一种屎肠球菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种屎肠球菌(enterococcus faecium)dk
‑
01及其应用，尤其是一种能够提高母畜受孕率的屎肠球菌及其应用。


背景技术：

2.驴产业是我国的特色畜牧业，也是关键的扶贫民生产业。目前，该产业正在由短期育肥向繁育兼顾的新型可持续发展模式转变，同其他畜禽品种类似，驴产业的转型也是以扩大优良种群和提高品种质量为前提基础，而数量的增加和质量的提高，都离不开良种繁育这一关键环节。然而，后备母驴受孕率的降低以及流产、死胎的发生已严重制约了该产业的发展。
3.已有大量研究表明，屎肠球菌作为乳酸菌类重要的益生菌种能够维持肠道菌群平衡，抑制病原菌繁殖，降低内毒素水平，提高机体免疫力和抗氧化水平，进而改善母畜受孕率、妊娠率和泌乳力，提升母畜的繁殖性能。
4.然而，屎肠球菌在母驴饲料中的应用研究报道较为有限，具体的应用剂量和对母驴繁殖性能的影响也有待于进一步研究。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明旨在克服上述现有技术中存在的缺陷，提供一种从母驴肠道中分离的屎肠球菌(enterococcus faecium)dk
‑
01，该屎肠球菌能够平衡母畜肠道菌群结构，提高机体免疫功能，降低疾病发生率，同时能够提高母畜对饲料中营养物质的消化和吸收效率，提高母畜的受孕率、妊娠率和泌乳力，提升母畜的繁殖性能。
6.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
7.本发明提供了一种屎肠球菌(enterococcus faecium)dk
‑
01，于2021年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，保藏地址：湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学
‑
中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no.m2021017，状态为存活。
8.本发明中的屎肠球菌(enterococcus faecium)dk
‑
01的菌株特征为：菌落表面光滑，不透明，呈白色，菌落圆形，革兰氏阳性球菌。
9.本发明中的屎肠球菌(enterococcus faecium)dk
‑
01可在ph值为4.0
‑
9.0的范围内生长良好，能够耐受0.1％和0.3％的猪胆盐，而且可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等病原菌的生长。
10.本发明中的屎肠球菌(enterococcus faecium)dk
‑
01，其过氧化氢酶反应阴性，v
‑
p反应阳性，精氨酸产氨反应阳性，h2s阴性、明胶反应阴性、不产生吲哚，无芽孢形成，兼性厌氧，适于30
‑
37℃生长。
11.本发明中的屎肠球菌(enterococcus faecium)dk
‑
01，其16s rrna序列如seq id no.1所示。
12.在一个实施方案中，本发明考察了屎肠球菌dk
‑
01对肠道菌群的调节作用，结果显
示，屎肠球菌dk
‑
01的摄入可提高肠道菌群中的乳酸菌数量，改善了肠道菌群平衡和肠道健康。
13.在一个实施方案中，本发明考察了屎肠球菌dk
‑
01对母畜受孕率的影响，结果显示，屎肠球菌dk
‑
01的摄入可明显提升母驴的受孕率。原理在于，屎肠球菌dk
‑
01的饲喂可能是通过改善母驴肠道菌群，从而提升母驴健康状况，进而提高了母驴受孕率及繁殖性能。
14.因此本发明提供了屎肠球菌dk
‑
01在制备调节肠道菌群产品及提高母畜受孕率产品中的应用。
15.本发明所述产品包括但不限于饲料添加剂。
16.进一步地，本发明提供了含有屎肠球菌dk
‑
01的菌粉。
17.优选的，所述菌粉中屎肠球菌dk
‑
01的活菌数大于1
×
10
10
cfu/g。
18.本发明所书菌粉可以按常规方法制备。
19.在一些实施方案中，所述菌粉的制备方法为，将屎肠球菌活化后，放入发酵罐扩大培养，经发酵、离心、浓缩、低温喷雾干燥，制成菌粉。
20.术语解释：
21.如本文中所使用的，术语“16s rrna基因序列”是指细菌上编码16s rrna相对应的dna序列，其存在于所有细菌基因组中，一般由保守区和可变区组成。保守区在细菌间无显著差异，可用于构建所有生命的统一进化树。可变区在不同细菌中存在一定差异，对16s rrna可变区进行测序，可对细菌菌群进行精细鉴定至种的级别。
22.本发明的有益效果在于：
23.本发明所述屎肠球菌(enterococcus faecium)dk
‑
01，具有较好的ph耐受性、耐胆盐性能和抑菌性能，且安全性高，可改善母畜的肠道菌群平衡，提高机体免疫功能，降低疾病发生率，同时能够提高母畜对饲料中营养物质的消化和吸收效率，进而提升母畜的受孕率、妊娠率和泌乳力，提升母畜的繁殖性能，有利于增加母畜养殖的经济效益。
24.生物保藏说明：
25.屎肠球菌(enterococcus faecium)dk
‑
01，于2021年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，保藏地址：湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学
‑
中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no.m2021017，状态为存活。
附图说明
26.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
27.图1示出了实施例1所得乳酸菌的菌落图；
28.图2示出了实施例1所得乳酸菌的结晶紫染色观察图；
29.图3示出了实施例3中屎肠球菌dk
‑
01的溶血性试验观察图；
30.图4示出了实施例4中屎肠球菌dk
‑
01的ph耐受曲线；
31.图5示出了实施例5中屎肠球菌dk
‑
01的胆盐耐受图；
32.图6示出了实施例7中母驴的直肠粪便活菌计数。
具体实施方式
33.下面将结合实施例对本技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列实施例仅用于说明本技术，而不是对本技术的范围的限定。根据优选实施方案的下列详细描述，本技术的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
34.为了进一步理解本发明，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
35.实施例1：屎肠球菌的筛选
36.本发明所述的屎肠球菌筛选方法，包括以下步骤：
37.采自聊城市禹城、茌平等地驴场健康猪肠道内容物、新鲜粪便及驴场周边土壤。在超净工作台内用无菌注射器抽取驴肠内容物，注入高压灭菌的mrs液体培养基中增菌培养24h，将菌液倍比稀释至10
‑7，取10
‑5和10
‑7稀释菌液各100μl注射接种至预还原厌氧琼脂平板，置培养箱中37℃培养48h。从平板中挑取单个菌落，革兰氏染色，选取其中无芽孢革兰氏阳性细菌，将单株细菌纯化培养，直到镜下观察无杂菌。纯化后的菌株用体积分数30％甘油保存于
‑
80℃超低温冰箱中。
38.通过上述方法，从驴肠道内容物中分离出一株乳白色、革兰氏阳性细菌，其过氧化氢酶反应阴性，v
‑
p反应阳性，精氨酸产氨反应阳性，h2s阴性、明胶反应阴性、不产生吲哚，无芽孢形成，兼性厌氧，适于30
‑
37℃生长，初步鉴定为乳酸菌(参见图1，图2)。
39.实施例2：屎肠球菌的测序鉴定
40.采用正向引物p1：5
′‑
agagtttgatcctggctcag
‑3′
，反向引物p2：5
′‑
ggttaccttgttacgactt
‑3′
，引物由上海立菲生物技术有限公司(北京)合成，进行16s rdna扩增。pcr反应体系：2x pcr mix 30μl，引物各2.5μl，菌液2μl，ddh2o 23μl。pcr程序为：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，共30个循环；最后72℃延伸10min，pcr扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶(含有万分之一浓度的green i)上电泳30min，紫外灯下观察，确定产物pcr成功并达到要求后，将pcr产物送交上海立菲生物技术有限公司(北京)进行序列测定。测序结果在ncbi中进行同源性分析。通过genbank序列比对，结果显示与enterococcus faecium的16s rrna序列的同源性为99.71％
‑
99.78％。通过细菌形态、生理生化特性和适宜的生长条件及测序鉴定结果，确定菌株dk
‑
01为屎肠球菌。
41.实施例3：屎肠球菌的安全性分析
42.将屎肠球菌dk
‑
01单菌落点种在血琼脂平板中，置于37℃培养箱培养24
‑
48h，观察是否有溶血圈以及溶血圈类别。
43.菌落溶血有下列3种情况：
44.(1)α溶血：又称草绿色溶血，菌落周围形成的狭小(1
‑
2mm)、草绿色溶血环，为高铁血红蛋白所致；
45.(2)β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；
46.(3)γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。
47.经48h后，分离乳酸菌菌株在溶血板上出现γ型溶血，即不溶血，具有较好的安全
性(参见图3)。
48.实施例4：屎肠球菌的ph耐受性分析
49.应用盐酸及氢氧化钠调节mrs培养基ph值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，将过夜培养的屎肠球菌dk
‑
01菌液按1％接种量接至初始ph值不同的液体培养基中，37℃静置培养24h，利用分光光度计在600nm下测定菌液od值。
50.由菌株的ph耐受曲线可知，在ph值4.0
‑
9.0范围内，屎肠球菌菌株的生长状况良好(参见图4)，说明屎肠球菌dk
‑
01的能够耐受较为广泛的ph，利于适应动物不同肠段的酸碱度。
51.实施例5：屎肠球菌耐胆盐分析
52.将过夜培养的屎肠球菌dk
‑
01菌液按1％接种量接入分别含有0％、0.1％、0.3％和0.6％猪胆盐的mrs培养基，37℃静置培养24h，测定od 600，利用分光光度计在600nm下测定菌液od值。通过菌株的胆盐耐受图可知，屎肠球菌菌株在0.1％和0.3％的猪胆盐条件下，生长情况良好(参见图5)，能够耐受动物肠道中的胆盐浓度。
53.实施例6：屎肠球菌抑菌性能分析
54.将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别接入普通肉汤培养基，37℃培养24h，该菌液作为病原菌指示菌。取病原菌液100μl于营养琼脂平板上，均匀涂布，水平放置牛津杯，在牛津杯中分别加入100μl过夜培养的屎肠球菌dk
‑
01菌液，3个重复，37℃培养24h，测量抑菌圈直径。通过分析数据可知，屎肠球菌dk
‑
01能够显著抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长(表1)，具有较好的抑菌性能。
55.表1屎肠球菌dk
‑
01抑菌活性
[0056][0057]
注：“+++”表示抑菌作用显著，抑菌圈≥12mm
[0058]
实施例7：屎肠球菌对母驴繁殖性能的影响
[0059]
鉴于屎肠球菌dk
‑
01具有较好的ph耐受性、耐胆盐性能和抑菌性能，本发明将屎肠球菌dk
‑
01应用于后备母驴饲料中。
[0060]
1、菌粉的制备
[0061]
将屎肠球菌dk
‑
01活化后，放入发酵罐扩大培养，经发酵、离心、浓缩、低温喷雾干燥，制成活菌含量约为1
×
10
10
cfu/g的菌粉。
[0062]
2、试验方案
[0063]
试验地点：山东省禹城市某规模化驴场。
[0064]
试验分组：选择200头4岁龄左右、健康无病、体况中等、体重接近的后备德州母驴，分为对照组和益生菌组。对照组为饲喂常规饲料，益生菌组为按1
‰
的比例添加屎肠球菌dk
‑
01菌粉，试验期为配种前30天至配种后30天。
[0065]
配种方法：母驴通过人工授精进行受孕，全部由一名配种员操作，经直肠触诊适于输精时，用输精管进行子宫体输精，隔日继续输精至发情结束。
[0066]
养殖试验结束后，利用b超直肠孕检，对配种后的母驴进行早期妊娠鉴定，结果发现益生菌组母驴受孕率为57％，对照组母驴受孕率为45％，饲喂屎肠球菌dk
‑
01明显提升了母驴的受孕率(表2)。再取母驴直肠粪便，稀释涂布mrs、lb平板分析对照组和益生菌组直肠粪便中活菌数，分析数据后发现，饲喂益生菌后母驴肠道中乳酸菌数明显增加，提升了约4倍(参见图6)，改善了肠道菌群平衡和肠道健康。由此可见，屎肠球菌dk
‑
01的饲喂可能是通过改善母驴肠道菌群，从而提升母驴健康状况，进而提高了母驴受孕率及繁殖性能。
[0067]
表2屎肠球菌dk
‑
01对母驴受孕率的影响
[0068][0069]
综上，本发明筛选的驴源屎肠球菌dk
‑
01，具有较好的ph耐受性、耐胆盐性能和抑菌性能，且安全性高，可作为饲料添加剂改善母驴的肠道菌群平衡，提升母驴的受孕率，进而改善母驴的繁殖性能，有利于增加母驴养殖的经济效益。
[0070]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。