一种生物发酵法生产高纯度阿洛酮糖晶体的方法与流程

1.本发明涉及食品原料加工技术领域，更具体的说是涉及一种生物发酵法生产高纯度阿洛酮糖晶体的方法。


背景技术：

2.近年来，在全世界范围内由于体重过度增长导致的慢性疾病的患病率与盛行率急剧增长，包括肥胖症、糖尿病、高血压和高血脂等。而造成发病率急剧增长的主要原因是过度的摄入高糖和高脂肪类的食物。阿洛酮糖是一种低热量的天然存在的单糖，其甜度为蔗糖的70％，但卡路里仅为蔗糖的10％。具有与蔗糖相近的口感及容积特性，同样可与食物中的氨基酸或蛋白质发生美拉德反应。阿洛酮糖拥有无数的健康益处：它被小肠完全吸收但不会代谢，而是分泌在尿液和粪便中，因此糖尿病人可食用；它通过抑制α-淀粉酶、蔗糖酶和麦芽糖酶来帮助调节血糖；以及它在食品和饮料中具有与蔗糖类似的功能。因此，阿洛酮糖在食品和饮料工业中明显具有多种应用。
3.阿洛酮糖属于己酮糖，是一种六碳糖，是d-果糖的c-3差向异构体。合成方法有化学合成法和生物酶法合成。化学合成法生产阿洛酮糖具有许多缺点：易形成化学废弃物和副产物；纯化过程困难；操作复杂，需要多次保护和去保护操作。因此，在实际生产应用中受到了极大的制约。相比而言，酶法合成阿洛酮糖具有较大的优势：过程更加环保；反应条件温和；特异性强；催化效率高；可持续性强。因此，阿洛酮糖的生物转化成为当前研究的重点和热点。目前，生产阿洛酮糖晶体采用了多次反复加热、冷却的工艺制备方法，生产工艺复杂，不易操作，且生成的晶体颗粒度小，收率低。
4.因此，提供一种生物发酵法生产高纯度阿洛酮糖晶体的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种生物发酵法生产高纯度d-阿洛酮糖晶体的方法，边发酵边转化d-阿洛酮糖，省略了d-阿洛酮糖3-差向异构酶分离和均质过程，且在发酵异构过程中芽孢杆菌细胞破碎释放出d-阿洛酮糖3-差向异构酶可增加转化率，不仅大大简化了制备工艺，而且提高了d-阿洛酮糖的转化率。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.一种生物发酵法生产高纯度d-阿洛酮糖晶体的方法，具体步骤如下：
8.(1)将枯草芽孢杆菌依次接种于一级种子培养基和二级种子培养基中，进行菌种富集，获得od
600
值为2-5的种子液；
9.(2)将步骤(1)获得的种子液接种于灭菌处理的发酵罐营养液中进行发酵，发酵温度为50℃-60℃，时间为36h-48h，获得发酵液；所述种子液的接种量为所述发酵罐营养液质量的0.5％-1％；
10.(3)将步骤(2)获得的发酵液进行灭菌，75℃-80℃灭菌25-30min；
11.(4)向步骤(3)灭菌后的发酵液中加入发酵液体积0.15％-0.2％(质量体积比g/l)的活性炭，75℃-80℃脱色20-30min；脱色结束后进行插板过滤器过滤，孔径为325目；
12.(5)将步骤(4)插板过滤器过滤后的糖液经200nm膜过滤，获得d-阿洛酮糖粗糖液；
13.(6)将步骤(5)获得的d-阿洛酮糖粗糖液先经过阳离子树脂，再经过阴离子树脂，去除阴阳离子；阳离子树脂型号为d001fd，阴离子树脂型号为d354fd；
14.(7)将步骤(6)去除阴阳离子的粗糖液进行色谱分离，获得d-阿洛酮糖清液；所述色谱分离分离过程中控制糖液浓度20％-35％，温度45℃-55℃，压力0.2mpa-0.3mpa，水料质量比为1：2.0-2.5，进料速度为2m3/h，出料电导率在20μs/cm-100μs/cm；
15.(8)将步骤(7)获得的d-阿洛酮糖清液浓缩至固形物质含量为70％-80％，采用真空蒸发连续结晶，真空度为-0.03mpa～-0.09mpa；
16.(9)干燥，包装，获得成品。
17.进一步，步骤(1)所述一级种子培养基和二级种子培养基的组成成分均为：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l。
18.进一步，步骤(2)所述发酵罐营养液的组成成分为：果糖450g/l-650g/l、磷酸二氢钾3g/l、磷酸氢二钾10g/l、磷酸氢二钠3g/l、柠檬酸1.7g/l、氯化铵4g/l、酵母粉5g/l、mgso40.2g/l-1g/l。
19.进一步，步骤(9)所述干燥为采用低温流化床干燥，温度45℃-55℃，干燥至水分≤0.2％。
20.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种生物发酵法生产高纯度d-阿洛酮糖晶体的方法，具有以下有益效果：
21.(1)本发明直接向果糖液中加入菌种和培养基，实现了边发酵边转化d-阿洛酮糖的目的；并采用可控的连续蒸发结晶，获得高纯度d-阿洛酮糖晶体，一次结晶收率达到68％-72％；
22.(2)省略了d-阿洛酮糖3-差向异构酶分离和均质过程，且在发酵异构过程中芽孢杆菌细胞破碎释放出d-阿洛酮糖3-差向异构酶可增加转化率；
23.(3)本发明采用真空蒸发连续结晶，保证了d-阿洛酮糖晶体粒度均匀；
24.(4)本发明大大简化了制备工艺，又可以提高生产速率和成品质量。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
26.图1附图为本发明实施例1制备的d-阿洛酮糖晶体成品的液相色谱图；
27.图2附图为本发明实施例2制备的d-阿洛酮糖晶体成品的液相色谱图；
28.图3附图为本发明实施例3制备的d-阿洛酮糖晶体成品的液相色谱图。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完
整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.枯草芽孢杆菌为市售产品，通过购买获得。
31.实施例1
32.一种生物发酵法生产高纯度d-阿洛酮糖晶体的方法，具体步骤如下：
33.(1)将枯草芽孢杆菌依次接种于一级种子培养基和二级种子培养基中，进行菌种富集，获得od
600
值为2-5的种子液；一级种子培养基和二级种子培养基的组成成分均为：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l。
34.(2)将步骤(1)获得的种子液接种于灭菌处理的发酵罐营养液中进行发酵，发酵温度为55℃，时间为40h，获得发酵液；发酵罐营养液的组成成分为：果糖450g/l、磷酸二氢钾3g/l、磷酸氢二钾10g/l、磷酸氢二钠3g/l、柠檬酸1.7g/l、氯化铵4g/l、酵母粉5g/l、mgso40.5g/l。
35.(3)将步骤(2)获得的发酵液进行灭菌，80℃灭菌30min；
36.(4)向步骤(3)灭菌后的发酵液中加入发酵液体积0.2％的活性炭，75℃脱色20min；脱色结束后进行插板过滤器过滤，孔径为325目；
37.(5)将步骤(4)插板过滤器过滤后的糖液经200nm膜过滤，获得d-阿洛酮糖粗糖液；
38.(6)将步骤(5)获得的d-阿洛酮糖粗糖液先经过阳离子树脂，再经过阴离子树脂，去除阴阳离子；阳离子树脂型号为d001fd，阴离子树脂型号为d354fd；
39.(7)再将步骤(6)去除阴阳离子的粗糖液进行色谱分离，获得d-阿洛酮糖清液；色谱分离分离过程中控制糖液浓度20％-35％，温度45℃-55℃，压力0.2mpa-0.3mpa，水料质量比为1：2.2，进料速度为2m3/h，出料电导率35μs/cm；
40.(8)将步骤(7)获得的d-阿洛酮糖清液浓缩至固形物质含量为70％，采用真空蒸发连续结晶，真空度为-0.03mpa～-0.09mpa；
41.(9)采用低温流化床干燥，温度50℃，干燥至水分≤0.2％；包装，获得成品。晶体收率68％。
42.制备得到的d-阿洛酮糖晶体成品的液相色谱结果见图1和表1。液相采用面积归一法测得成品纯度为100％。
43.表1
[0044][0045]
实施例2
[0046]
一种生物发酵法生产高纯度d-阿洛酮糖晶体的方法，具体步骤如下：
[0047]
(1)将枯草芽孢杆菌依次接种于一级种子培养基和二级种子培养基中，进行菌种富集，获得od
600
值为2-5的种子液；一级种子培养基和二级种子培养基的组成成分均为：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l。
[0048]
(2)将骤(1)获得的种子液接种于灭菌处理的发酵罐营养液中进行发酵，发酵温度为50℃，时间为42.5h，获得发酵液；发酵罐营养液的组成成分为：果糖550g/l、磷酸二氢钾3g/l、磷酸氢二钾10g/l、磷酸氢二钠3g/l、柠檬酸1.7g/l、氯化铵4g/l、酵母粉5g/l、mgso40.3g/l。
[0049]
(3)将步骤(2)获得的发酵液进行灭菌，75℃灭菌25min；
[0050]
(4)向步骤(3)灭菌后的发酵液中加入发酵液体积0.2％的活性炭，80℃脱色25min；脱色结束后进行插板过滤器过滤，孔径为325目；
[0051]
(5)将步骤(4)插板过滤器过滤后的糖液经200nm膜过滤，获得d-阿洛酮糖粗糖液；
[0052]
(6)将步骤(5)获得的d-阿洛酮糖粗糖液先经过阳离子树脂，再经过阴离子树脂，去除阴阳离子；阳离子树脂型号为d001fd，阴离子树脂型号为d354fd；
[0053]
(7)再将步骤(6)去除阴阳离子的粗糖液进行色谱分离，获得d-阿洛酮糖清液；色谱分离分离过程中控制糖液浓度20％-35％，温度45℃-55℃，压力0.2mpa-0.3mpa，水料质量比为1：2.0，进料速度为2m3/h，出料电导率在25μs/cm；
[0054]
(8)将步骤(7)获得的d-阿洛酮糖清液浓缩至固形物质含量为75％，采用真空蒸发连续结晶，真空度为-0.03mpa～-0.09mpa；
[0055]
(9)采用低温流化床干燥，温度45℃，干燥至水分≤0.2％；包装，获得成品。晶体收率72％。
[0056]
制备得到的d-阿洛酮糖晶体成品的液相色谱结果见图2和表2。液相采用面积归一法测得成品纯度为100％。
[0057]
表2
[0058][0059]
实施例3
[0060]
一种生物发酵法生产高纯度d-阿洛酮糖晶体的方法，具体步骤如下：
[0061]
(1)将枯草芽孢杆菌依次接种于一级种子培养基和二级种子培养基中，进行菌种富集，获得od
600
值为2-5的种子液；一级种子培养基和二级种子培养基的组成成分均为：酵母粉5g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠10g/l。
[0062]
(2)将步骤(1)获得的种子液接种于灭菌处理的发酵罐营养液中进行发酵，发酵温度为60℃，时间为48h，获得发酵液；发酵罐营养液的组成成分为：果糖650g/l、磷酸二氢钾3g/l、磷酸氢二钾10g/l、磷酸氢二钠3g/l、柠檬酸1.7g/l、氯化铵4g/l、酵母粉5g/l、mgso40.8g/l。
[0063]
(3)将步骤(2)获得的发酵液进行灭菌，78℃灭菌25min；
[0064]
(4)向步骤(3)灭菌后的发酵液中加入发酵液体积0.15％的活性炭，75℃脱色30min；脱色结束后进行插板过滤器过滤，孔径为325目；
[0065]
(5)将步骤(4)插板过滤器过滤后的糖液经200nm膜过滤，获得d-阿洛酮糖粗糖液；
[0066]
(6)将步骤(5)获得的d-阿洛酮糖粗糖液先经过阳离子树脂，再经过阴离子树脂，
去除阴阳离子；阳离子树脂型号为d001fd，阴离子树脂型号为d354fd；
[0067]
(7)再将步骤(6)去除阴阳离子的粗糖液进行色谱分离，获得d-阿洛酮糖清液；色谱分离分离过程中控制糖液浓度20％-35％，温度45℃-55℃，压力0.2mpa-0.3mpa，水料质量比为1：2.5，进料速度为2m3/h，出料电导率在55μs/cm；
[0068]
(8)将步骤(7)获得的d-阿洛酮糖清液浓缩至固形物质含量为80％，采用真空蒸发连续结晶，真空度为-0.03mpa～-0.09mpa；
[0069]
(9)采用低温流化床干燥，温度55℃，干燥至水分≤0.2％；包装，获得成品。晶体收率69.2％。
[0070]
制备得到的d-阿洛酮糖晶体成品的液相色谱结果见图3和表3。液相采用面积归一法测得成品纯度为100％。
[0071]
表3
[0072][0073]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。