蛋白突变体、生产核苷的重组微生物及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及蛋白突变体、生产核苷的重组微生物及其应用。


背景技术：

2.核苷是一类糖苷的总称，由d-核糖或d-z-脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成，一般为无色结晶，不溶于普通有机溶剂，易溶于热水，熔点为160～240℃。核苷是核酸和核苷酸的组成成分，其中，由d-核糖生成的核苷称核糖核苷，参与rna 组成，由d-α-脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与dna组成。d-核糖与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶缩合生成相应的腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它们分别简称为腺苷(a)、鸟苷(g)、胞苷(c)、胸苷(t)和尿苷(u)。
3.鸟苷和肌苷在食品和医药行业有着广泛的作用。在食品领域，鸟苷和肌苷分别是鸟苷酸二钠和肌苷酸二钠的重要前体，而鸟苷酸二钠与肌苷酸二钠组合使用作为食品增鲜剂，广泛应用于鸡精、酱油等调味品中。在医药领域，鸟苷和肌苷可以作为多种抗病毒药物的医药中间体，如无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等都以鸟苷作为合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前体，而肌苷酸可以作为合成腺苷酸(amp)和鸟苷酸(gmp)的前体，适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外还可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。
4.目前，微生物发酵是生产核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等。在生长菌株的选育与改造过程中，通过使用紫外诱变、硫酸二乙酯诱变育种，定向选育核苷高产菌株；或者根据细菌中核苷酸的代谢路径和调节机理，深入了解菌株遗传背景及菌株特性，通过代谢工程手段，有目的性地对菌株进行改造，以获得性状优良、能够高产核苷的生产菌株。但目前核苷菌种的发酵性能仍较差、核苷的转化率仍较低，不能满足大规模工业化生产的需求。


技术实现要素：

5.本发明的第一目的在于提供磷酸甘油酸激酶突变体、嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变体及其应用。
6.本发明的第二目的在于提供生产核苷或其衍生物的重组微生物、其构建方法及其应用。
7.本发明的第三目的在于提供发酵生产核苷或其衍生物的方法。
8.具体地，本发明提供以下技术方案：
9.本发明提供蛋白突变体，其为磷酸甘油酸激酶突变体和/或嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变体，以枯草芽孢杆菌野生型磷酸甘油酸激酶为参考序列，所述磷酸甘油酸激酶突变体含有第31位缬氨酸被除缬氨酸以外的氨基酸取代的突变，以枯草芽孢杆菌野生型嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶为参考序列，所述嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变体含有第160
位丝氨酸被除丝氨酸以外的氨基酸取代的突变。
10.本发明所述的蛋白突变体可为磷酸甘油酸激酶突变体、嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变体或两者的组合。
11.本发明中，磷酸甘油酸激酶由pgk基因编码，催化1,3-二磷酸甘油酸生成3-磷酸甘油酸，产生1分子atp。本发明通过对磷酸甘油酸激酶的修饰，得到了磷酸甘油酸激酶突变体，该突变体能够有效提高微生物的核苷合成能力。
12.嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶由pyrab基因编码，催化由nh3、co2与2分子的atp合成氨甲酰磷酸。本发明通过对嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶进行修饰，得到了嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变体，该突变体能够有效提高微生物的核苷合成能力。
13.优选地，以枯草芽孢杆菌野生型磷酸甘油酸激酶为参考序列，所述磷酸甘油酸激酶突变体含有第31位缬氨酸被异亮氨酸、亮氨酸或丙氨酸取代的突变。以枯草芽孢杆菌野生型嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶为参考序列，所述嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变体含有第160位丝氨酸被异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸取代的突变。
14.具体地，所述磷酸甘油酸激酶突变体具有如seq id no.1-3任一所示的氨基酸。所述嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变体具有如seq id no.7-9任一所示的氨基酸。
15.本领域技术人员应该理解，在上述蛋白突变体序列的n端或c端添加标签蛋白或将其与其他蛋白进行融合形成融合蛋白，在不改变上述突变蛋白本身的活性的情况下，上述添加标签的蛋白或融合蛋白也在本发明的保护范围内。
16.本发明发现，上述磷酸甘油酸激酶突变体、嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变体在单独使用时均能够显著增强微生物中核苷或其衍生物的合成，进而提高核苷或其衍生物的产量和转化率。磷酸甘油酸激酶突变体、嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变体联合使用的效果更优，能够在各突变体单独使用的基础上进一步提高核苷或其衍生物的产量和转化率。除此之外，上述磷酸甘油酸激酶突变体、嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变体还能够较好地保证微生物的生长特性。
17.本发明还提供编码上述蛋白突变体的基因。
18.根据上述提供的蛋白突变体的氨基酸序列，本领域技术人员能够获得其编码核酸的序列。基于密码子的简并性，编码上述氨基酸序列的核酸序列不止一种，所有能够编码上述蛋白突变体的核酸均在本发明的保护范围内。
19.作为本发明的一种实施方式，编码磷酸甘油酸激酶突变体的基因的核苷酸序列如seq id no.4-6任一所示。编码嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变体的基因的核苷酸序列如seq id no.10-12任一所示。
20.本发明还提供含有上述基因的生物材料，所述生物材料为重组dna、载体或宿主细胞。
21.其中，上述重组dna包括在所述基因的上游或下游连接用于驱动其转录、表达的元件得到的重组dna。
22.上述载体可为表达载体或克隆载体，包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、转座子等。
23.上述宿主细胞为微生物细胞。
24.基于上述蛋白突变体的功能，本发明提供所述蛋白突变体、其编码基因或含有其
编码基因的生物材料的如下任一种应用：
25.(1)在发酵生产核苷或其衍生物中的应用；
26.(2)在构建核苷或其衍生物的生产菌株中的应用；
27.(3)在提高核苷或其衍生物的产量和/或转化率中的应用。
28.本发明中，所述核苷优选为嘌呤核苷，更优选为腺苷、肌苷或鸟苷。
29.本发明中，所述核苷衍生物为以核苷为前体合成的物质，包括但不限于腺嘌呤、腺苷酸、肌苷酸、鸟嘌呤、鸟苷酸、次黄嘌呤、二乙酰鸟嘌呤、核黄素等。
30.本领域技术人员应该理解，在微生物的核苷合成能力增强的情况下，以核苷为前体的下游产物会因其前体供应的增强而同样具有增强的合成能力。
31.本发明还提供一种重组微生物，所述重组微生物中，选自磷酸甘油酸激酶、嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶中的一种或两种酶的表达量和/或酶活性降低。
32.具体地，所述表达和/或酶活性降低可通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式的组合实现：
33.(1)对磷酸甘油酸激酶和/或嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得磷酸甘油酸激酶和/或嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶的表达和/或酶活性降低；
34.(2)将所述磷酸甘油酸激酶和/或嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件以使得磷酸甘油酸激酶和/或嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶的表达和/或酶活性降低。
35.优选地，所述重组微生物表达所述磷酸甘油酸激酶突变体、所述嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变体中的一个或两个，且不表达其出发菌株具有的选自磷酸甘油酸激酶、嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶中的一种或两种酶。
36.具体地，作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种重组微生物，其表达所述磷酸甘油酸激酶突变体，且不表达其出发菌株具有的磷酸甘油酸激酶。
37.作为本发明的另一种实施方式，本发明提供一种重组微生物，其表达所述嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变体，且不表达其出发菌株具有的嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶。
38.作为本发明的另一种实施方式，本发明提供一种重组微生物，其表达所述磷酸甘油酸激酶突变体和所述嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变体，且不表达其出发菌株具有的磷酸甘油酸激酶和嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶。
39.优选地，所述重组微生物中，编码磷酸甘油酸激酶和/或嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶的基因被编码所述蛋白突变体的基因取代。
40.本发明中，所述重组微生物优选为芽孢杆菌属细菌，更优选为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌。
41.本发明中，所述出发菌株优选为能够积累核苷的菌株。
42.优选地，所述出发菌株含有如下任一种突变：
43.(1)甘氨酰胺核苷酸合成酶purd的第116位脯氨酸突变为亮氨酸；
44.(2)转录调节子purr的第65位丙氨酸突变为天冬氨酸；
45.(3)肌苷酸脱氢酶基因guab的第279位甘氨酸突变为精氨酸。
46.所述出发菌株还包括如下突变：upp基因被失活。
47.作为本发明的一种实施方式，所述出发菌株为在枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)168中，敲除upp基因，并将染色体上的甘氨酰胺核苷酸合成酶编码基因purd的第116位脯氨酸突变为亮氨酸得到的菌株。
48.本发明提供的上述重组微生物的核苷合成能力显著增强，能够高效生产核苷或其衍生物。
49.本发明还提供所述重组微生物的构建方法，该方法包括：对出发菌株中的磷酸甘油酸激酶和/或嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得磷酸甘油酸激酶和/或嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶的酶活性降低；
50.或者，将出发菌株中磷酸甘油酸激酶和/或嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶的编码基因的转录和/或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件，以使得磷酸甘油酸激酶和/或嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶的表达量降低；
51.优选地，所述方法包括：将出发菌株中编码磷酸甘油酸激酶和/或嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶的基因突变为所述磷酸甘油酸激酶突变体、嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变体的编码基因。
52.本发明还提供所述重组微生物的如下任一种应用：
53.(1)在发酵生产核苷或其衍生物中的应用；
54.(2)在构建核苷或其衍生物的生产菌株中的应用；
55.(3)在提高核苷或其衍生物的产量和/或转化率中的应用。
56.本发明提供一种发酵生产核苷或其衍生物的方法，该方法包括培养所述重组微生物的步骤。
57.具体地，所述发酵生产核苷或其衍生物的方法包括：将所述重组微生物活化，将活化后的菌体接种于种子培养基中进行种子培养，然后将种子液接种至发酵培养基中进行发酵，分离发酵物中的核苷或其衍生物。
58.优选地，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖50-70g/l，酵母粉2-5g/l，磷酸二氢钾2-4g/l，硫酸铵20-30g/l，硫酸锰0.005-0.02g/l，硫酸镁4-6g/l，味精5-15g/l，玉米浆干粉12-18g/l，ph 7.0～7.2.
59.优选地，所述种子培养基包括如下组分：葡萄糖15-25g/l，酵母粉3-7g/l，玉米浆干粉3-7g/l，磷酸二氢钾2-4g/l，硫酸镁0.4-0.6g/l，硫酸亚铁0.01-0.03g/l，硫酸锰0.005-0.02g/l，ph 7.0～7.2。
60.本发明的有益效果在于：本发明通过修饰磷酸甘油酸激酶、嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶得到磷酸甘油酸激酶突变体和嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变体，上述蛋白突变体能够显著提高微生物的核苷合成能力，有效促进核苷或其衍生物的积累。本发明进一步提供表达上述突变体的重组微生物，该重组微生物能够高效率地生产核苷或其衍生物，经实验验证，其腺苷和肌苷的产量和转化率均显著提高。
具体实施方式
61.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
62.以下实施例中涉及的引物名称及序列如表1所示。
63.表1引物序列
id no.5所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。构建获得的质粒为pksu-pgk
v31l
，获得的菌株命名为b.subtilis a748，以下简称v31l。
70.磷酸甘油酸激酶突变菌株pgk
v31a
使用的引物为pgk
v31i-up-1f/pgk
v31a-up-1r和pgk
v31a-dn-2f/pgk
v31i-dn-2r，获得重组片段orf区核苷酸序列如seq id no.6所示，氨基酸序列如seq id no.3所示。构建获得的质粒为pksu-pgk
v31a
，获得的菌株命名为b.subtilis a749，以下简称v31a。
71.实施例3：构建嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变菌株pyrab
s160l
72.具体构建过程同实施例1，嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变菌株pyrab
s160l
使用的引物为pyrab
s160i-up-1f/pyrab
s160l-up-1r和pyrab
s160l-dn-2f/pyrab
s160i-dn-2r，获得重组片段orf区核苷酸序列见seq id no.10，氨基酸序列见seq id no.7。构建获得的质粒为pksu-pyrab
s160l
，获得的菌株命名为b.subtilis a711，以下简称s160l。实施例4：构建嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变菌株pyrab
s160v
和pyrab
s160i
73.嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变菌株pyrab
s160v
使用的引物为pyrab
s160i-up-1f/pyrab
s160v-up-1r和pyrab
s160v-dn-2f/pyrab
s160i-dn-2r，获得重组片段orf区核苷酸序列如seq id no.11所示，氨基酸序列如seq id no.8所示。构建获得的质粒为pksu-pgk
v31v
，获得的菌株命名为b.subtilis a712，以下简称s160v。
74.嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变菌株pyrab
s160i
使用的引物为pyrab
s160i-up-1f/pyrab
s160i-up-1r和pyrab
s160i-dn-2f/pyrab
s160i-dn-2r，获得重组片段orf区核苷酸序列如seq id no.12所示，氨基酸序列如seq id no.9所示。构建获得的质粒为pksu-pgk
v31i
，获得的菌株命名为b.subtilis a713，以下简称s160i。
75.实施例5：构建磷酸甘油酸激酶和嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶双突变菌株
76.在磷酸甘油酸激酶突变菌株b.subtilis a747(pgk
v31i
突变)上叠加嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变pyrab
s160l
、pyrab
s160v
、pyrab
s160i
。
77.以菌株b.subtilis a747基因组为模板，具体构建过程同实施例3-4，构建获得的菌株命名分别为b.subtilis a751、b.subtilis a752、b.subtilis a753，以下简称v31i-s160l、v31i-s160v、v31i-s160i。
78.实施例6：工程菌株的生产能力检测
79.对实施例1-5构建的工程菌株进行发酵实验，检测其生产性能，具体如下：
80.1、培养基：
81.(1)种子培养基配方(g/l)：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，ph 7.0～7.2，121℃下灭菌20min。
82.(2)发酵培养基配方(g/l)：葡萄糖60，酵母粉3.5，磷酸二氢钾3，硫酸铵25，硫酸锰0.01，硫酸镁5，味精10，玉米浆干粉15，碳酸钙25，ph 7.0～7.2，121℃下灭菌20min。
83.2、培养方法
84.(1)将菌株三区划线于lb平板，37℃过夜培养；
85.(2)挑单菌落接种至30ml种子培养基中，110rpm，36℃培养7～8h；
86.(3)按10％接种量转接至30ml发酵培养基中，摇床转速120rpm，36℃培养36h。
87.3、检测与结果
88.使用高效液相色谱仪(hplc)对发酵液中的核苷进行检测，使用分光光度计在
562nm波长下对发酵结束的菌体od进行检测，使用体外酶反应结合hplc对底物转化进行检测并计算酶活，结果见表2。
89.表2工程菌摇瓶发酵生成能力评估结果(三次重复均值)
[0090][0091]
表2中，*代表与出发菌株a1的结果相比具有显著性差异。
[0092]
由上述结果得出，磷酸甘油酸激酶突变(pgk
v31i
、pgk
v31l
和pgk
v31a
)、嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变(pyrab
s160l
、pyrab
s160v
和pyrab
s160i
)对腺苷、肌苷的产量提升均具有促进作用，且上述两个酶的突变叠加的效果更为突出，腺苷产量由1.2g/l提高到3.1g/l，肌苷产量由0.4g/l提高到1.3g/l。
[0093]
磷酸甘油酸激酶突变菌株pgk
v31i
与出发菌株a1相比，腺苷产量由1.2g/l提高到2.1g/l，肌苷产量由0.4g/l提高到0.8g/l。当磷酸甘油酸激酶第31位氨基酸由缬氨酸(v)突变为异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)或丙氨酸(a)后，腺苷和肌苷产量均有提升，尤其以缬氨酸突变为异亮氨酸后效果最好。
[0094]
嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变菌株pyrab
s160l
与出发菌株a1相比，腺苷产量由1.2g/l提高至2.5g/l，肌苷产量由0.4g/l提高到0.9g/l。当嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶第160位氨基酸由丝氨酸(s)突变为异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)或缬氨酸(v)后，检测到腺苷和肌苷产量都大幅提升，表明该突变位点有利于腺苷和肌苷的产生。
[0095]
磷酸甘油酸激酶突变pgk
v31i
与嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变(pyrab
s160l
、pyrab
s160v
或pyrab
s160i
)叠加后，腺苷和肌苷产量提升的效果更为突出，最佳生产效果为：腺苷产量由1.2g/l提高到3.1g/l，肌苷产量由0.4g/l提高到1.3g/l。
[0096]
本发明的菌株的构建，其步骤的前后顺序不限定，本领域的技术人员按本发明公开的内容达到本发明的目的均属于本发明的保护范围。
[0097]
本发明中的菌株代号如v31i、s160l和v31i-s160l等是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。上述方法构建的包含有枯草芽孢杆菌磷酸甘油酸激酶突变pgk
v31i
、pgk
v31l
和pgk
v31a
，嘧啶特异性氨甲酰磷酸合酶突变pyrab
s160l
、pyrab
s160v
和pyrab
s160i
的工程菌的用途，包括但是不局限于腺苷、肌苷。
[0098]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。