1.本发明涉及一种树突状细胞的制备方法，属于免疫细胞
技术领域：
：。
背景技术：
：：2.调节性树突状细胞(dcreg)是一群具有负向免疫调控功能的dc亚群。dcreg能够通过不同的机制诱导机体免疫耐受，在器官移植、自身免疫性疾病等不同领域发挥着重要的作用。3.患者做移植手术之后，可能会出现不同程度的排异反应，临床上可以使用免疫抑制剂来减轻排异反应，延长移植的功能，有的人排异反应比较强烈，严重的的排异反应可以导致移植失败，对患者身体也会造成很大损伤。基于强有力的临床前数据显示供体来源的调节性树突状细胞(dcreg)可促进啮齿动物的长期移植物存活，并抑制非人灵长类动物的同种异体移植物排斥反应，并平衡免疫反应。目前有进行人类供体来源的dcreg在活体移植中的安全性和疗效试验，基于dcreg细胞有应用于临床的趋势，因此本发明研究一种dcreg细胞的诱导制备方法，为临床应用做前期研究。4.中国发明专利cn105886471a公开了一种新型调节性树突状细胞的制备方法及联合dc‑cik进行肿瘤免疫治疗方法。经分离哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；在适合细胞生长和增殖的条件下，共同培养获得的哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；共同培养1至7天后，从悬浮培养液中回收、鉴定得到的新型调节性树突状细胞。所述新型调节性树突状细胞在cpgodn(cpg寡核苷酸)或具有同样诱导功能的诱导剂的诱导下转化为成熟调节性树突状细胞，其中irf4+及irf8+的表达水平增加，并且具有免疫调节功能。所述新型调节性树突状细胞能够抑制肿瘤生长，并能够联合dc‑cik进行肿瘤免疫治疗。该专利中关于调节性树突状细胞的制备方法中提及irf4+及irf8+的表达水平增加，并且具有免疫调节功能，irf4+是cdc2的标志物而irf8+是cdc1的标志物，没有文献中提及irf4+及irf8+是调节性树突状细胞的标志物。该专利中提及该新型调节性树突状细胞能够抑制肿瘤生长，可调节性树突状细胞是一种负向调控的细胞。技术实现要素：5.针对上述现有技术，本发明提供了一种树突状细胞的制备方法。6.本发明是通过以下技术方案实现的：7.一种树突状细胞的制备方法，包括以下步骤：8.(一)分离人体单个核细胞；9.(二)在适合细胞生长和增殖的条件下，诱导制备dcreg细胞，具体如下：10.(1)接种：步骤(一)所得人体单个核细胞，用基础培养基贴壁培养2小时，筛选出贴壁细胞，加入dc培养基；所述dc培养基，是由基础培养基、重组人gm‑csf和重组人il‑4组成的，其中，重组人gm‑csf的终浓度为500～1000iu/ml，重组人il‑4的终浓度为800～1000iu/ml；11.(2)培养第3天，补加dc培养基；12.(3)培养第5天，向培养物中加入5～12ug/ml的间充质干细胞外泌体，50～200ng/ml的vegf，5～12ng/ml的tgf‑β和300～800iu/ml的il‑10；13.(4)培养第7天，即得dcreg细胞，做表型和功能分析。14.进一步地，所述基础培养基，选自kbm581培养基。所述kbm581培养基为现有技术中已有的商品化培养基，其组分组成包括葡萄糖、生物素、泛酸、烟酰胺、肌醇、叶酸、白蛋白、b族维生素以及20多种氨基酸。15.进一步地，所述重组人gm‑csf的终浓度为800iu/ml。16.进一步地，所述重组人il‑4的终浓度为1000iu/ml。17.进一步地，所述间充质干细胞外泌体的浓度为10ug/ml。18.进一步地，所述vegf的浓度为100ng/ml。19.进一步地，所述tgf‑β的浓度为10ng/ml。20.进一步地，所述il‑10的浓度为600iu/ml。21.利用上述方法制备得到的dcreg细胞，可以用于活体移植，还可以应用于辅助生殖技术，在试管婴儿治疗胚胎着床前14‑28天，抽取母体的单个核细胞诱导dcreg细胞，并用父亲或第三方的pbmc细胞膜囊泡来刺激母体dcreg细胞，降低cd4+细胞、cd8+细胞增殖反应性，提高胚胎的着床率，改善胚胎种植环境。22.本发明的树突状细胞的制备方法，在il‑10、tgf‑β基础上加入血管内皮生长因子(vegf)及脐带间充质干细胞外泌体(现有技术中，有些文献中用维生素d3、il‑10、il‑35、tgf‑β来诱导dcreg细胞，il‑10、il‑35和tgf‑β都是免疫抑制细胞因子，诱导不同的treg细胞及其分泌因子，抑制th1细胞和th17细胞的活性)。血管内皮生长因子(vegf)属血小板源生长因子超家族，是其中最重要的成员，刺激内皮细胞增殖和存活，能诱导血管生成，提高毛细血管的通透性。血管系统的形成与肿瘤生长密切相关，肿瘤患者微环境中vegf含量高于正常健康人群，外源性的vegf影响dc细胞的成熟，促进dcreg的形成(该作用是本发明发现的)。外泌体是纳米尺寸(40～150nm)的细胞外囊泡，具有脂质双层膜，被多种细胞释放，是细胞间通讯系统的一部分，携带rna和蛋白质。脐带干细胞衍生的外泌体(外泌体在本发明中起到的作用是：发挥免疫调节功能，促进dcreg的形成，并间接促进treg细胞的增殖)修复再生组织、抑制炎症反应及调节机体免疫细胞恢复功能并调节炎症状态。23.利用本发明的方法诱导制备得到的树突状细胞(dcreg)，与成熟dc细胞相比，hla‑dr+、cd80+和cd83+的mfi值均变低，hla‑dr低表明排异反应变弱，cd83和t细胞共刺激分子cd80变低使诱导同种异体cd4+和cd8+t细胞反应变低。经csfe增殖反应实验发现：与未成熟dcreg细胞相比，利用本发明的方法诱导制备得到的树突状细胞(dcreg)与cfse标记的pbmc细胞混合后，cd4+细胞、cd8+细胞增殖变的更加缓慢，诱导后cd3+cd4+cd25hicd127lowfoxp3+的treg细胞的比例变高，因此可改善宿主耐受性，进而提高移植成功率。24.本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。附图说明25.图1：hla‑dr+细胞比例、cd14‑细胞比例、cd1a+细胞比例、cd80+细胞比例、cd83+细胞比例示意图，其中，a：hla‑dr+细胞比例；b：cd14‑细胞比例；c：cd1a+细胞比例；d：cd80+细胞比例；e：cd83+细胞比例。26.图2：dcreg细胞(实验组1所得)与成熟dc(实验组3所得)hla‑dr、cd80、cd83表面分子荧光的平均强度的比较示意图，其中，上排：dcreg细胞(实验组1所得)；下排：成熟dc(实验组3所得)。27.图3：未成熟dc(实验组2所得)、成熟dc(实验组3所得)与dcreg细胞(实验组1所得)cd80表面分子荧光的平均强度的比较示意图，dcreg细胞较成熟dc细胞cd80的mfi值低，较未成熟dc细胞cd80的mfi值高，意味着cd4+和cd8+t细胞低反应性。28.图4：未成熟dc(实验组2所得)、dcreg细胞(实验组1所得)、成熟dc(实验组3所得)与cfse标记的pbmc细胞混合前cd4+和cd8+t细胞所占比例示意图。29.图5：未成熟dc(实验组2所得)、dcreg细胞(实验组1所得)、成熟dc(实验组3所得)与cfse标记的pbmc细胞混合并共培养5天后cd4+和cd8+t细胞所占比例示意图。30.图6：未成熟dc(实验组2所得)、dcreg细胞(实验组1所得)、成熟dc(实验组3所得)与cfse标记pbmc细胞混合并共培养5天后cd4+细胞、cd8+细胞增殖比较示意图。31.图7：dcreg细胞(实验组1所得)诱导前后的cd3+cd4+cd25hi的t细胞比例示意图。具体实施方式32.下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。33.本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。34.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。35.实施例1树突状细胞的制备36.一、试剂及耗材37.(1)主要实验试剂38.试剂：kbm581培养基(corning公司)，谷氨酰胺(gibco公司)，人淋巴细胞分离液(ficoll，天津灏洋生物制品公司)。39.细胞因子：il‑4、gm‑csf、tgf‑β、vegf、il‑10、tnf‑α、il‑6、il‑1β和前列腺素e2(均购自peprotech公司)，人重组il‑2(三生制药)；40.抗体：hla‑dr抗体、cd14、cd1a、cd80和cd83抗体(均购自bd公司)，cfse增殖试剂盒(联科生物)。41.(2)主要实验相关耗材42.15ml离心管、50ml离心管、10ml移液管、25ml移液管、t‑25cm2、t‑75cm2细胞培养瓶(corning公司)、24孔板，96孔凹底培养板(corning公司)。43.二、实验过程44.(一)分离人体单个核细胞(pbmc)，具体如下：45.(1)无菌采集健康志愿者外周血约100ml左右于100ml抗凝剂的采血袋中；46.(2)分离血浆：840g，离心10min，室温，升速9，降速5(“升速9，降速5”是离心机的升降速率)；47.(3)血浆灭活：56℃恒温水浴灭活30min，再放入‑20℃冷沉10min，2000g，离心15min，4℃，升速9，降速9；48.(4)稀释：用0.9％生理盐水稀释去除血浆后血液到30ml，混匀；49.(5)铺样：血样以2:1比例缓慢匀速加入人淋巴细胞分离液上层，935g，20min，室温，升速1，降速1；50.(6)提取单个核细胞：离心后，离心管内出现明显的分层，吸取单个核细胞层(白膜层)；51.(7)第一遍洗涤：生理盐水与单个核细胞1:1混合，935g，7min，室温，升速9，降速9；52.(8)第二遍洗涤：生理盐水洗涤，336g，8min，室温，升速9，降速9。53.(二)在适合细胞生长和增殖的条件下，诱导制备dcreg细胞，具体如下：54.(1)接种：步骤(一)所得人体单个核细胞，用kbm581培养基以1*10^6/cm2的细胞密度接种于t25培养瓶，5％co2、37℃恒温培养箱孵育2h，将上层未贴壁细胞移出，加入dc培养基5ml；55.所述dc培养基，是由基础培养基、gm‑csf和il‑4组成的，其中，gm‑csf的终浓度为800iu/ml，il‑4的终浓度为1000iu/ml；56.(2)培养第3天，补加dc培养基5ml；57.(3)培养第5天，培养物分为三个实验组：58.实验组1：向培养物中加入10ug/ml(指终浓度，下同)的间充质干细胞外泌体{脐带间充质干细胞外泌体为本实验室培养的脐带间充质干细胞培养液通过连续差速离心过滤洗涤富集而来，具体如下：脐带间充质干细胞来源于捐献脐带组织制备的华通氏胶，用间充质干细胞培养基(该培养基，是现有技术中已有的常规培养基，本发明所用为购自bi公司的mscnutristemxfbasalmedium，货号05‑200‑1a)加10％血清替代品通过贴壁培养，在37℃，饱和湿度，5％的co2培养箱中传代培养到第3代，得到细胞培养上清液50ml，在4℃的环境下，300g×10min，2000g×20min弃沉淀，去除细胞；然后10000g×30min，弃沉淀，去除细胞碎片等，再用10000g×60min，弃掉上清液，最后所得沉淀即为外泌体，用50mlpbs溶液重新悬浮沉淀，混合后再以10000g×60min离心，用5mlpbs溶液悬浮沉淀物用bca法测定蛋白浓度，将提纯的外泌体分装于ep管中，并置于‑80℃冰箱内保存备用}，100ng/ml的vegf，10ng/ml的tgf‑β和600iu/ml的il‑10；59.实验组2：向培养物中加入10ng/ml的tgf‑β和终浓度为600iu/ml的il‑10；60.实验组3：向培养物中加入10ng/ml的tnf‑α，20ng/ml的il‑6，10ng/ml的il‑1β，和1.0um前列腺素e2，组成促炎细胞因子混合物，诱导培养的单核细胞衍生的dc细胞的成熟；61.(4)培养第7天，336g，8min，升速9，降速9离心去dc培养液，计数做表型和功能分析。62.(三)dcreg细胞表型和功能分析63.(1)dcreg细胞鉴定64.①将1mldcreg细胞悬液转移至1.5ml离心管中，4℃，300g离心5分钟，仔细吸取掉上清；65.②用适量pbs清洗细胞，4℃，300g离心5分钟，仔细吸取掉上清；66.③用预冷的pbs重悬细胞，调整细胞终浓度为1×107cells/ml，轻轻吹打混匀；67.④取100μl细胞悬液作为空白对照组，取100μl细胞悬液作为平行对照组，取200μl作为实验组加入apc‑hla‑dr、percp‑cy5.5‑cd14、pe‑cd1a、pe‑cy7‑cd80、fitc‑cd83抗体(均购自bd公司)，4℃孵育30‑40分钟；68.⑤加入适量pbs清洗细胞，4℃，300g离心5分钟，仔细吸取掉上清；69.⑥500μlpbs重悬细胞，上机检测。70.(2)流式细胞收集71.①提前开启sa3800全光谱流式细胞分析仪，进行预热及设备自检；72.②新建实验：选择“preparation”向导标签，进入实验预备界面，点击“experimenttemplate”按钮，选择“blanktemplate”，在name文本框输入命名信息，点击“createexperiment”，即可创建新的实验模板；73.③放入sample‑s样本管，点击“preview”，设置“fluorescencepmtvoltage”值，使intensity_h最高值在105附近，点击“stop”卸载sample‑s样本管；74.④放入unstained样本管，点击“preview”，设置其他参数，进行绝对计数时切勿使用fsc设置阈值！75.⑤收集各组细胞：放入待测样本管，点击“preview”，待flowcondition状态变为stable时，点击“acquire”进行收集。收集开始后同组实验必须采用相同参数，如有更改，则全部重新收集。76.(3)流式结果分析77.①添加所用marker及其对应荧光信号；78.②导入数据库中对应的荧光曲线，对于新的荧光信号应单独设立阳性对照管建立曲线；79.③选择unstained组，圈出主要细胞群，设定为a门，设fsc‑h/fsc‑a，显示a门内细胞，圈出单细胞群b；80.④设侧向角散射ssc‑a/hla‑dr，显示b门内细胞，设定c门：包括所有hla‑dr非阴性细胞；81.⑤设ssc‑a/cd14，显示c门内细胞，设定l门：包括所有cd14非阳性细胞；82.⑥设ssc‑a/cd1a，显示l门内细胞，设定o：包括所有cd1a非阴性细胞；83.⑦设ssc‑a/cd80，显示l门内细胞，设定n：包括所有cd80非阴性细胞；84.⑧设ssc‑a/cd83，显示l门内细胞，设定m：包括所有cd83非阴性细胞；85.⑨保存数据，清洗并关闭仪器。86.(4)cfse增殖反应87.①第八天，配制cfse工作液；88.②取pbmc细胞，使用pbs清洗一遍；89.③37℃的cfse工作液孵育15min，加入血清终止反应；90.④pbs离心洗涤两次，清洗掉表面黏附的cfse分子；91.⑤kbm581培养基重悬，将实验组1所得dcreg细胞、实验组2所得dcreg细胞、实验组3所得成熟dc(mdc)，分别与用cfse标记的pbmc细胞以1:10(dc:pbmc细胞)的比例在完全培养基(在基础培养基的基础上加入终浓度为500iu/ml的il‑2)中共培养5天；92.⑥流式细胞术分析t细胞状态。93.每组实验重复三次。94.三、实验结果95.如图1所示，mdc分析时去除样本中淋巴细胞和细胞碎片的影响后，hla‑dr+细胞比例为95.31％，其中cd14‑细胞比例为94.60％，对该群细胞进行进一步分析，cd1a+细胞比例为61.81％，cd80+细胞比例为98.36％，cd83+细胞比例为99.00％。我们所得到的成熟dc成熟度很高，辅助刺激因子cd80的比例也很高，能有效的将抗原提呈给t细胞。96.如图2所示，为dcreg细胞(实验组1所得)与成熟dc(实验组3所得)hla‑dr、cd80、cd83表面分子荧光的平均强度的比较：实验组1所得dcreg细胞较成熟dc细胞产生hla‑dr+、cd80+和cd83+的mfi值均变低,hla‑dr低表明排异反应变弱，cd83和t细胞共刺激分子cd80变低使诱导同种异体cd4+和cd8+t细胞反应变低(图中86％、94％表示流式图中所圈出的dcreg细胞与成熟dc占分析总细胞的比例)。97.如图3所示，为未成熟dc(实验组2所得)、成熟dc(实验组3所得)与dcreg细胞(实验组1所得)cd80表面分子荧光的平均强度的比较：dcreg细胞较成熟dc细胞cd80的mfi值低，较未成熟dc细胞cd80的mfi值高，意味着cd4+和cd8+t细胞低反应性。98.如图4、5所示，未成熟dc(实验组2所得)、dcreg细胞(实验组1所得)、成熟dc(实验组3所得)与cfse标记的pbmc细胞混合前cd4+t细胞所占比例为0.73％，cd8+t细胞所占比例为1.47％，混合并共培养5天后cd4+所占比例分别为2.3％、1.35％和14.8％；cd8+t细胞所占比例分别为2.1％、1.86％和12.9％。99.如图6所示，为未成熟dc(实验组2所得)、dcreg细胞(实验组1所得)、成熟dc(实验组3所得)与cfse标记pbmc细胞混合并共培养5天后cd4+细胞、cd8+细胞增殖比较示意图，加入vegf的dcreg细胞较传统dcreg细胞与cfse标记的pbmc细胞混合后使cd4+细胞、cd8+细胞增殖变的更加缓慢。100.如图7所示，为dcreg细胞(实验组1所得)诱导前后的cd3+cd4+cd25hi的t细胞比例示意图：诱导后cd3+cd4+cd25hicd127lowfowp3+treg细胞的比例变高，因此可改善宿主耐受性，进而提高移植成功率(按如图所示圈出cd3+t细胞比例为21.8％，其中cd4+t细胞比例为80.2％，进一步分析cd25hi比例为6.35％，在cd4+cd25hit细胞上进一步分析得到cd127lowfowp3+treg细胞在诱导后比例为82.9％；诱导前与诱导后分析方法相同，得到诱导前cd127lowfowp3+treg细胞比例为39.3％)。101.给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。当前第1页12当前第1页12