一种芋螺多肽、多肽组合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及化妆品制备技术领域，具体而言，涉及一种芋螺多肽、多肽组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着经济社会的发展和生活水平的提高，大众对健康服务的需求日益增加，其中医美方向的消费投入势头强劲。按收入计算，2018年中国已经成为全球第二大医疗美容服务市场，收入达到183.79亿美元，占全球医疗美容服务市场约13.5％的市场份额。目前医美行业广泛使用肉毒杆菌(botox)进行皮肤抗皱。其抗皱机理是通过阻断神经与肌肉之间的信号传递，减少肌肉牵拉而引起的动态表情纹。然而，并非所有人在注射botox后均可达到除皱的效果，同时还可能伴有面部肌肉麻痹无力，肌肉萎缩，吞咽困难等不良反应。因此改造、合成新型的肽类祛皱产品具有广阔的应用前景。
3.芋螺毒素是从芋螺属(conus)的毒液中分离纯化出的一组生物活性多肽，又称芋螺肽。芋螺毒素大多由10至40个氨基酸残基组成，含有一个或多个二硫键，具有分子质量小、作用靶点专一及活性强等优点。它们能特异性地作用于电压门控离子通道和配体门控离子通道，是神经生物学研究的重要分子探针，也是发展新型药物的先导分子。
4.根据芋螺毒素的药理学作用靶点，可分为α、μ、ω、κ、δ、ψ、σ、ρ、γ、加压素、惊厥剂和睡眠肽等药理家族。其中μ
‑
芋螺毒素能专一阻断电压门控钠离子通道，进而抑制动作电位的产生。μ
‑
芋螺毒素的二硫键骨架连接方式为“c1
‑
c4，c2
‑
c5，c3
‑
c6”，目前已分离到20多种μ
‑
芋螺毒素，它们主要作用于骨骼肌钠通道nav1.4(ic50＝50nm)，同时也可以作用于脑钠通道nav1.2(ic50＝690nm)，心肌钠通道nav1.5(ic50＝10μm)和痛觉相关钠通道(nav1.7,nav1.8)。
5.基于μ
‑
芋螺毒素在骨骼肌钠通道nav1.4上的显著的效果，可以推断这类多肽可以提供非常强效的肌肉松弛作用，即提供迅速即时的抗皱效果。目前已经有商品化的芋螺抗皱多肽—xep
‑
018。在各种抗衰老的个人护理品中均可应用，例如：眼部护理，可明显去除眼部皱纹和眼角鱼尾纹；面部护理，可明显去除前额由于肌肉收缩而产生的皱纹。
6.目前，现有的μ
‑
芋螺多肽用于药品、化妆品等产品时存在如下缺陷：
7.(1)对骨骼肌钠通道nav1.4的过度抑制导致面部肌肉僵硬瘫痪；(2)对于骨骼肌、心肌钠通道的抑制造成的正常膜电信号的紊乱，产生严重不良反应。
8.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种芋螺多肽、多肽组合物及其制备方法和应用以解决上述技术问题。
10.本发明是这样实现的：
11.本发明提供了一种芋螺多肽，芋螺多肽具有如seq id no.1所示的序列。
12.本发明提供的芋螺多肽是一种含三对二硫键的紧密折叠小肽，含一个α螺旋、一个β发夹和数个转角组成的紧密csαβ模体(cysteine stablilizedαβmotif)，arg、lys是关键氨基酸。其氨基酸全序列的一级结构为：
13.n
‑
asn
‑
gly
‑
ile
‑
cys
‑
cys
‑
gly
‑
phe
‑
pro
‑
arg
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cys
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arg
‑
asn
‑
cys
‑
lys
‑
pro
‑
his
‑
arg
‑
cys
‑
cys
‑
c。
14.该芋螺多肽是在野生型的μ
‑
芋螺多肽(μ
‑
conotoxin)piiia上进行氨基酸残基突变，适度弱化了μ
‑
芋螺多肽对钠通道的阻滞作用，同时兼顾在酸性和碱性条件下保持稳定，保持了等电点稳定和靶点专一。
15.发明人发现野生型的μ
‑
芋螺多肽存在多对氨基酸残基可以与骨骼肌钠通道nav1.4直接相互作用，发明人对μ
‑
芋螺多肽的几个带正电氨基酸残基进行突变，降低了μ
‑
芋螺多肽的活性，但仍保持其部分抑制骨骼肌nav1.4通道的功能，保留了必要的神经冲动传导，达到适度放松肌肉效果。
16.具体地，发明人对野生型μ
‑
芋螺多肽上选择和骨骼肌nav1.4通道有相互作用的第2位、第12位精氨酸r同时改造为甘氨酸g；同时为了保持等电点稳定和靶点专一，将第1、15位谷氨酰胺q改造为天冬酰胺n，第3位亮氨酸改造为异亮氨酸，第17位赖氨酸k改造为精氨酸r，进而得到设计改造的多肽piiia2(即为本发明中的芋螺多肽)。
17.seq id no.1所示的多肽piiia2，序列长度为22个氨基酸，等电点为8.98，相对分子质量为2398.81da，而野生型piiia(野生型μ
‑
芋螺多肽)的等电点为9.49，分子量为2597.13da。
18.本发明还提供了一种芋螺多肽或其盐在制备用于预防和/或治疗皱纹的产品中的应用，芋螺多肽具有如seq id no.1所示的序列。
19.发明人发现，经过突变后的芋螺多肽或其盐保持了较强的抗皱功能，采用突变后的芋螺多肽可以避免对骨骼肌钠通道nav1.4的过度抑制导致面部肌肉僵硬瘫痪，同时，还显著降低了对心肌钠通道、脑钠通道抑制的风险。
20.在本发明应用较佳的实施方式中，上述产品为药品或化妆品。化妆品是指以涂抹、喷洒或者其他类似方法，散布于人体表面的任何部位，如皮肤、毛发、指趾甲、唇齿等，以达到清洁、保养、美容、修饰和改变外观，或者修正人体气味，保持良好状态为目的的化学工业品或精细化工产品。
21.芋螺多肽的盐包括不限于乙酸盐、柠檬酸盐等。
22.本发明还提供了一种芋螺多肽或其盐在制备钠离子通道抑制产品中的应用，芋螺多肽具有如seq id no.1所示的序列。
23.在一种实施方式中，上述钠离子通道为nav1.4通道。
24.在本发明应用较佳的实施方式中，上述产品为药品或化妆品。
25.本发明还提供了一种多肽组合物，其包括上述的芋螺多肽、化妆品辅料和其他化妆品原料。
26.在本发明应用较佳的实施方式中，上述化妆品辅料选自如下至少一种的辅料：
27.保湿剂、乳化剂、矿物油、植物油、增稠剂、ph调节剂和防腐剂。
28.在一种实施方式中，保湿剂选自如下至少一种的物质：甘油、多元醇、透明质酸钠、神经酰胺、海藻糖、聚山梨醇酯
‑
30、氨基酸保湿剂。需要说明的是，上述甘油即可作为保湿
保润剂，也可作为抗氧化剂。
29.在一种实施方式中，上述乳化剂选自羊毛脂。在其他实施方式中，上述乳化剂可以选自聚甘油
‑
10硬脂酸酯、辛基聚甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷、聚甲基硅倍半氧烷、巴巴苏籽油、植物甾醇油酸酯等。
30.增稠剂选自如下至少一种的物质：卡波姆，羟乙基纤维素和黄原胶。在其他实施方式中，增稠剂也可选自丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物。
31.ph调节剂选自如下至少一种的物质：柠檬酸、柠檬酸钠、乳酸、乳酸钠、三乙醇胺和精氨酸。
32.防腐剂选自如下至少一种的物质：1,2
‑
己二醇、对羟基苯乙酮(馨鲜酮)和乙基己基甘油。
33.在本发明应用较佳的实施方式中，其他化妆品原料选自如下至少一种的物质：多肽物质、植物提取物、细胞因子和维生素。
34.在一种实施方式中，上述多肽物质选自如下至少一种的物质：肌肽、五肽
‑
3、谷胱甘肽、鹅肌肽和蛇肉肽。
35.植物提取物选自如下至少一种的物质：燕麦仁提取液、铁皮石斛提取物。
36.维生素选自如下至少一种的物质：维生素b3、维生素c和维生素e。
37.细胞因子选自如下至少一种的物质：表皮生长因子(egf)和神经生长因子(vgf)。在其他实施方式中，细胞因子还可以选择其他的具有明确功能和结构的蛋白或多肽。
38.上述化妆品辅料和化妆品原料的配比可以根据需要进行自适应组合。
39.本发明还提供了一种芋螺多肽的制备方法，其包括如下步骤：采用固相合成的方法或原核重组表达的方法合成芋螺多肽。
40.在本发明应用较佳的实施方式中，当采用固相合成的方法时，先合成芋螺多肽的粗多肽，然后将粗多肽进行高级结构的复性折叠；
41.优选地，复性折叠是采用谷胱甘肽氧化还原法复性；
42.优选地，制备方法还包括将复性折叠的多肽进行纯化；
43.优选地，纯化是通过hplc反相柱层析脱盐纯化。
44.当采用原核重组表达的方法合成芋螺多肽时，需要先构建原核表达质粒，在大肠杆菌中进行表达，再进行后续的分离纯化。
45.本发明具有以下有益效果：
46.本发明在野生型的μ
‑
芋螺多肽(μ
‑
conotoxin)piiia上进行氨基酸残基突变，适度弱化了μ
‑
芋螺多肽对钠通道的阻滞作用，同时兼顾在酸性和碱性条件下保持稳定，保持了等电点稳定和靶点专一。本发明提供的新型芋螺多肽兼具稳定、生产成本低等特点。经过突变后的芋螺多肽或其盐保持了较强的抗皱功能，采用突变后的芋螺多肽可以避免对骨骼肌钠通道nav1.4的过度抑制导致面部肌肉僵硬瘫痪，同时，还显著降低了对心肌钠通道、脑钠通道抑制的风险。
附图说明
47.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对
范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
48.图1为芋螺多肽piiia和骨骼肌钠通道nav1.4结构模拟图；
49.图2为野生型和突变型多肽的功能检测结果图；
50.图3为本发明提供的多肽piiia2的抗皱效果图。
具体实施方式
51.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
52.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
53.本发明的目的是通过结构改造和设计，提供一种安全可靠、疗效确切、稳定性好、易于生产的用于皮肤抗皱的多肽产品。在副作用较高的芋螺多肽(μ
‑
conotoxin piiia)基础上，使用结构模拟软件rosetta模拟piiia(图1a)和骨骼肌钠通道nav1.4(图1b&c)的三维结构，分析高亲和力的复合物模型，得到了多对piiia多肽和nav1.4通道关键氨基酸残基的直接相互作用，直接相互作用的氨基酸残基参照下表1所示：
54.表1直接相互作用的关键氨基酸残基列表。
55.piiiar2r12r14k17r20nav1.4w761e758e755d1241d1541
56.从上表中的信息分析可以得出：
57.(1)芋螺多肽μ
‑
conotoxin piiia和骨骼肌钠通道nav1.4可能存在多对相互作用，这些氨基酸直接相互作用是piiia在钠通道上高亲和力的基础；
58.(2)通过对piiia上带正电氨基酸残基进行突变，可以适度弱化piiia对钠通道的阻滞作用，同时兼顾在酸性和碱性条件下保持稳定；
59.(3)在野生型piiia上选择和骨骼肌nav1.4通道有相互作用的第2位、第12位精氨酸r同时改造为甘氨酸g；同时为了保持等电点稳定和靶点专一，将第1、15位谷氨酰胺q改造为天冬酰胺n，第3位亮氨酸改造为异亮氨酸，第17位赖氨酸k改造为精氨酸r，进而得到设计改造的多肽piiia2。
60.实施例1
61.本实施例提供了一种芋螺多肽(piiia2)，其其氨基酸全序列的一级结构为：
62.n
‑
asn
‑
gly
‑
ile
‑
cys
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cys
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gly
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phe
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pro
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‑
asn
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lys
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pro
‑
his
‑
arg
‑
cys
‑
cys
–
c，是一种含三对二硫键的紧密折叠小肽。
63.制备方法如下：
64.(1)根据设计的上述氨基酸序列，采用固相合成法合成得到粗多肽(委托吉尔生化合成)；
65.(2)线性多肽高级结构复性折叠。对于合成得到的线性肽采用谷胱甘肽氧化还原法复性，具体包括如下步骤：将10mg步骤(1)合成的线性肽溶解于100ml、ph＝8.0含5mm gsh,0.5mm gssg,0.1m tris hcl,0.1m nacl溶液中，25℃温箱放置24h得到复性液，通过
rp
‑
hplc检测复性效果并收集洗脱峰，通过质谱检测纯度和复性结果。
66.(3)将步骤(2)获得复性液通过hplc反相柱层析脱盐纯化，鉴定其纯度，直到多肽的纯度不低于95％。
67.hplc纯化及鉴定方法：将10ml复性液用0.22μm滤膜过滤，流动相a为0.1％三氟醋酸
‑
水，流动相b为0.1％三氟醋酸
‑
乙腈，待基线平稳后开始上样，色谱柱为硅胶烷基键合相c18柱(4.6mm
×
300mm，胶粒大小5μm，孔径大小为100a)，采用二元流动相梯度洗脱系统，进行线性梯度洗脱，即在200min内，流动相b在洗脱剂中的含量从0％
‑
100％按线性关系增长，流速1ml/min，检测波长280nm，25℃下测定。
68.(4)通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi
‑
tof)测定收集到的单峰，复性后的分子量为2392da；
69.测定方法如下：将步骤(4)纯化后的多肽溶于去离子水中，配置成1μm的溶液，取10μl与等体积的饱和基质溶液(将α
‑
氰基
‑4‑
羟基肉桂酸溶于含0.1％三氟醋酸的50％乙腈溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清液)混合后测定。
70.(5)通过等电聚焦电泳测定纯化后的多肽的等电点为8.98，并采用自动氨基酸测序仪测定纯化后多肽的氨基酸序列结构，确定为ngiccgfprscgsrnckphrcc(seq id no.1)。
71.实验例1
72.本实验例测试实施例1制备的皮肤抗皱多肽piiia2在脂性物质中的分散性。
73.以多肽piiia2在羊毛脂中均一性和分散性测定为例。取羊毛脂1000g、piiia2多肽1000mg，室温与shw/r型移动式高剪切乳化机中混合均匀，搅拌速度120rpm/min，搅拌30分钟。混匀后，分装成5ml每管。这种条件下piiia2的理论含量为1mg/g。取分装20管，精密称取适量1g混合物(约相当piiia2 0.1mg 10ml)量瓶中，加20％乙醇溶液，使溶解(必要时超声使溶解)并稀释至刻度，精密量取2ml用folin酚发进行蛋白定量。
74.实验结果表明20份样品中piiia2的平均含量为0.90
±
0.05mg/g，且每份样品含量范围均在理论含量的90％以内。表明本发明设计的piiia2在脂性环境中具有很好的分散性。也即抗皱肽piiia2可用于抗皱护肤品的开发。
75.实验例2
76.本实验例测试实施例1制备的皮肤抗皱多肽piiia2电生理功能。
77.电压门控钠离子通道的记录模式是胞外高钠体系，细胞外液为(mm)：140 nacl,3 kcl,1 mgcl2,1 cacl2,10 hepes naoh调ph至7.3；细胞内液为(mm):140 csf,1 egta,10 nacl,3 kcl,10 mgcl
2 csoh调ph至7.3。钠离子通道的记录方式是钳制电压80mv 20ms；测试电压10mv 50ms；钳制电压80mv 20ms，这种记录不断循环重复直至电流稳定。将瞬时表达有nav1.4的细胞置于rsc
‑
200(biologic)快速灌流加药系统的8联管前，先打开bath solution通道，通过切换不同的通道，分别给予100nm野生型piiia(由吉尔生化合成)，100nm突变型piiia2。
78.结果参照图2所示，可以看到野生型piiia完全抑制nav1.4的电流(图2a)；突变型piiia2部分抑制了nav1.4的电流(图2b)，抑制约90％，保留了10％左右的肌肉电流传导。同时该浓度下的piiia2，对其他承担重要生理功能的钠通道，例如nav1.2(图2c),nav1.5(图2d),nav1.7(图2e)几乎没有活性(图2c
‑
e)；而野生型piiia在nav1.2(图2f),nav1.5(图2g),nav1.7(图2h)均有抑制效果(图2f
‑
h)，因此改造后的多肽保证了靶点专一性。
79.由上述结果可知，发明人通过创造性的设计和改造，使得多肽具有适度抑制肌肉收缩的功能，且不会作用于nav1.2,nav1.5,nav1.7等其它离子通道而产生严重副作用。
80.实验例3
81.本实验例测试实施例1制备的皮肤抗皱多肽piiia2细胞毒性。
82.本实验例具体用mtt法检测该抗皱肽piiia2对人皮肤成纤维细胞hff
‑
1毒性。
83.人皮肤成纤维细胞hff
‑
1购于昆明细胞库。先将成纤维细胞于含有15％胎牛血清以及双抗(青霉素和链霉素各100u/ml)的dmem中培养，待细胞长满后，用0.25％的胰蛋白酶进行消化，用上述培养基洗两次，重新悬浮细胞，细胞计数后将细胞悬浮液100μl加入到96孔细胞培养板中，使每孔细胞数达到105个。加入实施例1制备的皮肤抗皱多肽piiia2，对照组加入相同体积的灭菌超纯水，置37℃，5％co2培养箱内培养24h。培养结束后，96孔细胞培养板每孔加入20μl 5mg/ml mtt溶液(用细胞培养pbs缓冲液配制)，继续培养5h，用注射器吸出孔中液体，每孔加入100μl dmso，用移液枪吹打几次使紫色结晶完全溶解。然后使用酶标仪检测光吸收，测定波长为490nm，参考波长为630nm。
84.表2抗皱肽piiia2对hff
‑
1细胞的毒性统计表。
85.piiia2浓度(μg/ml)细胞毒性％10.00501.22
±
0.22002.16
±
0.3
86.结果如表2所示，表明抗皱肽piiia2浓度为160μg/ml时的细胞毒性只有5.14％，说明抗皱肽piiia2对人皮肤成纤维细胞细胞毒性非常小，对人体正常皮肤细胞不会产生伤害，因此十分利于其进一步的开发应用。
87.实验例4
88.本实验例测试实施例1制备的皮肤抗皱多肽piiia2的抗皱功能。
89.本实验例测定了皮肤抗皱肽piiia2对uvb照射引起的皱纹的影响。通过改变紫外线照射时间来控制照射到每只小鼠背侧的uvb能量。每只小鼠的最小红斑剂量(med)约为36mj/cm2。每天将piiia2(10ng和100ng/只小鼠)局部涂抹于每只小鼠背部，持续12周。uvb的初始剂量设定为36mj/cm2，随后在第1
‑
4周增加到54mj/cm2，在第4
‑
7周增加到72mj/cm2，在第7
‑
10周增加到108mj/cm2，最后在第10
‑
12周增加到122mj/cm2。uvb照射的频率设定为每周三次，然后局部施用赋形剂(本实验例中赋形剂选自羊毛脂，作为空白对照和紫外对照)和piiia2。
90.在该方案中，从uvb照射开始后6周左右，肉眼开始观察背部区域的皱纹(图3)。为了评估uvb照射后皱纹的形成，在6周和9周时用戊巴比妥(50mg/kg体重)腹腔注射麻醉每只无毛小鼠，根据分级标准，评估皱纹形成的程度(表3)。
91.分级评分标准如下：0无粗糙皱纹；2观察到背部皮肤区域有一些浅而粗糙的皱纹(bisset 1级)；4在整个背部皮肤上观察浅而粗糙的皱纹(bisset 2级)；6在背部皮肤上观察到一些深而长的皱纹(bisset's 3级)。
92.表3结果表明，与对照组相比，实施例1设计的抗皱多肽piiia具有良好的抗皱效果。
93.表3抗皱多肽piiia2的抗皱效果评分
94.组别空白对照紫外对照piiia2(10ng)piiia2(100ng)6周皱纹评分0.0
±
0.03.93
±
0.621.23
±
0.21**2.31
±
0.34**9周皱纹评分0.0
±
0.04.84
±
0.541.44
±
0.32**2.62
±
0.46**
95.**p<0.05
96.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。