一种限制性酶解制备的多肽纳米纤维及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于功能性纳米生物制品领域，具体涉及一种限制性酶解制备的多肽纳米纤维制备方法与应用。


背景技术：

2.纳米纤维是一种高纵横比的纳米结构，其结构独特，具有优秀的生物活性物质和高离子荷载能力和强耐破裂的特性，常常被广泛用作药物或敏感性营养物质的递送载体。蛋白质自组装形成的原纤维呈细长状，原纤维延伸生长形成网状结构，可以增加溶液的黏度和凝胶能力，可用于食品加工生产中的增稠剂和胶凝剂以及泡沫稳定剂，扩宽其食品领域的应用。
3.研究人员常常使用乳清蛋白、酪蛋白、玉米蛋白、豌豆蛋白等食品原料制备纳米纤维结构。但是，纳米纤维制备需要在强酸性条件下进行长时间高温加热处理，使其结构发生改变，耗能严重，违背绿色生产和可持续发展，限制其工业化生产和加工。而酶解是一种被广泛用于各种动植物蛋白改性的方法，具有反应条件温和、安全可控、无环境污染、产物安全性高等特点，且在可控酶解下可以降低制备条件的苛刻，制备具有良好抗氧化能力的肽纳米纤维，分散性强，稳定性高，抗氧化性能强，且具备良好的生物相容性和生物降解性。此外，经酶解处理制备得到的纳米纤维已被证实具有多种生理活性，如抗氧化、提高生物活性物质溶解度、促进矿物质吸收等优点。
4.根据ting li报道，在ph2下，经过90℃、24h的酸热处理，豆类蛋白质严密的类球状结构破坏，蛋白质亚基发生水解，形成长度约500nm的纤维结构；而90℃、6h的酸热处理仅产生100nm的原纤维结构，表明酸性条件长时间加热形成长纤维结构，但是长时间的酸热处理产生大量能源损耗，违背绿色生产原则，不利于工业化加工。本专利利用生物酶解技术，通过限制性酶解手段修饰蛋白质结构，蛋白质发生部分降解，产生大量高溶解性和强抗氧化性的小肽组分。依靠ph驱动，小肽组分形成60
‑
300nm的纳米颗粒，通过短时加热，即能制备大豆蛋白肽纳米纤维。通过酶解技术修饰后的纤维结构，可广泛应用于食品和医药领域中药物或敏感性营养物质的递送载体。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种限制性酶解制备多肽纳米纤维的方法与应用。
6.本发明的首要目的在于提供一种由限制性酶解技术制备的多肽纳米纤维。
7.本发明的另一目的在于提供上述多肽纳米纤维的制备方法。
8.本发明的再一目的在于提供上述多肽纳米纤维的应用。
9.本发明通过酶解技术处理蛋白质有望为新型多肽纳米纤维的制备提供新途径。
10.本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
11.本发明提供的一种限制性酶解制备多肽纳米纤维的方法，包括以下步骤：
12.一种限制性酶解制备多肽纳米纤维的方法，包括以下步骤：
13.(1)将蛋白质加入水中，搅拌均匀得到蛋白分散液；调节ph值为1.0
‑
9.0；加入限制性酶，在搅拌状态下加热处理，离心，得到酶解后的溶液，控制其水解度在2％
‑
10％；调节ph值为2.0
‑
8.0，加热灭酶，离心处理，得到上清液，将上清液干燥得到多肽纳米颗粒；
14.(2)将不同尺寸的多肽纳米颗粒加入水中，搅拌均匀得到多肽纳米颗粒分散液；调节ph值为1.0
‑
4.0，在4℃下，水化4
‑
24h，在恒速搅拌状态下，将纳米颗粒分散液水浴加热处理，然后将其冷却，使其纤维化进程中断，离心处理，得到上清液，将上清液干燥即得活性多肽纳米纤维。
15.进一步地，步骤(1)所述蛋白质为大米蛋白、豌豆蛋白、乳清蛋白、土豆蛋白、绿豆蛋白、大豆蛋白和糙米蛋白等中的一种。
16.进一步地，步骤(1)所述蛋白质与水的质量体积比为1
‑
10:100(g/ml)。优选地，所述蛋白质与水的质量体积比为2
‑
6:100(g/ml)；进一步优选，所述蛋白质与水的质量体积比为4:100(g/ml)。
17.进一步地，步骤(1)所述限制性酶为胰酶、alcalase、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶及菠萝蛋白酶等中的一种；进一步地，步骤(1)所述限制性酶的添加量为步骤(1)所述蛋白质质量的0.05
‑
1％，优选地，所述限制性酶的添加量为蛋白质质量的0.1
‑
0.5％。
18.优选地，步骤(1)所述调节蛋白液的ph值，使调节后蛋白液的ph值为2
‑
8。进一步地，步骤(1)所述搅拌状态下的搅拌速率为140
‑
170rpm，优选地，搅拌状态下的搅拌速率为150
‑
160rpm。
19.进一步地，步骤(1)所述加热处理的温度为35
‑
60摄氏度，优选地，加热处理的温度为37
‑
55摄氏度；步骤(1)所述加热处理的时间为0.5
‑
2h，优选地，加热处理的时间为0.5
‑
1h。
20.进一步地，步骤(1)所述酶解后的溶液水解度为2
‑
10％，优选地，酶解后的溶液水解度为3
‑
8％。
21.进一步地，步骤(1)所述灭酶处理的温度为80
‑
100摄氏度，灭酶处理的时间为5
‑
15min；优选地，灭酶处理的温度为90
‑
100摄氏度，灭酶时间为8
‑
12min；进一步优选，灭酶处理的温度为100摄氏度，灭酶处理的时间为10min。
22.进一步地，步骤(1)所述肽纳米颗粒的粒径为60
‑
300nm，优选70
‑
200nm。
23.进一步地，步骤(2)中，所述不同尺寸的肽纳米颗粒的粒径为70
‑
200nm。
24.进一步地，步骤(2)所述肽纳米颗粒与水的质量体积比为1
‑
10:100(g/ml)；优选地，所述肽纳米颗粒与水的质量体积比为1
‑
4:100(g/ml)；进一步优选，所述肽纳米颗粒与水的质量体积比为2:100(g/ml)。
25.进一步地，步骤(2)所述调节ph值1.0
‑
7.0，优选地，可以调节纳米颗粒溶液的ph值为1.0
‑
4.0，进一步地，优选调节ph值为2.0；
26.进一步地，步骤(2)所述在搅拌状态下的搅拌速率为100
‑
150rpm，优选地，在搅拌状态下的搅拌速率为120
‑
130rpm。
27.进一步地，步骤(2)所述加热处理的温度为60
‑
100摄氏度，优选地，加热处理的温度为80
‑
100摄氏度。
28.进一步地，步骤(2)所述加热处理的时间为3
‑
24h，优选地，加热处理的时间为3
‑
12h，进一步地，加热处理时间为6h。
29.优选地，步骤(2)所述离心处理的速率为7000
‑
9000rpm，离心处理的温度为18
‑
22摄氏度，离心处理的时间为12
‑
18min；进一步优选，离心处理的温度为20摄氏度，离心处理的时间为15min，离心处理的转速为8000rpm。
30.进一步地，步骤(2)所述的纳米纤维的长度100nm
‑
500nm,直径为1
‑
10nm。
31.本发明提供一种由上述的制备方法制得的肽纳米纤维。
32.本发明提供所述肽纳米纤维能够应用于食品和医药领域中药物或敏感性营养物质的递送载体。
33.与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
34.(1)本发明提供的制备方法，利用限制性酶解技术制备肽纳米颗粒，制备得到形态均一的多肽纳米颗粒。将其与水按照一定质量浓度配置为多肽分散液，调节ph，进行长时间的加热处理，形成具有良好稳定性和高比表面积的肽纳米纤维。
35.(2)本发明采用具有良好生物降解性和生物可容性的植物蛋白质为原料，酶解改善纳米纤维苛刻的制备条件，工艺简单，绿色安全，无毒副作用，具有较好的工业化前景。
附图说明
36.图1为实施例1中风味蛋白酶酶解大豆蛋白制备的肽纳米纤维的透射电镜图。
37.图2为对比例1中肽纳米颗粒的透射电镜图。
具体实施方式
38.以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
39.对比例1
40.提供得一种制备纳米纤维的方法，包括以下步骤：配置2％蛋白浓度的大豆蛋白纳米颗粒溶液，使用2mhcl调节ph至2，水化过夜。第二天，将大豆分离蛋白溶液于90℃恒温加热5h，冰浴冷却，设置8000rpm，20min，4℃离心条件进行离心，将上清液冷冻干燥，即制备得到蛋白纳米纤维。
41.实施例1
42.提供的一种限制性酶解制备肽纳米纤维的方法，包括以下步骤：配置蛋白质量浓度为2％的大豆蛋白分散液，使用2mnaoh调节ph为7，加入蛋白质量的0.5％的风味蛋白酶，55℃恒温加热2h，灭酶离心，将上清液冷冻干燥即得肽纳米颗粒。配置2％蛋白浓度的肽纳米颗粒溶液，使用2m hcl调节ph至2，水化过夜。第二天，将纳米颗粒溶液于90℃恒温加热5h，冰浴冷却，设置8000rpm，20min，4℃离心条件进行离心，将上清液冷冻干燥，即制备肽纳米纤维。
43.实施例2
44.提供的一种限制性酶解制备肽纳米纤维的方法，包括以下步骤：配置蛋白质量浓
度为4％的大豆蛋白，使用2mnaoh调节ph为8，加入蛋白质量的0.5％的碱性蛋白酶，55℃恒温加热2h，灭酶离心，制备纳米颗粒。配置2％蛋白浓度的纳米颗粒溶液，使用2m hcl调节ph至2，90℃恒温加热5h后，冰浴冷却，设置8000rpm，20min，4℃离心条件进行离心，将上清液冷冻干燥，即制备得到纳米纤维。
45.实施例3
46.提供的一种限制性酶解制备活性蛋白纳米纤维的方法，包括以下步骤：配置质量浓度为2％的大豆蛋白，使用2m hcl调节ph为2，加入蛋白质量的0.5％的胃蛋白酶，37℃下水浴加热2h，灭酶离心，制备纳米颗粒。配置2％蛋白浓度的纳米颗粒溶液，使用2mhcl调节ph至2，90℃恒温加热5h后，冰浴冷却，设置8000rpm，20min，4℃离心条件进行离心，将上清液冷冻干燥，即制备肽纳米纤维。
47.实施例4
48.提供的一种限制性酶解制备活性蛋白纳米纤维的方法，包括以下步骤：配置质量浓度为2％的大豆蛋白，使用2mnaoh调节ph为7.5，加入蛋白质量的0.5％的胰酶，37℃下恒温加热2h，灭酶离心，制备纳米颗粒。配置2％蛋白浓度的纳米颗粒溶液，使用2mhcl调节ph至2，90℃恒温加热5h，冰浴冷却，设置8000rpm，20min，4℃离心条件进行离心，将上清液冷冻干燥，即制备纳米纤维。
49.将实施例2
‑
5中制备的肽纳米纤维和对比例1中的大豆蛋白纳米纤维进行如下评价，结果见表1。
50.水解度的测定：取3ml opa试剂(含0.8mg/ml opa，38.1mg/ml四硼酸钠，1mg/ml sds，0.88mg/ml dtt，溶剂为去离子水)加入到400μl蛋白分散液(蛋白浓度为0.5mg/ml)中，避光反应2min，测定340nm处的吸光度。计算公式如下：
51.ser nh2＝[(a
样品
‑
a
空白
)
×
0.9516]/[(a
丝氨酸
‑
a
空白
)
×
c
样品
]
[0052]
水解度(％)＝(ser nh2
‑
β)/(α
×
htot)
×
100％。
[0053]
式中，a空白和a丝氨酸分别为去离子水和丝氨酸标准溶液代替样品的吸光度；0.9516为丝氨酸标准溶液的浓度，单位为mmol/l；α、β和htot均为常数，对于大豆蛋白，α为0.970，β为0.342，htot为7.8。
[0054]
粒径和聚合物分散性指数(pdi)的测定：采用纳米粒度电位仪(malvern nano
‑
zs)测定所获得的纳米颗粒的平均粒径和pdi。
[0055]
透射电子显微镜(ht7700)观察分析：将肽纳米纤维分散液稀释到蛋白浓度为0.1mg/ml，吸取10ul稀释液于微栅铜网，酒精灯下放置2min后，用滤纸吸走多余样品，随后向铜网上滴10ul的磷钨酸染液(1mg/ml)，染色60s后，使用滤纸吸走过量染色液，待干燥后在透射电子显微镜下观察并拍照。选取风味蛋白酶限制性酶解制备的肽纳米颗粒和大豆蛋白纳米纤维于透射电子显微镜下进行观察和拍照。所拍摄的透射电镜图分别如图1和图2所示。
[0056]
由图1所示，风味蛋白酶限制性酶解制备的多肽纳米颗粒(实施例1)为均匀的球状颗粒。
[0057]
由图2所示，多肽纳米颗粒制备的纳米纤维，以直径5nm,长度500nm的卷曲状纤维分布。
[0058]
由表1可知，实施例1
‑
5所得活性蛋白纳米颗粒平均粒径在70
‑
150nm，纤维直径为
3
‑
10nm，长度为100
‑
1000nm。
[0059]
表1
[0060][0061]
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。