低，与a组接近，说明植物乳杆菌j-15降尿草酸的效果较好。大鼠尿液检测结果显示k，na，p，mg，肌酐，尿酸,枸橼酸组间无显著性差异，而尿ca组间呈极显著性差异，p<0.01，ck组与a组差值极大，存在显著性差异，可见j-15极大地降低了尿液中ca的含量。是由于植物乳杆菌j-15在体内降解了部分草酸盐，导致可与ca形成草酸钙的游离草酸盐减少，故ca离子随尿液大量排出。

以上实验结果表明，本发明提供的植物乳杆菌j-15能有效降低肾草酸钙结石大鼠的肾结晶的形成，缓解肾脏组织病变，有发展成为益生菌功能食品以及应用于临床辅助治疗的潜力。

实施例6全基因组测序

1.基因组组成

本发明采用目前使用最广泛的二代测序平台illuminahiseq×10平台，对j-15质检合格的dna样品构建插入片段为约400bp的片段，进行pe150（pair-end）测序，单端测序读长150bp，输出不低于基因组100×覆盖深度的原始测序数据，并对所测序列进行质控及组装，最终组装得到69条基因组scaffold，总碱基长3310895bp，基因组中所有碱基的平均gc含量为44.36%。然后，对组装序列进行基因预测，获知j-15编码基因数为3243，总长为2741751bp，基因占基因组的82.81%，基因组圈图见图4。

2.基因组注释

通过与cog，go和kegg等几大数据库进行比对对预测得到的编码基因进行功能注释，发现其中有go注释的基因为2380个，占所有基因的72.47%，其中与细胞组成（cellularcomponent）相关的基因数量为1192，与分子功能（molecularfunction）相关的基因数量为1889，与生物过程（biologicalprocess）相关的基因数量为1668，其中涉及膜整体组成（integralcomponentofmembrance）的基因最多，go注释分类统计详见图5。

cog注释发现j-15中共有2589个基因具有cog功能分类，占总基因数的78.84%，分为4个大类，20个不同类型，其中，未知功能的基因占比最多，已知功能的基因里面，涉及碳水化合物转运和代谢（carbohydratetransportandmetabolism）的基因最多，其次是转录（transcription）和氨基酸的运输和代谢（aminoacidtransportandmetabolism），cog分类统计详见图6。

kegg注释到的基因数为1489，以参与代谢（metabolis）的基因为主，其中参与碳水化合物代谢（carbohydratemetabolism）的基因最多，有225个，其次为参与膜运输（membranetransport）的基因，178个，keggpathway分类统计详见图7，以上结果说明j-15具有较强的碳水化合物利用能力以及膜转运能力。

3.代谢系统分析

对代谢系统分析发现，碳水化合活性酶注释到5个不同大类（详见表7，其中糖苷水解酶（glycosidehydrolases）基因所占的相对比例最大，48个基因参与，约占44.44%。

对j-15的次级代谢产物合成基因簇进行预测得到2个基因簇，分别位于scaffold2和scaffold42（详见表8），其中25个基因参与了萜烯类化合物的合成，2个基因参与了细菌素的合成。细菌素是细菌在核糖体中合成、在细胞外释放，用来杀死或抑制原核生物生长的一种小分子量生物活性抗菌肽，可以帮助j-15在肠道中形成菌群优势。

以上结果对于后续深入开展cazyme研究，揭示j-15碳水化合物的代谢机制，了解j-15基因组上天然产物合成基因簇具有非常重要的意义。

4.双组分调控系统

双组分调控系统能够使细菌能够感知、响应和适应广泛的环境、压力源和生长条件，典型的双组分调节系统主要由感受蛋白和调节蛋白组成，使用hmmer3对j-15的双组分调控系统进行预测，分析发现，j-15中存在30个注释到调节蛋白的基因，注释到反应调节（response_reg）蛋白的最多，有14个基因，均为反应调节蛋白接收域（responseregulatorreceiverdomain），分属5个不同结构域；存在12个注释到感受蛋白的基因，注释到组氨酸蛋白激酶（hatpase_c-histidinekinase-,dnagyraseb-,andhsp90-likeatpase）结构域的最多，有9个基因，分属4个不同结构域。综上可见，j-15多样的双组分系统有助于其调控多种生理生化过程，来适应外界环境的变化，可能有助于提升其对胃液及肠道低ph、高胆盐浓度环境的耐受能力以及对肠道的黏附能力。

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<110>四川大学

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