一种油脂酵母及其培养方法

1.本发明涉及一种油脂酵母及其培养方法，属于微生物及微生物发酵领域。


背景技术：

2.微生物油脂是酵母、藻类、霉菌和细菌等产油微生物储存在细胞内的油脂。微生物油脂的生产不受环境、土地的限制，生产周期短，可作为食用油脂和化石能源的优良替代品。在过去几十年的发展中，机械的现代化发展伴随着能源的大量消耗，不可再生资源例如石油、煤炭、天然气被大量开发和应用，能源危机越来越严重。因此科学家们在20世纪70年代第一次提出了用可再生的微生物油脂解决食用油匮乏和化石能源不足的问题。
3.目前对微生物油脂在食用油脂方面的开发应用主要集中在利用微生物来生产高附加值的功能性油脂，例如采用寇氏隐甲藻(crypthecodiniumcohnii)、裂壶藻(schizochytrium sp.)和吾肯氏壶藻(ulkenia sp.)菌生产dha。
4.但是，对采用酵母菌进行功能性油脂的生产还较少，红色的酵母菌可以天然积累类胡萝卜素，因此菌体呈红色，类胡萝卜素是脂溶性色素，存在于油脂中，使油脂呈现红色，该油脂具有较高的抗氧化性，含量远高于产见的食用油脂，应用前景广阔。锁掷酵母油脂中类胡萝卜素含量300
‑
500mg/kg油，parry等报道的南瓜籽油中类胡萝卜素含量约为5481μg/l，波森莓籽油中类胡萝卜素的含量为2405μg/kg，覆盆子籽油中类胡萝卜素的含量为82μg/kg，蓝莓籽油中类胡萝卜素的含量为1352μg/kg，蔓越莓籽油中类胡萝卜素的含量为443μg/kg，cabrini等报道的玉米油1200μg/l，花生油130μg/l，大豆油280μg/l。这些数据表明相对于天然产物油脂，酵母油脂可以提供更丰富的类胡萝卜素。
5.同时，锁掷酵母具有营养要求简单粗放，发酵周期短，生殖方式简单，营养条件要求低，可高密度培养的优点，其工业化应用前景十分广阔。但是，目前的油脂酵母的产量都较低，无法很好适应工业化生产的需求。


技术实现要素：

6.针对目前存在的问题，本发明从食醋样品中筛选到了一株具备良好产油脂性能的锁掷酵母，显著提升了微生物发酵生产油脂的产量
7.本发明里提供了一株锁掷酵母(sporidioboluspararoseus)，已于2021年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2021729。
8.本发明提供了含有所述锁掷酵母的微生物制剂。
9.在一种实施方式中，所述微生物菌剂中，锁掷酵母的含量不低于1.0
×
107cfu/ml或1.0
×
107cfu/g。
10.本发明提供了一种生产油脂的方法，利用所述锁掷酵母，或所述微生物制剂发酵生产油脂。
11.在一种实施方式中，将培养至对数期的锁掷酵母按体积比5～15％的量接种至发酵体系中。
12.在一种实施方式中，将培养至od
600
为0.4的锁掷酵母按体积比10％的量接种至发酵体系中。
13.在一种实施方式中，发酵体系中含有35～45g/l葡萄糖，15～25g/l玉米浆，0.5～1g/l mgso4·
7h2o，3～5g/l kh2po4，3～5g/l k2hpo4，ph5.5～6.5。
14.在一种实施方式中，发酵体系中含有40g/l葡萄糖，20g/l玉米浆，0.5～1g/l mgso4·
7h2o，4g/l kh2po4，4g/l k2hpo4，ph6.0。
15.在一种实施方式中，在25～30℃下反应24～48h。
16.在一种实施方式中，在28℃下反应48h。
17.本发明提供了一种提升油脂产量的方法，所述方法是利用所述锁掷酵母，或所述微生物制剂发酵生产油脂。
18.在一种实施方式中，将培养至对数期的锁掷酵母菌液，按体积比5～15％的量接种至发酵体系中，在在25～30℃下反应不低于24h。
19.在一种实施方式中，将培养至od
600
为0.4的菌液，按体积比10％的量接种至发酵体系中，在在28℃下反应不低于48h。
20.本发明提供了一种生产油脂的方法，所述方法是以所述方法是利用所述锁掷酵母，或所述微生物制剂发酵生产油脂。
21.在一种实施方式中，将培养至od
600
为0.4的锁掷酵母菌液，体积比5～15％的量接种至发酵体系中，在在25～30℃下反应不低于60h。
22.在一种实施方式中，反应体系中含有35～45g/l葡萄糖，15～25g/l玉米浆，0.5～1g/l mgso4·
7h2o，3～5g/l kh2po4，3～5g/l k2hpo4，ph 5.5～6.5。
23.在一种实施方式中，发酵体系中含有40g/l葡萄糖，20g/l玉米浆，0.5～1g/l mgso4·
7h2o，4g/l kh2po4，4g/l k2hpo4，ph6.0。
24.在一种实施方式中，在发酵18
‑
56h期间，补加葡萄糖，控制发酵体系中残糖量20g/l。
25.在一种实施方式中，补加葡萄糖浓度为800g/l。
26.本发明提供了所述锁掷酵母在生产油脂中的应用。
27.本发明的有益效果：本发明的锁掷酵母菌株zqhl生产高油脂酵母产率高，葡萄糖转化率高，在发酵罐高密度条件下培养48h，油脂产量可达40.2g/l，油脂含量占菌体干重的50％
‑
65％，本发明的菌株培养条件粗放，营养要求低，产率高，便于工业化生产。
28.生物材料保藏
29.本发明所提供的锁掷酵母，分类命名为近粉红锁掷孢酵母zqhl sporidioboluspararoseus zqhl，已于2021年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2021729，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
附图说明
30.图1为锁掷酵母形态图。
具体实施方式
31.实施例中所使用的培养基：
32.(1)斜面活化培养基(g/l)：葡萄糖20，蛋白胨1，酵母膏1，ph6.0。
33.(2)液体种子培养基(g/l)：葡萄糖40，玉米浆20，kh2po41，mgso4·
7h2o 0.5，ph6.0。
34.(3)高产油脂发酵培养基(g/l)：初始葡萄糖40，(nh4)2so
4 40，玉米浆20，mgso4·
7h2o 6，kh2po
4 4，k2hpo44，ph6.0。
35.实施例1：高油脂酵母的获得
36.(1)菌株的获得
37.将传统发酵的食醋样品，进行梯度稀释，分别稀释100、500、1000倍，将稀释液涂布于活化培养基平板，在30℃下培养至长出单菌落，根据长出菌落的形态及色泽(橙红色)进行筛选，选择色泽红亮、形态饱满的菌落；将一次筛选到的菌株转接至活化培养基中，在28℃下培养至长出单菌落，最终选定5株红色单菌落，按同样质量接种至液体种子培养基，28℃摇床培养64h，通过gb t 5528
‑
2008方法检测发酵末期液体培养基中的油脂含量，5株菌株在液体种子培养基中的油脂产量分别为16.45，19.02，27.57，29.74，30.96g/l，选择油脂含量为30.96g/l的一株菌作为高油脂酵母菌。
38.(2)菌株的鉴定
39.观察菌落的形态：卵圆、椭圆酵母形状(如图1所示)；
40.将菌株接入高产油脂发酵培养基中进行培养，28℃下培养时间64
‑
72h，获得菌液，利用引物its1和its4对菌液进行扩增，将扩增产物进行its测序，将测序结果在ncbi上进行blast，同源性鉴定，最终鉴定为锁掷酵母，并将其送至中国典型微生物保藏中心进行保藏。
41.its1：tccgtaggtgaacctgcgg，seq id no.1；
42.its4：tcctccgcttattgatatgc，seq id no.2。
43.实施例2：利用锁掷酵母zqhl发酵生产油脂
44.将筛选得到的锁掷酵母接种至高产油脂酵母发酵培养基(500ml反应体系)，在28℃培养48h，挑取单菌落至液体种子培养基中，28℃震荡(100r/min，往复式摇床，振幅8cm)培养16h，将对数生长期的种子液菌液(od
600
约为0.4)以10％(v/v)的量接种至发酵培养基(即液体种子培养基)，在28℃培养48h，发酵结束后，离心、提取发酵液，菌体干重65g/l，利用国标gb t 5528
‑
2008方法检测发酵液中的油脂含量，结果显示油脂含量为31.6g/l，油脂含量占菌体干重的48.6％。
45.实施例3：锁掷酵母zqhl在生产油脂中的应用
46.发酵培养方法：
47.(1)斜面活化培养：将菌株从保藏斜面接到活化斜面培养基上，28℃培养48h。
48.液体种子培养：接到种子培养基中，28℃震荡(100r/min，往复式摇床，振幅8cm)培养16h，至od
600
约为0.4(对数期)。
49.(2)液体发酵培养：接种量10％(v/v)，50l发酵罐，装液量35l(高产油脂酵母发酵培养基)，28℃培养64h。在发酵至第18h时开始补加葡萄糖，葡萄糖浓度为800g/l，发酵18
‑
56h根据残糖量补糖，控制残糖在20g/l。
50.表1发酵中的各参数
[0051][0052]
注：发酵过程中将溶氧控制在20％。
[0053]
(3)发酵液中产物的鉴定及定量
[0054]
①
将步骤2中发酵液离心，喷雾干燥即得高油脂菌体粉末。
[0055]
该发酵条件下菌体产量为73g/l，油脂含量为55％，油脂产量40.2g/l。
[0056]
②
将富含油脂的锁掷酵母发酵液离心获得菌体，加入一倍质量的酒精，超微粉碎研磨，用正己烷提取，收集有机溶剂层，真空去除正己烷，得到锁掷酵母油脂，其中油酸占脂肪酸组成的80％以上，类胡萝卜素含量约为600mg/kg油脂，并且该油脂中还含有其他有益的萜类成分。
[0057]
表2锁掷酵母油脂中主要功能成分
[0058][0059]
锁掷酵母油脂中的9种主要营养成分分别为角鲨烯、β
‑
胡萝卜素、γ
‑
胡萝卜素、麦角固醇酯、红酵母烯、甘油三酯、游离脂肪酸、麦角固醇和红酵母红素。油脂中麦角固醇总含量为3.85g/kg油。角鲨烯的浓度为1.34g/kg油。类胡萝卜素浓度约600mg/kg油脂。锁掷酵母油脂的脂肪酸组成主要为油酸。锁掷酵母油脂不仅是一种高油酸油脂而且还含有丰富的脂溶性营养成分，所以它可以作为功能性油脂应用。
[0060]
实施例4：锁掷酵母的微生物菌剂的制备
[0061]
取200～600μl的锁掷酵母接种于10～30ml ypd液体培养基中，28℃下活化2至3代，待锁掷酵母达到1.0
×
108cfu/ml以上活菌数时，5000～10000rpm下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液(生理盐水)和冷冻保护剂(15～20g/100ml的蔗糖溶液)，待细胞浓度不低于107cfu/ml时，真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。
[0062]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。