一种柱花草毛状根诱导方法

1.本发明涉及植物组培技术领域，更具体地，涉及一种柱花草毛状根诱导方法。


背景技术：

2.柱花草(stylosanthes guianensis)是主要分布于热带和亚热带地区的多年生豆科牧草，具有较高的产量以及较好的品质，主要用于动物饲料、林地绿化等。柱花草是改良酸性土壤的优良先锋作物。
3.在自然界中，发根农杆菌(agrobacterium rhizogenes)可通过ri质粒的t
‑
dna将诱导发根的rol基因稳定整合到宿主植物基因组中产生毛状根，并可以同时将ti质粒中携带的外源基因共同整合到植物基因组中，从而实现共转化。利用发根农杆菌获得转基因的植物毛状根在多种植物中已实现。例如，在菜豆(phaseolus vulgaris)，大豆(glycine max)，黄芪(astragalus membranaceus)，长春花(catharanthus roseus)等植物中获得的毛状根广泛应用于根系次生代谢物的获得以及基因功能的研究等。
4.目前，柱花草转基因材料的获得主要通过整株转化方法。在1987年，manners等首次通过根癌农杆菌侵染的方法，成功将ntpⅱ基因成功导入柱花草并获得整株转基因柱花草(transformation of stylosanthes spp.using agrobacterium tumefaciens[j].plant cell reports,1987)。此外，manners利用发根农杆菌侵染矮柱花草的茎和叶片，获得23％完整转基因材料。sarria等用根癌农杆菌将双元载体epgv1040转入柱花草，发现该外源基因以单拷贝形式整合到转基因植株基因组(agrobacterium
‑
mediated transformation of stylosanthes guianensis and production of transgenic plants[j].plant science,1994)。除了利用农杆菌介导以获得转基因材料的方法外，quecini等人使用基因枪法将be2s1基因转化导入柱花草，建立了基因枪法的遗传转化体系(microparticle bombardment of stylosanthes guianensis:transformation parameters and expression of a methionine
‑
rich 2salbumin gene[j].plant cell,tissue and organ culture,2006)。而国内到近年来才有人进一步建立与优化柱花草转化的遗传转化体系，段瑞军等优化了柱花草的转化体系，成功获得含有bar、hpt、npt ii等基因的转基因柱花草，研究还发现柱花草幼苗下胚轴愈伤诱导率及分化率比其他部位高，是较为理想的外植体材料部位(转基因提高柱花草抗寒性研究[d].华南农业大学硕士学位论文.2012.)。2012年，符少萍等人以5号柱花草为材料，利用农杆菌侵染，将丙二烯氧化环化酶基因(aoc)成功导入柱花草中，获得整株转化材料(符少萍,郭建春,李瑞梅等.aoc
‑
ipt转录融合基因转化热研5号柱花草[j].热带作物学报,2012)。此外，有报道对上述柱花草整株转化体系做了进一步应用及改良。
[0005]
但是，整株转化的方法获得转基因材料存在较复杂的转基因过程，转基因效率较低，转化时间过长等缺点，不利于进行柱花草基因功能的研究。因此，柱花草毛状根诱导方法的发明对于柱花草基因功能的研究具有重要意义，但目前有关于柱花草毛状根的诱导尚未见有报道。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种柱花草毛状根诱导方法。
[0007]
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
[0008]
一种柱花草毛状根诱导方法，包括如下步骤：
[0009]
s1.发根农杆菌的选择和培养：将发根农杆菌菌株msu440活化、培养成发根农杆菌菌液待用；
[0010]
s2.柱花草外植体的获得：切取萌发后的柱花草幼苗子叶节和/或子叶为外植体；
[0011]
s3.柱花草外植体的侵染：将步骤s2的柱花草外植体与步骤s1发根农杆菌菌液共培养；
[0012]
s4.柱花草毛状根的诱导：将步骤s3侵染后的柱花草外植体在无菌水中共培养4～6天后，转移到共培养液浸润的无菌滤纸共培养12～15天，在切口处初步获得毛状根；
[0013]
s5.毛状根脱菌培养及扩繁：待毛状根长至2cm以上，将毛状根转化体用含有抗生素的无菌水冲洗三次，转移到含抗生素的ms培养基中，继代培养若干次，直到发根农杆菌被完全灭杀，最后转移到1/2ms培养基中繁殖毛状根。
[0014]
优选地，步骤s1所述发根农杆菌菌液为从活化后的发根农杆菌菌株msu440种子菌液中吸取200～300μl接种至5～10ml yep液体培养基中，26～28℃170～190r/min振荡培养至od为0.5～0.6。
[0015]
优选地，步骤s2所述萌发为：将柱花草种子解除休眠后消毒、灭菌，置于萌发培养基中培养萌发；培养温度22～24℃，光照强度110～130μmol
·
m
‑2·
s
‑1，每天光照时间为15～17小时，相对湿度为55～65％。
[0016]
进一步优选地，所述萌发培养基为1
×
ms培养基。
[0017]
优选地，所述柱花草外植体为萌发2天，带1mm下胚轴的柱花草幼苗子叶。
[0018]
优选地，所述步骤s4所述共培养液组成为：0.4125g
·
l
‑1nh4no3、0.48g
·
l
‑1kno3、0.11g
·
l
‑1cacl2·
2h2o、0.0925g
·
l
‑1mgso4·
7h2o、0.0425g
·
l
‑1kh2po4、0.2075mg
·
l
‑1ki、1.54mg l
‑1h3bo3、5.56mg
·
l
‑1mnso4·
4h2o、2.65mg
·
l
‑1znso4.7h2o、0.0625mg
·
l
‑1na2moo4·
2h2o、0.00625mg
·
l
‑1cuso4·
5h2o、0.00625mg
·
l
‑1cocl2·
6h2o、9.325mg
·
l
‑1fe
‑
edta、25mg
·
l
‑1肌醇、0.5mg
·
l
‑1甘氨酸；0.5％蔗糖。即在1/4
×
ms培养基添加25mg
·
l
‑1肌醇、0.5mg
·
l
‑1甘氨酸和0.5％蔗糖。
[0019]
优选地，步骤s4在无菌水中培养为24～26℃，光照强度39000～39100lx，每天光照时间15～17小时，相对湿度为45～55％共培养4～6；所述柱花草外植体与共培养液培养为温度22～24℃，光照强度为39000～39100lx，光照共培养12～15天。
[0020]
优选地，步骤s5所述含抗生素的无菌水和含抗生素的ms培养基中的抗生素均为羧苄青霉素(carb)，浓度为4～6g/l。
[0021]
本发明所述柱花草种子根据不同需求选取不同品种种质资源，优选地，本发明选用的柱花草品种为ry2。
[0022]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0023]
本发明提供了一种柱花草毛状根诱导方法，包括发根农杆菌的选择和培养、柱花草外植体的获得、柱花草外植体的侵染、柱花草毛状根的诱导和毛状根脱菌培养及扩繁，毛
l
‑1h3bo3、22.3mg
·
l
‑1mnso4·
4h2o、10.6mg
·
l
‑1znso4.7h2o、0.25mg
·
l
‑1na2moo4·
2h2o、0.025mg
·
l
‑1cuso4·
5h2o、0.025mg
·
l
‑1cocl2·
6h2o、37.3mg
·
l
‑1fe
‑
edta；1％蔗糖；0.3％植物胶，5g/lcarb
[0037]
2、一种柱花草毛状根诱导方法，操作步骤如图1所述，具体包括以下步骤：
[0038]
(1)柱花草种子的灭菌和催芽：将柱花草种子搓去外种皮，放入1.5ml离心管到体积0.5ml处，加入1ml无菌水在98℃空气浴放置3分钟打破休眠，用移液器吸去无菌水，加入75％酒精浸泡种子，期间间歇震荡给种子彻底消毒，1分钟后移去酒精；加入无菌水清洗3次，移去无菌水，加入10％(v/v)次氯酸钠，期间间歇震荡，5分钟后移去次氯酸钠，加入无菌水冲洗，重复无菌水冲洗步骤3次直到次氯酸钠被彻底冲洗干净。然后将灭菌后的植物种子用无菌牙签小心播种在所述萌发培养基表面，盖上盖子，用透气医用胶带沿边缘封好，转移至培养箱光照培养，待其萌发。培养箱内的条件为：白天和晚上的温度均为23℃，光照强度120μmol
·
m
‑2·
s
‑1，每天光照时间为16小时，相对湿度为60％。
[0039]
(2)发根农杆菌的选择和培养：发根农杆菌菌株为带有ptf101s双元载体质粒的msu440(由上海唯地生物技术有限公司提供)。用无菌牙签挑取少量msu440菌液，在固体yep培养基中划线培养。待单克隆菌落长出后，从yep固体平板上挑取单菌落，接种到0.5ml yep液体培养基中，于28℃恒温摇床上，以180r/min的转速振荡培养过夜获得种子菌液。从种子菌液中吸取200μl接种至5ml yep液体培养基中，于28℃恒温摇床上，以180r/min的转速振荡培养至od为0.5～0.6。
[0040]
(3)柱花草幼苗的侵染：用无菌的镊子将萌发两天后的柱花草幼苗从培养基中取出，放到灭菌的培养皿中，用11号无菌手术刀蘸取发根农杆菌菌液，在柱花草子叶节下1mm处切去柱花草下胚轴。在培养皿中倒入适量发根农杆菌菌液，在菌液中切开两片子叶，同时去除幼芽，切好的子叶在上述yep菌液中浸泡30分钟，即完成侵染过程。
[0041]
(4)柱花草毛状根的诱导：将灭菌滤纸放入直径11cm圆形培养皿中，加入灭菌水润湿滤纸使其达到饱和，将侵染30分钟后的柱花草植外体转移到上述培养皿中，盖上盖子，边缘用非透气保鲜膜封好，转移至光照培养箱内共培养5天；培养箱内的条件为：白天和晚上的温度均为25℃，光照强度39060lx，每天光照时间为16小时，相对湿度为50％。再把共培养后的柱花草植外体转移到含共培养液的培养皿中，盖上盖子，边缘非透气保鲜膜封好，转移至光照培养箱温度23℃，光照强度为39000～39100lx，共培养约14天，即可获得2cm左右长的柱花草毛状根。
[0042]
(5)柱花草毛状根的脱菌和扩繁：待毛状根长至2cm以上，将毛状根转化体用含有抗生素的无菌水(5g/l carb)冲洗三次，转移到含5g/l carb的脱菌培养基上，每7天继代1次，直到农杆菌被完全灭杀，最后转移到1/2
×
ms培养基中繁殖毛状根。
[0043]
3、转基因毛状根检测：取约0.05g继代后的毛状根于2ml离心管中，用ctab法提取样品dna，接着2
×
rapid master mix检测除草剂报告基因。检测引物为：bar
‑
f:caaccactacatcgagacaagca，bar
‑
r:tcatcagatctcggtgacggg；20μl pcr扩增体系包含：10μl的rapid master mix，0.5μl正向引物，0.5μl反向引物，1μl dna，8μl ddh2o。反应程序：预变性98℃5min，35个循环反应(变性98℃30s，退火59℃30s，延伸72℃1min)，72℃维持10min，扩增完成后16℃保存扩增产物。
[0044]
二、结果
[0045]
选取10个外植体共24条毛状根进行检测，结果如图2，共检测到14条毛状根在电泳结果中有条带，为阳性毛状根，因此毛状根的阳性率为58.3％。
[0046]
对比例
[0047]
选择ar1193和ara4发根农杆菌，其他培养条件与上述实施例1相同，柱花草毛状根的诱导情况如图3a
‑
b，发根农杆菌ar1193和ara4的诱导率分别为23.4％与28.5％；经过dna检测，其中选择ar1193发根农杆菌诱导结果如图3c，毛状根的阳性率为0％，选择ara4发根农杆菌诱导结果如图3d，毛状根的阳性率为8.3％。