一种能够靶向CD137和PD-L1的双特异性抗体的用途的制作方法

一种能够靶向cd137和pd-l1的双特异性抗体的用途
技术领域
1.本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种能够靶向cd137和pd-l1的双特异性抗体的用途。


背景技术：

2.双特异性抗体(bsab)是指能同时特异性结合两种抗原或两个表位的抗体分子，理论上可以发挥两种单抗联合的协同作用，是当下行业最热门的新药研发投资方向之一。
3.程序性死亡因子1(programmedcelldeathprotein1,pd-1)是cd28超家族成员。作为t细胞抑制受体，在肿瘤细胞中能限制t细胞效应子的功能，在肿瘤免疫逃逸中具有重要作用。阻断pd-1与pd-l1相互作用能有效恢复t细胞对肿瘤的杀伤功能；可以促进肿瘤抗原特异性t细胞增殖，发挥杀伤肿瘤细胞作用，进而抑制局部肿瘤生长；pd-l1单抗能够上调浸润cd8
+
t细胞ifn-γ的分泌，这表明pd-1/pd-l1信号通路的阻断在以诱导免疫应答为目的的肿瘤免疫应答中发挥作用。另外，pd-l1在体内还能够与b7-1结合。已有研究表明，pd-l1/b7-1复合物也是t细胞活化的负信号，二者结合可以导致t细胞表面活化标记物表达下降，抑制t细胞增殖等。目前，业界普遍认为针对pd-l1通路的抗体将带来治疗多种肿瘤治疗的突破性进展：用于治疗非小细胞性肺癌，卵巢癌，肾细胞癌，黑色素瘤。pd-1/pd-l1免疫疗法当前已备受全世界瞩目，是能够为患者带来新希望的新一类抗癌免疫疗法。然而，pd-1/pdl1疗法存在一定缺陷：部分患者经历快速持久的肿瘤消退，但多数患者获得很小或没有明显效果。为了增加免疫疗法对患者的响应率，研究人员试图开发新的免疫调节靶点和治疗策略。其中一种很有希望的策略是对免疫刺激受体激动作用以诱导免疫细胞活化。这种“共刺激”策略为临床开发中的多种药剂提供了机制基础，包括靶向cd27，ox40，gitr，cd40和cd137的抗体。
4.cd137为一种共刺激分子，属于肿瘤坏死因子受体(tnfrsf9)超家族的成员，主要表达于活化的t细胞，与其配体cd137l结合后通过三聚体形式进行信号传导。cd137信号通路能够通过增强肿瘤特异性cd8
+
t细胞功能实现抗肿瘤作用，还能够通过增强nk细胞、dc细胞和cd4
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t细胞的免疫功能提高cd8
+
t细胞介导的抗肿瘤免疫应答，作为治疗靶点具有独特潜力。在临床前试验中，抗cd137单克隆抗体的抗肿瘤活性在小鼠肺癌(m109)、结肠癌(mc38、ct26)、b淋巴瘤(a20)和乳腺癌(emt6)多个模型中验证。此外和pd1/pdl1、ctla4抗体，化疗以及其它靶向药存在协同作用。第一个进入临床试验的抗cd137治疗药物urelumab(bms-663513)是一种全人igg4类型单克隆抗体。该药物在临床已经取得了令人鼓舞的疗效，但i和ii阶段的数据显示肝脏毒性似乎与靶标和剂量有关，限制了其临床开发。第二个进入临床研究的药物utomilumab(pf-05082566)是人源化igg2单克隆抗体，其在激活cd137同时可以阻断与内源性cd137l结合。该抗体相较于urelumab具有更好的安全性，但激动活性弱。因此如何针对cd137靶点，研发一种高效、低毒的抗肿瘤药物，已经成为药物研发人员的关注点。
5.截止到目前为止，市场上还没有有效的cd137/pd-l1双特异性抗体药物产品。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种能够靶向cd137和pd-l1的双特异性抗体的用途。该双特异性抗体的研发有望弥补目前市场上pd-1/pd-l1或cd137靶向肿瘤不足，并拓展出新适应症，同时可作为新一代pd-l1免疫治疗产品，不但可用于治疗临床经pd-1/pd-l1等现有治疗手段后产生免疫耐受的患者，及较低应答率的患者，还可用于目前尚无很好疗效的pd-l1低表达癌种。
7.第一方面，本发明要求保护能够靶向cd137和pd-l1的双特异性抗体或核酸分子或表达盒、重组载体或重组细胞或药物组合物在如下任一中的应用：
8.p1、制备用于检测cd137和/或pd-l1的产品，或检测cd137和/或pd-l1。
9.在实际应用中，可将所述双特异性抗体用作诊断工具检测癌症、自身免疫或其他疾病的患者的血液或组织中的cd137和/或pd-l1。
10.其中，所述cd137和/或pd-l1可为人cd137和/或pd-l1，也可为猴cd137和/或pd-l1，还可为鼠cd137和/或pd-l1。
11.p2、制备用于阻断pd-1/pd-l1信号通路的产品。
12.在本发明的具体实施方式中，所述pd-1/pd-l1信号通路具体为人pd-1/pd-l1信号通路。
13.p3、制备用于刺激t细胞活化的产品，或刺激t细胞活化。
14.进一步地，所述双特异性抗体t细胞激活效应依赖于pd-l1。
15.p4、制备用于促进t细胞分泌ifn-γ和/或il-2的产品，或促进t细胞分泌ifn-γ和/或il-2。
16.p5、制备用于抑制结肠癌细胞生长的产品，或抑制结肠癌细胞生长。
17.在本发明的具体实施方式中，所述结肠癌细胞具体为mc38细胞。
18.p6、制备用于抑制结肠癌肿瘤生长的产品，或抑制结肠癌肿瘤生长。
19.在本发明的具体实施方式中，所述结肠癌肿瘤为由mc38细胞所致的结肠癌肿瘤。
20.p7、制备用于治疗和/或预防结肠癌的产品，或治疗和/或预防结肠癌。
21.所述能够靶向cd137和pd-l1的双特异性抗体含有pd-l1抗原结合结构域和cd137抗原结合结构域。
22.所述pd-l1抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区中的hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列依次如seq id no.1的第26-32位、第52-56位和第98-107位所示；所述轻链可变区中的lcdr1、lcdr2和lcdr3的氨基酸序列依次如seq id no.2的第24-36位、第52-58位和第93-100位所示。其中，所述pd-l1抗原结合结构域的所述重链可变区中的所述hcdr3的氨基酸序列也可以如seq id no.9的第98-107位所示(将seq id no.1的第98-107位drpdgaatnl突变为drpegaatnl)。
23.所述cd137抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区中的hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列依次如seq id no.3的第31-35位、第50-65位和第98-106位所示；所述轻链可变区中的lcdr1、lcdr2和lcdr3的氨基酸序列依次如seq id no.4的第24-34位、第50-56位和第89-97位所示。
24.所述核酸分子为编码所述双特异性抗体的核酸分子；
25.所述表达盒为含有所述核酸分子的表达盒；
107位，或者与seq id no.4或seq id no.5的第1-107位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在框架区(fr))。
47.更进一步地，所述双特异性抗体从n端到c端结构可为如下任一：
48.结构a：1
st scfv-l1-fc-l2-2
nd scfv；
49.结构b：1
st scfv-l1-fc-l2-2
nd fab；
50.结构d：1
st fab-fc-l1-2
nd scfv；
51.其中，-表示肽键；l1、l2表示连接肽(linker)或独立肽键；l1和l2不同或相同；fc表示抗体的fc段；1
st scfv表示能够与第一抗原特异性结合的scfv结构域；1
st fab表示能够与所述第一抗原特异性结合的fab结构域；2
nd scfv表示能够与第二抗原特异性结合的scfv结构域；2
nd fab表示能够与所述第二抗原特异性结合的fab结构域；所述第一抗原和所述第二抗原中一个为pd-l1，另一个为cd137。
52.所述scfv结构域可以n端为重链可变区，c端为轻链可变区；也可以n端为轻链可变区，c端为重链可变区。
53.所述连接肽(linker)可选自如下：a(eaaak)4ale、kvdkkvepkscdktht、g4s、(g4s)n。其中，n为正整数(例如1、2、3、4、5或6)，优选地，n＝4。
54.所述双特异性抗体包含fc段。
55.所述fc段包含突变或不包含突变位点。
56.所述fc段为igg1、igg2、igg3或igg4型，优选的为igg4型。
57.优选的，实施例中a结构的所述双特异性抗体中，1
st scfv识别cd137抗原，2
nd scfv识别pd-l1抗原。
58.优选的，实施例中b结构的所述双特异性抗体1
st scfv识别cd137抗原，2
nd scfab识别pd-l1抗原。
59.优选的，实施例中d结构的所述双特异性抗体(命名为d1)1
st fab识别pd-l1抗原，2
nd scfv识别cd137抗原，l1为“a(eaaak)4ale”氨基酸序列，fc优选为igg4。实施例中，所述双特异性抗体在d1基础上突变为d3，将重链seq id no.7自n端起第61位氨基酸和第101位氨基酸突变，可以单个或者同时突变为谷氨酸“e”，或重链seq id no.7自n端起将第62位氨基酸和第102位氨基酸突变，可以单个或者同时突变为甘氨酸“g”或丙氨酸“a”。
60.优选的，另一实施例中d结构的所述双特异性抗体(命名为d2)，1
st fab识别pd-l1抗原，2
nd scfv识别cd137抗原，l1为“(g4s)3”氨基酸序列，fc优选为igg4。实施例中，所述双特异性抗体在d2基础上突变为d6，将将重链seq id no.8自n端起第61位氨基酸和第101位氨基酸突变，可以单个或者同时突变为谷氨酸“e”，或将重链seq id no.8自n端起将第62位氨基酸和第102位氨基酸突变，可以单个或者同时突变为甘氨酸“g”或丙氨酸“a”。
61.在本发明的具体实施方式中，所述双特异性抗体具体为如下任一：
62.(a)由两条相同的肽链组成，每条肽链的氨基酸序列均如seq id no.5所示(对应实施例中的结构a)；
63.(b)由两条重链和两条轻链组成；所述重链的氨基酸序列均如seq id no.6所示，所述轻链的氨基酸序列均如seq id no.11所示(对应实施例中的结构b)；
64.(c)由两条重链和两条轻链组成；所述重链的氨基酸序列均如seq id no.7所示，所述轻链的氨基酸序列均如seq id no.11所示(对应实施例中的结构d1)；
65.(d)由两条重链和两条轻链组成；所述重链的氨基酸序列均如seq id no.9所示，所述轻链的氨基酸序列均如seq id no.11所示(对应实施例中的结构d3)；
66.(e)由两条重链和两条轻链组成；所述重链的氨基酸序列均如seq id no.8所示，所述轻链的氨基酸序列均如seq id no.11所示(对应实施例中的结构d2)；
67.(f)由两条重链和两条轻链组成；所述重链的氨基酸序列均如seq id no.10所示，所述轻链的氨基酸序列均如seq id no.11所示(对应实施例中的结构d6)。
68.在所述核酸分子中，编码所述pd-l1抗原结合结构域中重链可变区中hcdr1、hcdr2和hcdr3的核苷酸序列依次如seq id no.27自5’端起第76-96位、第154-168位、第292-321位所示；其中，编码所述pd-l1抗原结合结构域的所述重链可变区中的所述hcdr3的核苷酸序列也可以如seq id no.16的第292-321位所示。编码所述pd-l1抗原结合结构域中轻链可变区中lcdr1、lcdr2和lcdr3的核苷酸序列依次如seq id no.28自5’端起第70-108位、第154-174位、第271-300位所示。
69.在所述核酸分子中，编码所述cd137抗原结合结构域中重链可变区中hcdr1、hcdr2和hcdr3的核苷酸序列依次如seq id no.29自5’端起第91-105位、第148-195位、第292-318位所示。在所述核酸分子中，编码所述cd137抗原结合结构域中轻链可变区中lcdr1、lcdr2和lcdr3的核苷酸序列依次如seq id no.30自5’端起第70-102位、第148-168位、第265-291位所示。
70.进一步地，在所述核酸分子中，编码所述pd-l1抗原结合结构域中重链可变区的核苷酸序列为seq id no.27或seq id no.12的第1879-2232位或seq id no.16的第1-354位，或者与seq id no.27或seq id no.12的第1879-2232位或seq id no.16的第1-354位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在框架区(fr))。在所述核酸分子中，编码所述pd-l1抗原结合结构域中轻链可变区的核苷酸序列为seq id no.28或seq id no.12的第1489-1818位，或者与seq id no.28或seq id no.12的第1489-1818位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性。
71.进一步地，在所述核酸分子中，编码所述cd137抗原结合结构域中重链可变区的核苷酸序列为seq id no.29或seq id no.12的第382-732位，或者与seq id no.29或seq id no.12的第382-732位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在框架区(fr))。在所述核酸分子中，编码所述cd137抗原结合结构域中轻链可变区的核苷酸序列为seq id no.30或seq id no.12的第1-321位，或者与seq id no.30或seq id no.12的第1-321位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在框架区(fr))。
72.更进一步地，所述核酸分子可为如下任一：
73.(a)编码前文所述(a)中的肽链的核酸分子a；所述核酸分子a的核苷酸序列为seq id no.12或者与seq id no.12具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在框架区(fr))。
74.(b)由编码前文所述(b)中的重链的核酸分子b1和编码前文所述(b)中的轻链的核酸分子b2组成；所述核酸分子b1的核苷酸序列为seq id no.13或者与seq id no.13具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选
在框架区(fr))；所述核酸分子b2的核苷酸序列为seq id no.18或者与seq id no.18具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在框架区(fr))。
75.(c)由编码前文所述(c)中的重链的核酸分子c1和编码前文所述(c)中的轻链的核酸分子c2组成；所述核酸分子c1的核苷酸序列为seq id no.14或者与seq id no.14具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在框架区(fr))；所述核酸分子c2的核苷酸序列为seq id no.18或者与seq id no.18具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在框架区(fr))。
76.(d)由编码前文所述(d)中的重链的核酸分子d1和编码前文所述(d)中的轻链的核酸分子d2组成；所述核酸分子d1的核苷酸序列为seq id no.16或者与seq id no.16具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在框架区(fr))；所述核酸分子d2的核苷酸序列为seq id no.18或者与seq id no.18具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在框架区(fr))。
77.(e)由编码前文所述(e)中的重链的核酸分子e1和编码前文所述(e)中的轻链的核酸分子e2组成；所述核酸分子e1的核苷酸序列为seq id no.15或者与seq id no.15具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在框架区(fr))；所述核酸分子e2的核苷酸序列为seq id no.18或者与seq id no.18具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在框架区(fr))。
78.(f)由编码前文所述(f)中的重链的核酸分子f1和编码前文所述(f)中的轻链的核酸分子f2组成；所述核酸分子f1的核苷酸序列为seq id no.17或者与seq id no.17具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在框架区(fr))；所述核酸分子f2的核苷酸序列为seq id no.18或者与seq id no.18具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在框架区(fr))。
79.前文所述双特异性抗体可按照包括如下步骤的方法制备得到：
80.(1)将前文所述核酸分子克隆到pcdna3.4载体中后得到的重组质粒；
81.(2)将步骤(1)所得的重组质粒转染受体细胞，得到重组细胞，培养所述重组细胞，获得所述双特异性抗体。
82.其中，当所述核酸分子涉及重链和轻链两部分时，分别克隆到pcdna3.4载体中得到两个重组质粒，然后共转染受体细胞得到重组细胞，培养所述重组细胞，获得所述双特异性抗体。
83.所述双特异性抗体与人pd-l1的结合亲和力的kd值小于10e-08m。所述双特异性抗体与人cd137的结合亲和力的kd值小于10e-08m。
84.所述双特异性抗体能同时结合pd-l1和cd137。
85.所述双特异性抗体能够阻断pd-1与pd-l1结合。
86.所述双特异性抗体与猴pd-l1的结合亲和力的kd值小于10e-08m。所述双特异性抗
reaction)，是指将两个无关个体、功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，检测抗体或其他药物对淋巴细胞的刺激作用。
101.如本文中所使用的，术语r2是统计学中相关系数，是指试验数据与拟合函数之间的吻合程度，r2值越接近1，吻合程度越高，越接近0，则吻合程度越低。
102.如本文中所使用的，术语linker是指蛋白接头或接头元件，即通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来，使其在适当的生物体内表达成为一条单一的肽链。
103.如本文中所使用的，术语“抗体”或者antibody是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(l)链和一条“重”(h)链组成的免疫球蛋白分子。从一般意义上，重链可以理解为抗体中分子量较大的多肽链，轻链是指抗体中分子量较小的多肽链。轻链可分类为κ和λ轻链。重链通常可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“j”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“d”区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr))，其间散布有较保守的称为构架区(fr)的区域。各vh和vl由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗体结合部位。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亚型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗体。
104.如本文中所使用的，术语“双特异性抗体重链”和“双特异性抗体轻链”是指，在双特异性抗体结构中存在两条链时，分子量大的一条链为双特异性抗体重链，分子量小的一条链为双特异性抗体轻链。
105.如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在本发明的一些实施方案中，术语“靶向”是指特异性结合。
106.如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek 293细胞或人细胞等的动物细胞。
107.如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含
有复制起始位点。
108.如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用a表示。
附图说明
109.图1为本发明双特性抗体结构示意图。
110.图2为sds-page还原和非还原条件下检测本发明双特异性抗体分子量和纯度(r表示还原，nr表示非还原)。
111.图3为本发明双特异性抗体结合人pd-l1。
112.图4为本发明双特异性抗体突变候选分子结合人pd-l1。
113.图5为本发明双特异性抗体结合人cd137。
114.图6为本发明双特异性抗体突变候选分子结合人cd137。
115.图7为本发明双特异性抗体同时结合人pd-l1和人cd137。
116.图8为facs检测本发明双特异性抗体与人pd-l1结合活性。
117.图9为facs检测本发明双特异性抗体与人cd137结合活性。
118.图10为elisa检测本发明双特异性抗体与猴pd-l1结合活性。
119.图11为elisa检测本发明双特异性抗体与猴cd137结合活性。
120.图12为mlr检测本发明双特异性抗体激活t细胞。a为细胞上清中il-2分泌水平检测；b为细胞上清中ifn-γ分泌水平检测。图中，每个给药组柱状图从左到右浓度依次为10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml、0.016μg/ml；igg从左到右浓度依次为10μg/ml、0.4μg/ml、0.016μg/ml
121.图13为hupd-l1依赖的cd8
+
t细胞激活活性检测。
122.图14为报告基因检测本发明双特异性抗体激活cd137/nfκb活性。
123.图15为报告基因检测本发明双特异性抗体阻断pd-1/pd-l1活性。
124.图16为本发明双特异性抗体抗肿瘤药效。
具体实施方式
125.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
126.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
127.下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna的3
′
末端核苷酸。
128.下述实施例中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。
129.下述实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于基因扩增、重组质粒构建、
以及将质粒引入宿主细胞的方法。
130.pcdna3.4载体：(invitrogen，cat:a14697)。expi293f细胞：atcc细胞库。cho-k1细胞：atcc细胞库。mc38细胞：南京科佰生物科技有限公司。
131.jurkat细胞：南京科佰生物科技有限公司。
132.常规器材和试剂如下：
133.1、96孔酶标板(nunc公司)。2、铺板缓冲液：0.05m碳酸氢钠水溶液。3、洗涤液：仅含0.05％体积百分含量tween 20的ph为7.0的磷酸盐缓冲液。4、封闭液：仅含10g/l bsa的洗涤液。5、辣根过氧化物酶标记亲和素。6、显色底物：四甲基联苯胺。7、终止液：1m硫酸。
134.其中，所述ph为7.0的磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠；所述氯化钠在所述ph为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为135mm，所述氯化钾在所述ph为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度为2.7mm，所述磷酸二氢钾在所述ph为7.0的磷酸盐缓冲液中的浓度1.5mm，所述磷酸氢二钠在所述ph为7.0的磷酸盐缓冲液的浓度为8mm(即磷酸氢二钠的浓度为8mm)。
135.实施例1、抗人pd-l1/cd137双特异性抗体的制备
136.一、抗人pd-l1/cd137双特异性抗体的重组载体的构建
137.抗人pd-l1单克隆抗体的序列来自于安徽安科生物工程(集团)股份有限公司(简称：安科生物)的中国专利申请cn 201910174374.8，抗人cd137单克隆抗体来源于合肥瀚科迈博生物技术有限公司的中国专利申请cn 201911105611.1，以及国际专利申请pct/cn2020/127993。本发明抗人pd-l1/cd137双特异性抗体结构示意图如图1所示，均具有抗体活性。
138.双特异性抗体从n端到c端如图1结构a所示：1
st scfv-l1-fc-l2-2
nd scfv；
139.双特异性抗体从n端到c端如图1结构b所示：1
st scfv-l1-fc-l2-2
nd fab；
140.双特异性抗体从n端到c端如图1结构d所示：1
st fab-fc-l1-2
nd scfv；
141.其中，
“‑”
为肽键；l1、l2为独立肽键或接头元件(linker)；fc为抗体的fc段；1
st
为n-末端第一抗原scfv结构域或fab结构域，2
nd
为c-末端第二抗原scfv结构域或fab结构域。第一抗原scfv结构域或fab结构域和第二抗原scfv结构域或fab结构域各自具有针对不同抗原的结合特异性(如pd-l1或cd137)，其中scfv结构可以是重链在前(vh-vl)，也可以是轻链在前(vl-vh)。接头元件(linker)的序列可以为a(eaaak)4ale、kvdkkvepkscdktht等，优选的序列为(g4s)n，其中，n为正整数(例如1、2、3、4、5或6)，优选地，n＝4。fc段可以包含突变或不突变位点，所述fc段可以为igg1、igg2、igg3、igg4型，优选的为igg4型fc。
142.可选择的，a结构中，fc为人igg4亚型，将fc的n端通过linker((g4s)2)连接抗cd137抗体的单链抗体(vh-(g4s)4-vl)，fc的c端通过linker((g4s)3)连接抗pd-l1抗体的单链抗体(vh-(g4s)4-vl)，a结构氨基酸序列如seq id no.5所示，对应的核苷酸序列如seq id no.12所示。
143.可选择的，b结构中，fc为人igg4亚型，一条链(双特异性抗体重链)为fc的n端通过linker((g4s)2)连接抗cd137抗体的单链抗体(vh-(g4s)4-vl)，fc的c端通过linker((g4s)3)连接抗pd-l1抗体的重链，氨基酸序列如seq id no.6所示(对应的核苷酸序列如seq id no.13所示)，另一条链(双特异性抗体轻链)为抗pd-l1抗体的轻链，氨基酸序列如seq id no.11所示(对应的核苷酸序列如seq id no.18所示)。
144.可选择的，d结构中，fc为人igg4亚型，在抗pd-l1抗体的两条重链的c端分别通过linker(a(eaaak)4ale、kvdkkvepkscdktht或(g4s)n)连接一个抗人cd137抗体的单链抗体(vh-(g4s)4-vl)。另一条链为抗pd-l1抗体的轻链。
145.d1：l1为“a(eaaak)4ale”氨基酸序列。重链氨基酸序列如seq id no.7所示(对应的核苷酸序列如seq id no.14所示)，轻链氨基酸序列如seq id no.11所示(对应的核苷酸序列如seq id no.18所示)。
146.d3：在d1基础上突变为d3，将重链seq id no.7自n端起第61位氨基酸和第101位氨基酸突变，可以单个或者同时突变为谷氨酸“e”，或将重链seq id no.7自n端起将第62位氨基酸和第102位氨基酸突变，可以单个或者同时突变为甘氨酸“g”或丙氨酸“a”。重链氨基酸序列如seq id no.9所示(对应的核苷酸序列如seq id no.16所示)，轻链氨基酸序列如seq id no.11所示(对应的核苷酸序列如seq id no.18所示)。
147.d2：l1为“(g4s)3”氨基酸序列。重链氨基酸序列如seq id no.8所示(对应的核苷酸序列如seq id no.15所示)，轻链氨基酸序列如seq id no.11所示(对应的核苷酸序列如seq id no.18所示)。
148.d6：在d2基础上突变为d6，将重链seq id no.8自n端第61位氨基酸和第101位氨基酸突变，可以单个或者同时突变为谷氨酸“e”，或将重链seq id no.8自n端第62位氨基酸和第102位氨基酸突变，可以单个或者同时突变为甘氨酸“g”或丙氨酸“a”。重链氨基酸序列如seq id no.10所示(对应的核苷酸序列如seq id no.17所示)，轻链氨基酸序列如seq id no.11所示(对应的核苷酸序列如seq id no.18所示)。
149.以下内容是双特异性抗体重组表达载体的详细构建过程。
150.直接合成双特异性抗体a结构、b结构和d结构(d1或d3或d2或d6)中双特异性抗体重链核苷酸序列，并在合成的时候分别在n端引入xbai酶切位点(tctaga)、kozak共识别序列(5
’‑
gccacc-3’)，以及信号肽序列(5
’‑
atggagttcggcctgtcctggctgtttctggtggccatcctgaagggcgtgcagtgc-3’)，c端引入终止密码子及hindiii酶切位点(aagctt)，合成序列采用xbai和hindiii双酶切后插入到经同样双酶切的pcdna3.4载体上，即获得双特异性抗体的目的基因的重组载体。经测序验证正确后的重组质粒依据插入序列不同分别命名为pcdna3.4-a、pcdna3.4-b-h、pcdna3.4-d1-h、pcdna3.4-d3-h、pcdna3.4-d2-h、pcdna3.4-d6-h。
151.同时，人工合成双特异性抗体轻链基因，并在合成的时候分别在n端引入xbai酶切位点(tctaga)、kozak共识别序列(5
’‑
gccacc-3’)，以及信号肽序列(5
’‑
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggatccactggt-3’)，c端引入终止密码子及hindiii酶切位点(aagctt)，合成序列采用xbai和hindiii双酶切后克隆到经同样双酶切pcdna3.4载体上，即获得所述双特异性抗体的轻链基因的重组载体。经测序验证正确后的重组质粒依据插入序列的不同分别命名为pcdna3.4-b-l、pcdna3.4-d1-l、pcdna3.4-d3-l、pcdna3.4-d2-l、pcdna3.4-d6-l。
152.二、双特异性抗体的表达和纯化
153.将步骤一中所述结构对应的重组载体分别使用expi293表达系统(thermo fisher)产品，根据产品说明书操作流程。在optimem中分别加入expi fectamine转染试剂、dna质粒得到溶液a和b，然后将溶液a和溶液b混匀得到溶液c。将溶液c加入expi293细胞
(thermo fisher)中，培养expi293细胞5天后。其中，结构a只转入pcdna3.4-a一个重组质粒即可；结构b和结构d需要共转重链和轻链分别对应的两个重组质粒。离心(10000rpm离心10分钟)，取上清，将所得上清用protein a亲和层析柱纯化，亲和纯化之后再用superdex200pg凝胶过滤精纯。
154.具体操作是：先用pbs平衡protein a柱(ge公司)，然后培养上清过柱，再平衡后，再采用亲和洗脱缓冲液(配方：溶剂为水，溶质及浓度为：50mm醋酸钠，ph3.5)洗脱5个柱体积，收集洗脱峰；使用pbs平衡superdex200pg(ge公司)，然后将亲和洗脱收集液按4％比例过柱，收集单体峰，然后使用30kd浓缩离心管浓缩获得目的分子。
155.纯化的抗体利用sds-page在还原和非还原条件下检测其分子量和纯度。结果如图2所示，在非还原条件下，a、b、d结构表现为基本单一的条带。在还原条件下，a结构为单一条带，分析量大小约为80-100kd；b结构和d结构在还原，表现为两条带，分子量分别为80-100kd和25-30kd，与理论分子量大小相符合。
156.经上述制备所得a结构双特异性抗体由两条相同的肽链组成，每条肽链的氨基酸序列均如seq id no.5所示(对应的核苷酸序列如seq id no.12所示)。
157.经上述制备所得b结构双特异性抗体由两条重链和两条轻链组成；所述重链的氨基酸序列均如seq id no.6所示(对应的核苷酸序列如seq id no.13所示)，所述轻链的氨基酸序列均如seq id no.11所示(对应的核苷酸序列如seq id no.18所示)。
158.经上述制备所得d1结构双特异性抗体由两条重链和两条轻链组成；所述重链的氨基酸序列均如seq id no.7所示(对应的核苷酸序列如seq id no.14所示)，所述轻链的氨基酸序列均如seq id no.11所示(对应的核苷酸序列如seq id no.18所示)。
159.经上述制备所得d3结构双特异性抗体由两条重链和两条轻链组成；所述重链的氨基酸序列均如seq id no.9所示(对应的核苷酸序列如seq id no.16所示)，所述轻链的氨基酸序列均如seq id no.11所示(对应的核苷酸序列如seq id no.18所示)。
160.经上述制备所得d2结构双特异性抗体由两条重链和两条轻链组成；所述重链的氨基酸序列均如seq id no.8所示(对应的核苷酸序列如seq id no.15所示)，所述轻链的氨基酸序列均如seq id no.11所示(对应的核苷酸序列如seq id no.18所示)。
161.经上述制备所得d6结构双特异性抗体由两条重链和两条轻链组成；所述重链的氨基酸序列均如seq id no.10所示(对应的核苷酸序列如seq id no.17所示)，所述轻链的氨基酸序列均如seq id no.11所示(对应的核苷酸序列如seq id no.18所示)。
162.实施例2、双特异性抗体的抗原结合活性检测
163.一、elisa方法测定双特异性抗体与人pd-l1抗原结合活性
164.通过elisa评估双特异性抗体结合人pd-l1的亲和力。人pd-l1全长氨基酸序列如seq id no.22所示(uniprot#q9nzq7)。与上述抗体表达制备类似，以其胞外段(seq id no.22自n端起第19-238位)为目的序列，插入pcdna3.4载体的xbaⅰ和hindⅲ位点之间，经测序验证正确后得到目的质粒，通过hek293瞬转表达。96孔板(96孔酶标板，nunc公司)用人pd-l1包被，浓度为350ng/ml，100μl/孔，4℃过夜。洗板三次，每孔加300μl封闭液(配方见上文)，37℃封闭1小时。用洗涤液(配方见上文)洗板三次，将本发明实施例1获得的双特异性抗体结构a、b、d3和d6分别用样品稀释液(pbs-t加入1％牛血清白蛋白)稀释到5nm，再用7个离心管4倍梯度稀释成不同浓度样品，每个浓度设置两个复孔，100μl/孔，孵育1小时。用洗
涤液洗板三次，每孔加稀释8000倍的辣根过氧化物酶标记羊抗人(羊抗人-hrp，thermofisher公司)100μl，振荡0.5小时。洗板三次，每孔加100μl四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，tmb，thermofisher公司)。避光显色，加1m的硫酸终止反应。用versamax酶标仪(molecular)在450nm下测od值。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数logistic拟合方法作图，具体稀释浓度以及检测结果见表1。
165.结果曲线如图3所示，双特异性抗体与人pd-l1抗原之间存在较好的结合，并且呈现出剂量依赖性，不同结构的双特异性抗体与人pd-l1结合活性有差异。
166.表1、elisa检测双特异性抗体与人pd-l1结合活性
[0167][0168]
同样方法，检测d结构对应不同突变分子与人pd-l1的结合活性，具体结果见表2，曲线拟合结果如图4所示，相同结构的双特异性抗体候选分子与人pd-l1结合活性差异不大。
[0169]
表2、elisa检测双特异性抗体突变分子与人pd-l1结合活性
[0170][0171]
二、elisa方法测定双特异性抗体与人cd137抗原结合活性
[0172]
通过elisa评估双特异性抗体结合人cd137的亲和力。人cd137全长氨基酸序列如seq id no.19所示(uniprot#q07011)，制备方法同抗体蛋白以及人pd-l1蛋白类似，以其胞外段(氨基酸序列如seq id no.19自n端起第24-186位所示)为目的序列，插入pcdna3.4载体的xbaⅰ和hindⅲ位点之间，经测序验证正确后得到目的质粒，通过hek293瞬转表达。将人cd137抗原用铺板液稀释至350ng/ml，100μl/孔加入elisa板(nunc公司)，4℃过夜。洗板三次，每孔加300μl封闭液(配方见上文)，37℃封闭1小时。将本发明实施例1获得的双特异性抗体a、b、d3和d6分别用样品稀释液(pbs-t加入1％牛血清白蛋白)稀释到10nm，再用7个离心管4倍梯度稀释成不同浓度样品，每个浓度设置两个复孔，100μl/孔，孵育1小时。加入1:8000(体积比)稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人-igg(羊抗人-hrp，thermofisher公司)，每孔100μl，室温振荡温育1h；洗板三次，每孔加100μl四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，tmb，thermofisher公司)。避光显色，加1m的硫酸终止反应。用versamax酶标仪(molecular)在450nm下测od值。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数logistic拟合方法作图，具体稀释浓度以及检测结果见表3。
[0173]
结果曲线如图5所示，双特异性抗体与人cd137抗原之间存在较好的结合，并且呈现出剂量依赖性，不同结构的双特异性抗体与人cd137结合活性有差异。
[0174]
表3、elisa检测双特异性抗体与人cd137结合活性
[0175][0176]
同样方法，检测d结构对应不同突变分子与人cd137的结合活性，双特异性抗体d1、d2、d3和d6分别用样品稀释液(pbs-t加入1％牛血清白蛋白)稀释到5nm，再用7个离心管4倍梯度稀释成不同浓度样品，具体结果见表2，曲线拟合结果如图6所示，相同结构的双特异性抗体突变之后，d1与d3、d2与d6候选分子与人cd137结合活性差异不大。
[0177]
表4、elisa检测双特异性抗体与人cd137结合活性
[0178][0179]
三、elisa方法检测双特异性抗体与人pd-l1和人cd137抗原同时结合特性
[0180]
通过elisa评估双特异性抗体结合人pd-l1与人cd137同时结合活性。将人pd-l1胞外段(氨基酸序列如seq id no.22自n端起第19-238位所示，带his标签，制备方法参见步骤一)用铺板液稀释至500ng/ml，100μl/孔加入elisa板(nunc公司)，4℃过夜。洗板三次，每孔加300μl封闭液(配方见上文)，37℃封闭1小时。将本发明实施例1获得的双特异性抗体a、b、
d3和d6分别用样品稀释液(pbs-t加入1％牛血清白蛋白)稀释到5nm，再用7个离心管5倍梯度稀释成不同浓度样品，每个浓度设置两个复孔，100μl/孔，孵育1小时。加入检测浓度为500ng/ml的抗原人cd137(seq id no.19自n端起第24-186位，带鼠fc标签，制备方法参见步骤二)，100μl/孔，室温孵育1小时。用1％bsa按照1:2000稀释羊抗鼠-hrp，取100μl/孔加入elisa板，室温振荡孵育0.5小时；洗板三次，每孔加100μl四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，tmb，thermofisher公司)。避光显色，加1m的硫酸终止反应。用versamax酶标仪(molecular)在450nm下测od值。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数logistic拟合方法作图，具体稀释浓度以及检测结果见表5。
[0181]
结果曲线如图7所示，双特异性抗体能够同时结合人pd-l1和人cd137，并且呈现出剂量依赖性，不同结构的双特异性抗体与人cd137结合活性有差异。
[0182]
表5、elisa检测双特异性抗体与人pd-l1和人cd137同时结合活性
[0183][0184][0185]
四、facs方法检测双特异性抗体与细胞表面人pd-l1抗原结合特性
[0186]
按照本领域通用方法将人pd-l1全长(seq id no.22)为目的序列插入pcdna3.4载体的xbaⅰ和hindⅲ位点之间，所得重组质粒经测序验证正确后用lipofectamine3000转染试剂(invitrogen公司)导入到野生型cho-k1细胞，获得高表达人pd-l1的细胞株cho-k1/hpd-l1。培养并收集对数生长期的cho-k1/hpd-l1细胞，用约1ml缓冲液重悬清洗、离心并重悬细胞分装到离心管，2
×
105个细胞每管。将本发明实施例1获得的双特异性抗体a、b、d3和d6分别用pbs稀释到50nm，再3倍梯度稀释6个浓度。将各浓度样品依次加入装有细胞的离心管，100μl每管，设置空白对照。孵育60min后，用1ml清洗液(pbs+2％胎牛血清)清洗两次后，加入羊抗人fitc二抗(invitrogen公司，货号h10301)，吹打重悬，避光孵育30min。再次用1ml清洗液清洗两次，然后每管加入500μl pbs重悬，置于冰上避光，上机检测。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数logistic拟合方法作图，具体稀释浓度以及检测结果见表6。
[0187]
表6、facs检测双特异性抗体与人pd-l1结合活性
[0188][0189][0190]
如图8所示，双特异性抗体与人pd-l1抗原之间存在较好的结合，并且呈现出剂量依赖性，不同结构的双特异性抗体与人pd-l1结合活性有差异。
[0191]
五、facs方法检测双特异性抗体与细胞表面人cd137抗原结合特性
[0192]
按照本领域通用方法将人cd137全长(seq id no.19)为目的序列插入pcdna3.4载体的xbaⅰ和hindⅲ位点之间，所得重组质粒经测序验证正确后用lipofectamine3000转染试剂(invitrogen公司)导入到野生型cho-k1细胞，获得高表达人cd137的细胞株cho-k1/hcd137。培养并收集对数生长期的cho-k1/hcd137细胞，用约1ml缓冲液重悬清洗、离心并重悬细胞分装到离心管，2
×
105个细胞每管。将本发明实施例1获得的双特异性抗体a、b、d3和d6分别用pbs稀释到50nm，再3倍梯度稀释6个浓度。将各浓度样品依次加入装有细胞的离心管，100μl每管，设置空白对照。孵育60min后，用1ml清洗液(pbs+2％胎牛血清)清洗两次后，加入羊抗人fitc二抗(invitrogen公司，货号h10301)，吹打重悬，避光孵育30min。再次用1ml清洗液清洗两次，然后每管加入500μl pbs重悬，置于冰上避光，上机检测。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数logistic拟合方法作图，具体稀释浓度以及检测结果见表7。
[0193]
表7、facs检测双特异性抗体与人cd137结合活性
[0194]
浓度(nm)abd3d625014162.616214.916558.21527183.3333333314042.616100.516663.115420.327.7777777811050.612139.514637.711126.39.2592592596793.88001.473927026.43.0864197533720.940962915.53932.21.0288065842963.43018.52620.52766.50.3429355282662.126802585.42620.2ec50(nm)14.56214.4112.416.39r20.990.990.990.99
[0195]
如图9所示，双特异性抗体与人cd137抗原之间存在较好的结合，并且呈现出剂量依赖性，不同结构的双特异性抗体与人cd137结合活性有差异。
[0196]
六、elisa方法检测双特异性抗体与猴pd-l1抗原结合特性
[0197]
通过elisa评估双特异性抗体结合猴pd-l1的结合活性。猴pd-l1胞外段氨基酸序列如seq id no.23所示(uniprot#g7pse7)。与上述抗体表达制备类似，以其胞外段为目的序列，构建质粒，通过hek293瞬转表达。用猴pd-l1包被96孔板，浓度为500ng/ml，100μl/孔，4℃过夜。洗板三次，每孔加300μl封闭液(配方见上文)，37℃封闭1小时。洗板三次，将本发明实施例1获得的双特异性抗体d6用样品稀释液(pbs-t加入1％牛血清白蛋白)稀释到1μg/ml，再用7个离心管4倍梯度稀释成不同浓度样品，每个浓度设置两个复孔，100μl/孔，孵育1小时。用洗涤液洗板三次，每孔加稀释8000倍的辣根过氧化物酶标记羊抗人(羊抗人-hrp，thermofisher公司)100μl，振荡0.5小时。洗板三次，每孔加100μl四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，tmb，thermofisher公司)。避光显色，加1m的硫酸终止反应。用versamax酶标仪(molecular)在450nm下测od值。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数logistic拟合方法作图，具体稀释浓度以及检测结果见表8。实验选取亲本抗体anti-pd-l1(来自于安徽安科生物工程(集团)股份有限公司(简称：安科生物)的中国专利申请cn201910174374.8的抗人pd-l1单克隆抗体)和tercentriq(罗氏)为对照抗体，tercentriq根据drugbank(https://go.drugbank.com)中accession number db11595序列号生产表达。
[0198]
结果曲线如图10所示，双特异性抗体与猴pd-l1抗原之间存在较好的结合，并且呈现出剂量依赖性，结合活性与亲本抗体无显著差别。
[0199]
表8、elisa检测双特异性抗体与猴pd-l1结合活性
[0200][0201]
七、elisa方法检测双特异性抗体与猴cd137抗原结合特性
[0202]
通过elisa评估双特异性抗体结合猴cd137的结合活性。猴cd137胞外段氨基酸序列如seq id no.20所示(uniprot#a9yye7)。与上述抗体表达制备类似，以其胞外段为目的序列，构建质粒，通过hek293瞬转表达。用猴cd137包被96孔板，浓度为500ng/ml，100μl/孔，4℃过夜。洗板三次，每孔加300μl封闭液(配方见上文)，37℃封闭1小时。洗板三次，将本发明实施例1获得的双特异性抗体d6用样品稀释液(pbs-t加入1％牛血清白蛋白)稀释到
10nm，再用7个离心管4倍梯度稀释成不同浓度样品，每个浓度设置两个复孔，100μl/孔，孵育1小时。用洗涤液洗板三次，每孔加稀释8000倍的辣根过氧化物酶标记羊抗人(羊抗人-hrp，thermofisher公司)100μl，振荡0.5小时。洗板三次，每孔加100μl四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，tmb，thermofisher公司)。避光显色，加1m的硫酸终止反应。用versamax酶标仪(molecular)在450nm下测od值。根据抗体和抗原反应曲线，采用4参数logistic拟合方法作图，具体稀释浓度以及检测结果见表9。实验选取亲本抗体anti-cd137(即来源于合肥瀚科迈博生物技术有限公司的中国专利申请cn 201911105611.1中的抗人cd137单克隆抗体hanke10f4)为对照抗体，human igg4(sino biological公司，货号hg4k)为无关对照抗体。
[0203]
结果曲线如图11所示，双特异性抗体与猴cd137抗原之间存在较好的结合，并且呈现出剂量依赖性，结合活性与亲本抗体无显著差别。
[0204]
表9、elisa检测双特异性抗体与猴cd137结合活性
[0205][0206]
实施例3、体外药效检测双特异性抗体对t淋巴细胞的激活效应
[0207]
一、体外药效检测双特异性抗体对t淋巴细胞的激活效应
[0208]
从健康人a获得全血，使用淋巴细胞分离液(sigma公司)，按照其说明书操作分离pbmc细胞，备用。从健康人b获取全血，使用淋巴细胞分离液分离pbmc细胞后，再利用easysep
tm human cd14 positive selection kit ii(stemcell公司)分离获得dc细胞，并将细胞重悬于加有10ng/ml il-6，10ng/ml il-1β，10ng/mltnf-α和1μg/ml pge 2的培养基里诱导成熟。
[0209]
将实施例1制备的双特异性抗体d6与亲本抗体anti-cd137(即来源于合肥瀚科迈博生物技术有限公司的中国专利申请cn 201911105611.1中的抗人cd137单克隆抗体hanke10f4)和anti-pd-l1(来自于安徽安科生物工程(集团)股份有限公司(简称：安科生物)的中国专利申请cn 201910174374.8的抗人pd-l1单克隆抗体)分别稀释到10μg/ml，并按照5倍梯度稀释5个浓度(10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml、0.016μg/ml)。设置无关抗体human igg4(sino biological公司，货号hg4k)，浓度设置10μg/ml、0.4μg/ml、0.016μ
g/ml。将获得备用的pbmc以及dc细胞按10：1比例加入96孔板，pbmc为1
×
105个每孔。体积为100μl/孔，再加入稀释好的待检测抗体，100μl/孔。孵育3天后，检测上清ifn-γ以及il-2的分泌水平。
[0210]
结果如图12所示，双特异性抗体d6相比于两个亲本单抗以及阴性无关对照抗体，能够激活混合淋巴反应体系中t细胞，进一步加细胞上清中ifn-γ以及il-2的分泌水平。
[0211]
二、体外药效检测双特异性抗体t细胞激活效应依赖于pd-l1
[0212]
同上文，从健康人获得全血，分离得到pbmc，再通过人cd8
+
t细胞磁珠(bd公司，货号557766)，根据说明书分离纯化得到人cd8
+
t细胞，备用。
[0213]
将anti-cd3抗体(biolegend,货号317325)利用pbs稀释到0.5μg/ml，加入96孔板(corning)，60μl/孔，将96孔板静置于37℃孵育1小时。用pbs清洗，然后将cho-k1/hpd-l1(参见实施例2步骤四)与cho-k1细胞分别按不同比例(0：4；1：3；2：2；3：1；4：0)加入96孔板，100μl/孔，总细胞为5000个/孔。再将96孔板置于细胞培养箱孵育6h后，将细胞上清吸除，再每孔加入100μl人cd8
+
t细胞，2.5
×
104个/孔。将待测抗体(d6)用培养基稀释到2μg/ml，再20倍梯度稀释5个浓度。将稀释好的抗体加入96孔板，100μl/孔，每个浓度设置3个复孔。将96孔板放入细胞培养箱孵育3天，用elisa法检测细胞培养上清中细胞因子ifn-γ的分泌量。
[0214]
结果如图13所示，双特异性抗体能够激活cd8
+
t细胞，这种激活依赖于pd-l1。当体系中没有pd-l1时，双抗不能激活cd8
+
t细胞，随着pd-l1的表达增加，双抗激活cd8
+
t细胞的最大能力越来越高，但是抗体的半有效浓度变化不大。
[0215]
实施例4、报告基因法检测双特异性抗体活性
[0216]
将人cd137全长序列作为目的基因插入pcdna3.4载体的xbaⅰ和hindⅲ位点之间(参见实施例3步骤五)，经测序验证正确后得到质粒a，同时取具有nfκb元件序列(序列如seq id no.25所示)以及荧光素酶基因(序列如seq id no.26所示)的质粒b(pnf-κb-luc，优宝生物，产品编号vt1588)。然后用lipofectamine 3000转染试剂(invitrogen公司)将a、b两种质粒一起导入到hek293细胞(中科院上海细胞库)。通过加压筛选，得到hek-293/nfκb-luci/cd137。
[0217]
取对数生长期的hek-293/nfκb-luci/cd137细胞以及cho-k1/hpd-l1细胞(参见实施例3步骤四)，将两种细胞各取50μl加入于96孔板(corning，3917)中，两种细胞均为3
×
104个/孔。将待测抗体(d6)稀释到20μg/ml(实验同时设置以亲本抗体anti cd137和anti pd-l1联用的对照，其中，anti-cd137为来源于合肥瀚科迈博生物技术有限公司的中国专利申请cn 201911105611.1中的抗人cd137单克隆抗体hanke10f4；anti-pd-l1为来自于安徽安科生物工程(集团)股份有限公司(简称：安科生物)的中国专利申请cn 201910174374.8的抗人pd-l1单克隆抗体)，5倍梯度稀释9个浓度后，依次加入96孔板，100μl/孔。在培养箱内静置18-24h后，加入100μl的one-glo luciferase assay sysytem试剂(promega)室温孵育10min，检测化学发光值。
[0218]
结果如图14所示，双特异性抗体能够依赖于pd-l1使得cd137下游nfκb信号通路激活，从而使得检测信号值增强，然后两个亲本单抗联用，因为anti cd137单抗失去crosslinking作用，不能激活激活cd137下游nfκb信号通路。pd-l1单抗只能结合cho-k1/hpd-l1，并不能作用于该信号通路。
[0219]
类似方法，构建稳定表达人pd-1及nfat元件的jurkat/nfat-luci/pd1细胞以及表
达人pd-l1和tcr激活蛋白cho-k1/pdl1/tcr细胞，将两种细胞按50000:25000，加入96孔板。将待测抗体d6稀释到12μg/ml，3倍梯度稀释9个浓度后，依次加入96孔板，100μl/孔。在培养箱内静置18-24h后，加入100μl的one-glo luciferase assay sysytem试剂(promega)室温孵育10min，检测化学发光值。
[0220]
结果如图15所示，双特异性抗体能够阻断pd-1/pd-l1信号通路，即说明双抗也能发挥pd-l1抗体抑制性功能。
[0221]
实施例5、双特异性抗体对肿瘤生长的抑制效应
[0222]
实验选择pd-1/cd137双knock-in小鼠(b-hpd-1/hcd137 mice)检测双特异性体内抗肿瘤药效。b-hpd-1/hcd137 mice小鼠模型是基因工程鼠，是在遗传背景c57bl/6小鼠的基因组嵌合有人源的hcd137基因和人源的pd-l1，来自百奥赛图(货号110004)。
[0223]
在受试小鼠后背(剃毛)一侧皮下接种鼠结肠癌mc38细胞系(每只小鼠接种5
×
105细胞，100μl)。当荷瘤鼠平均瘤体积达到100mm3时，将小鼠按实验设计随机分入3组，每组5只。在肿瘤接种后，每周两次检查动物生存和活动情况。包括：肿瘤生长情况，活动能力，饮食，体重和其他异常行为。每周给药两次并测量肿瘤的体积。计算体积公式为1/2
×
长
×
宽
×
宽(mm3)。分组给药当天定义为第0天。分组情况和给药方案如表10所示：
[0224]
表10、分组和给药方案
[0225][0226]
注：n为每组动物只数。vehicle为生理盐水对照组；anti pd-l1+anti cd137为亲本抗体anti cd137和anti pd-l1联用的对照；d1为实施例1制备的双特异性抗体d1。
[0227]
实验结果如图16所示，与对照组vehicle以及两单抗联用组相比，双特异性抗体d1给药后，小鼠的肿瘤生长受到了有效的抑制。
[0228]
实施例6、双特异性抗体恒河猴体内毒理检测
[0229]
实验选择4只恒河猴评估双特异性抗体在猴子体内毒副作用。将恒河猴分为高、低剂量两组，每组雌、雄各一只，高剂量为50mg/kg，低剂量为5mg/kg，具体给药样品为d6，每周静脉注射给药1次，连续给药4周，共给药4次。适应期每天上、下午至少各观察1次。给药当天，给药前观察1次，给药后下午各观察1次，非给药日每天上、下午至少各观察1次。动物出现明显毒性症状时，则增加观察频率，并记录时间。结果如表11所示，高、低两个剂量重复给药4周后，恒河猴的alt(谷丙转氨酶)与ast(谷草转氨酶)与适应期相比，并没有显著升高，显示了较好的耐受性。另一方面恒河猴的外周血内白细胞数量以及其中淋巴细胞的比例均略有增加，但均属有正常范围内，猴子在整个实验周期内一般状态、呼吸、心率、血液学、肝功能、肾功能等均表现正常，动物耐受较好。
[0230]
表11、恒河猴4周重复给药毒理测试
[0231][0232][0233]
备注：适应期(pretest phase)第1天(p1)，首次给药当天定义为给药期(dosing phase)第1天(d1)，wbc为白细胞，％lymph为淋巴细胞百分比。
[0234]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。