一种棘孢木霉及其在防治玉米害虫中的应用

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种棘孢木霉及其在防治玉米害虫中的应用。


背景技术：

2.玉米含有大量的甜份，含糖量较高，是玉米螟主要危害的农作物之一，也是影响我国玉米生产的最主要的虫害。由于我国玉米新品种的扩大种植，尤其是甜玉米的种植面积与以往相比有很大的幅度的增加，其含糖量比一般玉米明显提高，更容易遭受玉米螟等害虫的侵害。随着气候变暖、栽培模式、作物布局的变化、栽培品种的更替，玉米螟呈的发生规律也出现了显著的变化，很多玉米产区呈偏重发生。我国玉米螟主要为亚洲玉米螟(ostrinia furnacalis)和欧洲玉米螟(o.nubilalis)，其中亚洲玉米螟普遍发生,平均发生面积为2.8亿亩。目前玉米螟生物防治主要依靠苏瓜云金杆菌和白僵菌，但玉米螟较容易产生对苏云杆菌制剂的抗性，白僵菌在玉米心叶撒施费工费时，防效并不十分理想。更为突出的问题是2代玉米螟常加重穗腐病的发生，而苏云金杆菌和白僵菌很难产生对穗腐病镰孢菌侵染的抑制作用，因此寻找具有病虫兼治的生防菌具有重要意义。
3.木霉菌(trichoderma sp.)是国际上公认的生物防治微生物，在植物真菌病害的生物防治中具有广泛的应用。在玉米病害防治中已大量应用于防治土传病害，例如：立枯丝核菌侵染引起的纹枯病、镰孢菌及腐霉菌侵染引起的根腐病、茎腐病等；同时发现木霉菌还能诱导玉米产生对玉米叶斑病和穗腐病的抗性，可实现土传病害与气传病害的一体化防控。由于玉米一些玉米病害和虫害经常同时发生，例如玉米根腐病、茎腐病发和地下害虫为害，玉米穗腐病发生和玉米螟为害等，因此如何协同防治玉米病虫害已成为生产中急需解决的技术难题。研究表明：昆虫病原真菌如球孢白僵和绿僵菌通过在中肠产生几丁质酶破坏中肠结构，已有大量报导。木霉菌产生的一系列的细胞壁降解酶水解植物病原真菌的细胞壁，其中几丁质酶是主要的降解酶类之一。本发明发现：能够降解植物病菌细胞壁几丁质的木霉几丁质酶也可降解害虫的中肠细胞壁。不仅如此，木霉菌在防治植物病害中还能诱导植物防御反应基因，如茉莉酸/乙烯(ja/et)信号的表达，而ja/et已证明是作物抗害虫侵染的重要防御信号分子，因此通过木霉产生的细胞壁降解酶多功能性及对作物ja/et信号的诱导实现对玉米病虫害的协同防治是完全可能的。由于木霉菌是国际公认的生物农药或生物肥料的重要资源真菌，因此开发兼有防虫和防病功能的木霉源生物农药或生物肥料，对于实现玉米病虫害一体化绿色防控具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提出一种棘孢木霉及其在防治玉米害虫中的应用。
5.本发明的技术方案是这样实现的：
6.本发明提供一种棘孢木霉，棘孢木霉为棘孢木霉(trichoderma asperelum)gdsf1009,其已于2014年8月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
保藏号为cgmcc no.9512。
7.本发明进一步保护一种上述的棘孢木霉的应用，所述棘孢木霉在防治玉米害虫中的应用。
8.本发明的棘孢木霉应用于通过胃毒作用杀玉米螟幼虫。
9.可选的，所述棘孢木霉制备孢子悬浮液。在pda平板上活化木霉菌，待木霉菌产孢后，用无菌水悬浮木霉菌分生孢子，用血球计数板对孢子计数，制备成107‑
108个/ml的孢子悬液。按照(1.0
‑
1.2):(1.1
‑
1.5)(v/w)的比例与无菌人工饲料混合，喂食二龄亚洲玉米螟幼虫，对照组设定为无菌水按照(1.0
‑
1.2):(1.1
‑
1.5)(v/w)的比例与无菌人工饲料混合。每个处理组30
‑
36头2龄玉米螟幼虫，每个处理重复3次。每天更换处理的人工饲料，避免木霉菌分生孢子的萌发，每天统计死亡率，直至玉米螟幼虫化蛹。平均校正死亡率达35
‑
40％，中肠微生物多样性指数下降，致病的肠球菌增加。
10.可选的，所述棘孢木霉制备木霉几丁质酶发酵液。在pda平板上活化木霉菌，待木霉菌产孢后，用无菌水悬浮木霉菌分生孢子，用血球计数板对孢子计数，制备成107个/ml的孢子悬浮液，将木霉菌孢子悬浮液按照(1
‑
1.5):(95
‑
100)(v/v)的比例接入pd培养基中，28℃，150
‑
180rpm振荡培养2
‑
3d，6层灭菌纱布收集菌丝体，在无菌条件下，将木霉菌菌丝体以(1
‑
1.5):(95
‑
100)(w/v)的比例转接入几丁质酶发酵培养基中(mgso4.7h2o 0.6g/l,feso4.7h2o 0.1g/l,nh4no
3 3.0g/l,kh2po42.0g/l,colloidal chitin 20％v/v)，28℃，150
‑
180rpm恒温摇床培养，每隔2
‑
3d测定几丁质酶活性，待几丁质酶活性达到最高时，将木霉菌几丁质酶发酵液过6层无菌纱布，发酵液上清过微孔滤膜以除去发酵过程中产生的分生孢子，将过滤后的木霉几丁质酶发酵液与玉米螟人工饲料以(1.0
‑
1.2):(1.1
‑
1.5)(v/w)的比例拌种，喂食二龄玉米螟幼虫，对照采用不接木霉菌的空白培养基拌种人工饲料。每组挑选30
‑
36头大小一致的2龄玉米螟幼虫，饥饿24h后喂食不同处理的人工饲料。每个处理重复3次。隔天更换处理的人工饲料，每天统计死亡率，直至玉米螟幼虫化蛹，平均校正死亡率达到40
‑
45％。
11.作为本发明的进一步改进，所述棘孢木霉几丁质酶活性1500
‑
2000u/ml。
12.作为本发明的进一步改进，所述玉米害虫为玉米螟或棉铃虫。
13.作为本发明的进一步改进，所述棘孢木霉对玉米螟中肠的中肠微生态多样性指数下降0.1
‑
0.2。
14.作为本发明的进一步改进，所述中肠微生态多样性指数包括香农指数(shannon
‑
wiener(h))和辛普森指数(simpson(1
‑
d))。
15.作为本发明的进一步改进，所述棘孢木霉对玉米螟中肠的中肠内昆虫致病肠球菌(enterococcus)种群提高80％
‑
90％。
16.作为本发明的进一步改进，所述棘孢木霉对所述玉米螟中肠的防御基因细胞色素p450(cytochrome p450)、热击蛋白(heat shock protein)、转运蛋白(abc transporter)、钙粘着蛋白(cadherin)、肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein)基因表达均被抑制1
‑
4倍。
17.作为本发明的进一步改进，所述所述棘孢木霉对所述玉米螟1
‑
2龄幼虫致死率达到35％
‑
55％。
18.本发明进一步保护一种上述棘孢木霉用于防治玉米螟的方法，包括：
19.s1.将棘孢木霉菌gdsf1009接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)上，在25
‑
28℃下进行活化；
20.s2.在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上繁殖孢子并洗下所述孢子，制成孢子悬浮液；
21.s3.将所述孢子悬浮液接入马铃薯葡萄糖培养基(pd)中，使所述孢子的浓度为105‑
106cfu/ml；
22.s4.将所述孢子振荡培养4
‑
5d，转速为180
‑
200rpm，温度为25
‑
28℃；孢子浓度2
×
107cfu/ml；
23.s5.将孢子悬液0.5
‑
1.0％液加入10l发酵罐的液体发酵培养基中，其组分和重量含量如下：
24.大豆饼粉
‑
玉米粉30
‑
35g/l；
25.甘油
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
8.86ml/l；
26.s6.将所述的木霉液体发酵液初始ph调节为3.26
‑
3.50，转速150
‑
180r/min,温度25
‑
28℃，时间为5
‑
6d，厚垣孢子达到1.75
‑
3.75
×
108个/ml；
27.s7.将所述木霉液体发酵液制备木霉颗粒剂，木霉颗粒剂组分和重量如下：
[0028][0029]
木霉颗粒剂的制备方法为：将所述的木霉颗粒剂的组分按比例混合，搅拌速度40
‑
50r/min，干燥温度为45
‑
50℃，干燥时间为40
‑
60min；
[0030]
s8.将所述的木霉颗粒剂以每亩3
‑
5kg的剂量，在播种前施入土壤，或于化肥混合后施入土壤。在出苗
‑
心叶末期对根部地下害虫、叶片玉米螟和棉铃虫为害的防效性60
‑
70％；在乳熟期对果穗玉米螟的防效45
‑
50％。
[0031]
本发明具有如下有益效果：本发明棘孢木霉能够直接抑制玉米螟幼虫存活，诱导玉米抗玉米螟和棉铃虫等多种害虫，为木霉防治玉米土传病害的同时兼治玉米害虫提供了重要的木霉资源和应用方法，对发展玉米病虫害一体化生物防控新技术、实现玉米绿色和可持续生产具有重要意义。
附图说明
[0032]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0033]
图1为本发明实施例的棘孢木霉gdsf1009的菌落形态及相应的分生孢子梗形态；
[0034]
图2为本发明实施例的棘孢木霉gdsf1009的系统发育树。
具体实施方式
[0035]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0036]
本发明施例提供一种棘孢木霉，为棘孢木霉(trichoderma asperellum)gdsf1009，其已于2014年8月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.9512，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0037]
参见图1，其中a.pda培养菌落，b.ma培养菌落，c和d.分生孢子梗形态，e.瓶梗形态，f.分生孢子形态。菌落形态形成的培养条件为pda培养基上25℃黑暗7d(下同)。不产生扩散性色素，无明显气味，菌落反面为奶油色。分生孢子簇棉絮状，有可见的单个的分生孢子梗分枝，至顶端可育。在分生孢子簇内，分生孢子梗上的瓶梗呈现对称分布，顶端有两个或多个瓶梗，主轴顶端下面生出的初次分枝常对生，与主轴夹角近90
°
。瓶梗典型地产生于初次、二次、三次分枝的顶端，2
‑
3个瓶梗呈旋涡状排列。瓶梗直、安瓿形，仅在中部稍微加粗。分生孢子球形或亚球形或卵圆形，大小为(3.7
‑
6.0)
×
(3.0
‑
5.0)μm(长
×
宽)。所述深绿木霉菌t23的its序列和tef1序列是鉴定该菌株的主要特征依据，其its序列和tef1序列分别见序列表1
‑
2。依据its序列构建的菌株系统发育树见图2。其中，t.hamatum gjs 05
‑
334序列见序列表3，hypomyces perniciosus序列见序列表4，t.asperellum cbs 433.97序列见序列表5，t.asperellum gdfs1009序列见序列表6，t.pubescens gjs 01
‑
207序列见序列表7，t.viride strain gjs 92
‑
14序列见序列表8。
[0038]
本发明实施例提供的棘孢木霉gdsf1009孢子悬液对玉米螟幼虫的胃毒杀虫方法，对玉米螟1
‑
2龄幼虫胃毒作用校正死亡率达35
‑
40％，使玉米螟中肠微生物多样性指数下降0.1
‑
0.2，致病的肠球菌丰度增加80
‑
90％，中肠防御反应基因细胞色素p450(cytochrome p450)、热击蛋白(heat shock protein)、转运蛋白(abc transporter)、钙粘着蛋白(cadherin)、肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein)被抑制1
‑
4倍。
[0039]
步骤1：将棘孢木霉菌gdsf1009菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)上，在25
‑
28℃下进行活化。
[0040]
步骤2：在pda平板上活化木霉菌，待木霉菌产孢后，用无菌水悬浮木霉菌分生孢子，用血球计数板对孢子计数，制备成107‑
108个/ml的孢子悬液。
[0041]
步骤3：按照(1.0
‑
1.2):(1.1
‑
1.5)(v/w)的比例与无菌人工饲料混合，喂食二龄亚洲玉米2龄幼虫，每天统计死亡率，直至玉米螟幼虫化蛹。
[0042]
本发明实施例还提供一种棘孢木霉菌发酵液胃毒作用杀玉米螟方法，包括：
[0043]
步骤1：将棘孢木霉菌gdsf1009菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在25
‑
28℃下进行活化。
[0044]
步骤2：在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上繁殖孢子并洗下所述孢子，制成孢子悬浮液。
[0045]
步骤3：将木霉菌孢子悬浮液按照(1
‑
1.5):(95
‑
100)(v/v)的比例接入马铃薯葡萄糠培养基中，28℃，150
‑
180rpm振荡培养2
‑
3天，6层灭菌纱布收集菌丝体，在无菌条件下，将
木霉菌菌丝体以(1
‑
1.5):(95
‑
100)(w/v)的比例转接入几丁质酶发酵培养基(mgso4.7h2o 0.6g/l,feso4.7h2o 0.1g/l,nh4no
3 3.0g/l,kh2po
4 2.0g/l，胶体几丁质20％v/v)中，28℃，150
‑
180rpm恒温摇床培养，待几丁质酶活性达到最高时，将木霉菌几丁质酶发酵液过6层无菌纱布，发酵液上清过微孔滤膜以除去发酵过程中产生的分生孢子。
[0046]
步骤4：将过滤后的木霉几丁质酶发酵液与玉米螟人工饲料以(1.0
‑
1.2):(1.1
‑
1.5)(v/w)的比例拌种，喂食二龄玉米螟幼虫，每天统计死亡率，直至玉米螟幼虫化蛹。
[0047]
本发明实施例还提供一种棘孢木霉菌颗粒剂防治玉米螟方法，包括：
[0048]
步骤1：，将孢子悬液0.5％
‑
1.0％液加入10l发酵罐的大豆饼粉
‑
玉米粉液体发酵培养基中。
[0049]
步骤2：将所述的木霉液体发酵液初始ph调节为3.26
‑
3.50，转速150
‑
180r/min，温度25℃
‑
28℃5
‑
6d，厚垣孢子达到1.75
×
108个/ml
‑
3.75
×
108个/ml。
[0050]
步骤3：将所述木霉液体发酵液制备木霉颗粒剂，木霉颗粒剂组分和重量如下：
[0051][0052]
步骤4：将所述的木霉颗粒剂的组分按比例混合，搅拌速度40
‑
50转/分，干燥温度为45
‑
50℃，干燥时间为40
‑
60分钟。
[0053]
步骤5：将所述的木霉颗粒剂以每亩3
‑
5公斤的剂量，在播种前施入土壤，或于化肥混合后施入土壤，在出苗
‑
心叶末期调查对根部地下害虫、叶片玉米螟和棉铃虫为害的防效。
[0054]
实施例1：棘孢木霉菌对玉米螟幼虫的致死作用
[0055]
试验目的：证明棘孢木霉gdsf1009对玉米螟幼虫的直接致死作用
[0056]
试验方法：
[0057]
⑴
棘孢木霉菌gdsf1009在pda培养基上25℃培养7d，用含0.1％吐温80(v/v)的无离子水制备的制备孢子悬液，通过血球计算器检查孢子浓度，孢子浓度最后调节为2
×
109cfu/ml。
[0058]
⑵
将棘孢木霉菌gdsf1009的孢子悬液按照1.0:1.2的比例与无菌人工饲料(大豆粉110g
‑
120g、玉米粉142
‑
152g、酵母粉62
‑
72g、琼脂10
‑
12g、维生素c 3
‑
4g、山梨醇3
‑
4g、甲醛1.2
‑
1.6ml、红霉素45
‑
50万i.u、自来水1000ml)混合，喂食二龄亚洲玉米螟幼虫，对照组设定为无菌水按照1:1.2的比例与无菌人工饲料混合。对照为每个处理组40头2龄玉米螟幼虫，每个处理重复3次。各处理在25℃、80％相对湿度、光周期16:8h(光照：黑暗)下养虫5d，统计幼虫死亡率。
[0059]
试验结果：
[0060]
在饲喂棘孢木霉孢子浓度109cfu/g情况下，二龄幼虫的校正死亡率达到55％。在
饲喂棘孢木霉孢子浓度108cfu/g情况下校正死亡率达到40％。
[0061]
实施例2：棘孢木霉颗粒剂防治苗期玉米螟为害
[0062]
试验目的：明确棘孢木霉颗粒剂诱导玉米苗期抗虫效果
[0063]
试验地点：河北藁城城
[0064]
试验方法：
[0065]
(1)木霉繁殖：棘孢木霉gdsf1009在马铃薯葡萄糖培养基中繁殖，将孢子悬液0.5％
‑
1.0％液加入10升发酵罐的大豆饼粉
‑
玉米粉液体发酵培养基中，ph调节为3.3，转速150
‑
180r/min,温度25℃
‑
28℃，发酵5
‑
6d，厚垣孢子达到1.75
×
108个/m
‑
3.75
×
108个/ml。
[0066]
(2)菌剂制备：将30
‑
40％木霉液体发酵液与5
‑
10％玉米粉、30
‑
40％硅藻土、10
‑
20％麦麸、0.4
‑
0.6％腐殖酸混合，搅拌速度40
‑
50转/分，45℃
‑
50℃干燥40
‑
60分钟。
[0067]
(3)田间试验：品种郑单958，田间试验面积为4亩，以裸种子和当地化学种衣剂为对照，木霉颗粒剂处理两次重复。在播种前与按木霉颗粒剂：氮磷钾复合化肥＝3:30比例混合，通过施肥机施入土壤。在出苗
‑
心叶末期调查对根部地下害虫、叶片玉米螟和棉铃虫为害的防效。
[0068]
试验结果：
[0069]
棘孢木霉颗粒剂播种期处理土壤，对玉米苗期发生的棉铃虫和玉米螟有明显的防效，其中对玉米螟的防效超过化学种衣剂，防效达到70％以上。结果证明了木霉菌对玉米苗期害虫有明显的诱导抗性作用。
[0070]
表1棘孢木霉颗粒剂对玉米苗期害虫的防治作用
[0071][0072]
实施例3：棘孢木霉gdsf1009颗粒剂防治苗期地下害虫
[0073]
试验目的：证明棘孢木霉对玉米苗期地下害虫的防治作用
[0074]
试验地点：辽宁凤城市、瓦房店市
[0075]
试验方法：
[0076]
⑴
菌剂施用：分别将tcf
‑
1颗粒剂与复合化肥(基肥)混合后一并施入土壤，然后播种，每亩施用5kg，抽雄期施第二次，每亩5kg。化肥施用量按当地实际应用水平。
[0077]
⑵
田间设计：选择面积连片、地势平坦、肥力均匀的田块做示范田。共设二个处理：
①
木霉颗粒剂；
②
不施颗粒剂对照2
‑
3亩(仅施复合化肥)。不设重复，但设保护行，田间管理与当地生产田相同，可分不同地块示范。
[0078]
⑶
虫害调查：在玉米6展叶期，每重复随机取3垄，每垄随机调查50株，三个重复共计150株，调查各重复虫害株率，统计田间防效，拍照。根据被害状，分别记录害虫种类。
[0079]
虫害防效＝[(对照受害株数
‑
处理受害株数)/对照受害株数]
×
100％。
[0080]
试验结果：
[0081]
辽宁瓦房店和凤城试验表明：木霉颗粒剂对玉米苗期地下害虫有明显的防效，防效达到35％
‑
85％，平均增产8.3％(表2)，证明木霉颗粒剂具有玉米苗期抗玉米螟为害的作用。
[0082]
表2木霉颗粒剂对地下害虫的防效
[0083][0084]
实施例4：棘孢木霉gdsf1009颗粒剂防治成株期害虫为害
[0085]
试验目的：证明棘孢木霉gdsf1009颗粒剂对成株期玉米螟和棉铃虫为害的防治作用
[0086]
试验地点：河北石家庄、贵州遵义、江苏沭阳
[0087]
试验方法：
[0088]
⑴
试验设计与供试品种：设木霉菌颗粒剂、当地化学种衣剂处理，对照为裸种子。示范品种：冀541，郑单958，每基点示范面积10亩。
[0089]
⑵
木霉菌颗粒剂处理方法：木霉菌颗粒剂5kg/亩与肥料混匀后，种肥同播。示范田用玉米专用复混肥(25
‑7‑
8)30kg/亩。
[0090]
⑶
害虫蛀孔率与防效调查：在成株期(乳熟期后)，每重复随机取3垄，20m垄长，每垄随机调查20株，三个重复共计60株，调查各重复果穗的玉米螟蛀孔
[0091]
为害率(玉米螟蛀孔率)％＝玉米螟蛀孔株数/调查总株数
×
100％
[0092]
防效＝[(对照蛀孔株数
‑
处理蛀孔株数)/对照蛀孔株数]
×
100％
[0093]
试验结果：
[0094]
三个基点试验表明：木霉颗粒剂对玉米螟和棉铃虫对果穗的侵染有较明显的防治效果，防效一般在30％
‑
60％之间。说明木霉颗粒剂能够诱导玉米果穗产生对钻蛀性害虫的抗性(表3、表4)。
[0095]
表3木霉颗粒剂对玉米成株期玉米螟和棉铃虫的防效
[0096]
[0097]
表4木霉菌颗粒剂对玉米螟防效调查
[0098][0099]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。