一种糖化血红蛋白层析柱用填料的制备方法与流程

1.本发明涉及糖化血红蛋白层探测技术领域，具体涉及一种糖化血红蛋白层析柱用填料的制备方法。


背景技术：

2.糖化血红蛋白(ghb)是红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类相结合的产物。它是通过缓慢、持续及不可逆的糖化反应形成，其含量的多少取决于血糖浓度以及血糖与血红蛋白接触时间，而与抽血时间、患者是否空腹、是否使用胰岛素等因素无关。ghb由hba1a、hba1b、hba1c组成,其中hba1c约占70％,且结构稳定,目前hba1c是评价糖尿病患者长期血糖控制状况的“金标准”，在糖尿病治疗及其并发症监测中具有重要价值。
3.高效液相糖化血红蛋白检测系统实现的是对hba1c的定量检测。根据高效液相色谱法(hplc)的工作原理，在离子交换法对糖化血红蛋白的检测分析中，高效液相分析仪、洗脱试剂、层析柱、校准品等对检测结果都会产生影响，而其中层析柱对于糖化血红蛋白的分离能力起着非常重要的作用。
4.血红蛋白变异体是影响hba1c检测和结果解读的重要因素之一,层析柱对于变异体及ghb的各组分的分离能力不足的话，可能导致结果产生偏差。例如，若层析柱填料上所带的官能团不能将hbf、l
‑
hba1c和hba1c完全分离，当某些临床样本hbf或l
‑
hba1c异常的情况下，会造成hba1c测值假性增高，导致测试结果不准确。
5.为此，我们提出一种糖化血红蛋白层析柱用填料的制备方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于解决或者至少缓解现有技术中存在的问题。
7.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
8.一种糖化血红蛋白层析柱用填料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.步骤一；第一单体初步聚合，形成粒径单分散的微球，称取10
‑
15份的第一单体、2
‑
5份的引发剂和5
‑
10份的稳定剂加入70
‑
83份的介质中，均匀溶解后在60
‑
75℃水浴加热的情况下搅拌反应2
‑
3h，
10.步骤二；第一单体进一步交联聚合，扩大微球的粒径，称取2
‑
10份的第一单体、1
‑
5份的交联剂、2
‑
5份的引发剂和5
‑
10份的稳定剂，溶解均匀后加入步骤一的聚合体系中继续水浴加热搅拌反应2
‑
3h，
11.步骤三；进一步地引入第二单体和第三单体进行聚合，将两种功能官能团聚合在微球上，称取2
‑
10份的第二单体和第三单体的混合物、1
‑
5份的引发剂，溶解均匀后加入前面的反应体系中继续水浴加热搅拌反应12
‑
16h，
12.步骤四；清洗，将反应体系中的溶剂、分散剂以及多余的单体等除去，通过离心设备，将沉淀的聚合的微球用乙醇和纯化水重复离心和清洗工序2
‑
3遍，再通过干燥得到含有复合功能官能团的强阳离子交换色谱填料。
13.可选地，所述第一单体为甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯中的一种或几种任意组合使用。
14.可选地，所述第二单体为2
‑
丙烯酰胺
‑2‑
甲基丙磺酸，苯乙烯磺酸钠、烯丙基磺酸钠中的一种或几种任意组合使用。
15.可选地，所述第三单体为丙烯酸、4
‑
戊烯酸、3
‑
甲基肉桂酸、5
‑
己烯酸、3
‑
丁烯酸中的一种或几种任意组合使用。
16.可选地，所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯中的一种或几种任意组合使用。
17.可选地，所述引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酸二甲酯、过氧化苯甲酰、过氧化二酰中的一种或几种任意组合使用。
18.可选地，所述稳定剂为聚乙烯醇、聚氧乙烯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、聚天冬酸氨钠中的一种或几种任意组合使用。
19.可选地，所述介质为乙醇、甲醇、甲苯、去离子水中的一种或几种任意组合使用。
20.可选地，所述步骤三混合物中第二单体：第三单体的比例为20:80—80:20。
21.可选地，在经步骤四清洗处理时，需要步骤三反应完成后的反应液降温到室温。
22.本发明实施例提供了一种糖化血红蛋白层析柱用填料的制备方法。具备以下有益效果：
23.本发明提供一种糖化血红蛋白层析柱微球填料制备方法，在填料的合成过程中，在微球上引入羧酸基团与磺酸基团两种功能官能团，通过调节两种官能团在微球上所占有的比例，解决填料的色谱柱分析检测结果的分离度与峰形不理想的技术问题。本发明提供的填料制备方法，能够合成出粒径分散的微球填料，实现糖化血红蛋白高效液相色谱检测过程中hbf、l
‑
hba1c和hba1c等蛋白良好的分离效果及分离柱效。
24.本发明通过多步分散聚合法，获得含有复合功能官能团的强阳离子交换色谱填料。可以避免现有离子交换色谱填料中单一官能团可能产生的蛋白分离度较差或者部分变异蛋白无法分离以及柱效较低的情况。填料的制备方法简单易于操作，填料的离子交换容量可控。
附图说明
25.图1为经过本发明制备方法得到层析柱在检测时产生的色谱图。
具体实施方式
26.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.一种糖化血红蛋白层析柱用填料的制备方法，包括如下步骤：
28.步骤一；第一单体初步聚合，形成粒径单分散的微球。称取10
‑
15份的第一单体、2
‑
5份的引发剂和5
‑
10份的稳定剂加入70
‑
83份的介质中，均匀溶解后在60
‑
75℃水浴加热的情况下搅拌反应2
‑
3h。
29.步骤二；第一单体进一步交联聚合，扩大微球的粒径。称取2
‑
10份的第一单体、1
‑
5份的交联剂、2
‑
5份的引发剂和5
‑
10份的稳定剂，溶解均匀后加入步骤一的聚合体系中继续水浴加热搅拌反应2
‑
3h。
30.步骤三；进一步地引入第二单体和第三单体进行聚合，将两种功能官能团聚合在微球上。称取2
‑
10份的第二单体和第三单体的混合物(两种单体的比例为20:80—80:20)、1
‑
5份的引发剂，溶解均匀后加入前面的反应体系中继续水浴加热搅拌反应12
‑
16h。
31.步骤四；清洗，将反应体系中的溶剂、分散剂以及多余的单体等除去。经步骤三反应完成后的反应液降温到室温，同时通过离心设备，将沉淀的聚合的微球用乙醇和纯化水重复离心和清洗工序2
‑
3遍，再在真空干燥得到含有复合功能官能团的强阳离子交换色谱填料。
32.第一单体为甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯中的一种或几种任意组合使用。
33.第二单体为2
‑
丙烯酰胺
‑2‑
甲基丙磺酸，苯乙烯磺酸钠、烯丙基磺酸钠中的一种或几种任意组合使用。
34.第三单体为丙烯酸、4
‑
戊烯酸、3
‑
甲基肉桂酸、5
‑
己烯酸、3
‑
丁烯酸中的一种或几种任意组合使用。
35.交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯中的一种或几种任意组合使用。
36.引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酸二甲酯、过氧化苯甲酰、过氧化二酰中的一种或几种任意组合使用。
37.稳定剂为聚乙烯醇、聚氧乙烯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、聚天冬酸氨钠中的一种或几种任意组合使用。
38.介质为乙醇、甲醇、甲苯、去离子水中的一种或几种任意组合使用。
39.本发明提供一种糖化血红蛋白层析柱微球填料制备方法，在填料的合成过程中，在微球上引入羧酸基团与磺酸基团两种功能官能团，通过调节两种官能团在微球上所占有的比例，解决填料的色谱柱分析检测结果的分离度与峰形不理想的技术问题。本发明提供的填料制备方法，能够合成出粒径分散的微球填料，实现糖化血红蛋白高效液相色谱检测过程中hbf、l
‑
hba1c和hba1c等蛋白良好的分离效果及分离柱效，如图1所示。
40.通过多步分散聚合法，获得含有复合功能官能团的强阳离子交换色谱填料。可以避免现有离子交换色谱填料中单一官能团可能产生的蛋白分离度较差或者部分变异蛋白无法分离以及柱效较低的情况。填料的制备方法简单易于操作，填料的离子交换容量可控。
41.实施例1
42.步骤一；对甲基丙烯酸甲酯初步聚合，形成粒径单分散的微球。
43.使用三口烧瓶称取13份的甲基丙烯酸甲酯、4份的偶氮二异丁腈、10份的聚乙烯醇、70份的乙醇和3份的纯化水，超声混合均匀后置于水浴之中，开启搅拌器保持反应体系均匀，通入氮气10min以除去装置中的氧气，将水浴温度提升至70℃，开始反应。
44.步骤二；对甲基丙烯酸甲酯进一步交联聚合，扩大微球的粒径。
45.使用烧杯称取7份的甲基丙烯酸甲酯、3份的乙二醇二甲基丙烯酸酯、4份的偶氮二异丁腈和10份的聚乙烯醇，超声使其溶解均匀。待步骤一的聚合体系反应3h后，将其加入步骤一；反应体系中继续反应3h，保持水浴加热搅拌。
46.步骤三；进一步地引入2
‑
丙烯酰胺
‑2‑
甲基丙磺酸和丙烯酸进行聚合，将两种功能官能团聚合在微球上。
47.使用烧杯称取2份的丙烯酸、4份的2
‑
丙烯酰胺
‑2‑
甲基丙磺酸和3份的偶氮二异丁腈，超声溶解均匀后，步骤二；的反应体系中继续水浴加热搅拌反应14h。
48.步骤四；清洗，将反应体系中的溶剂、分散剂以及多余的单体等除去。经步骤三反应完成后，将三口烧瓶取下静置至室温，将反应液转移至离心管中离心，去除上清液，在沉淀的微球中加入乙醇混合均匀，继续离心去除上清液。继续重复上述步骤，使用乙醇对微球进行清洗离心。用水对微球进行清洗并干燥最终得到单分散的强阳离子交换色谱填料微球。
49.将所得填料使用装柱机制备成层析柱，对全血样本进行检测分析，得到分离效果良好的色谱图，如图1所示。
50.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
51.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。