一种EGFR基因突变检测体系及其试剂盒的制作方法

一种egfr基因突变检测体系及其试剂盒
技术领域
1.本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种egfr基因突变检测体系及其试剂盒。


背景技术：

2.人类表皮生长因子受体家族（epidermal growth factor receptor family，egfr家族）是一种跨膜络氨酸激酶受体，该受体激酶域的激活对癌细胞增殖、生长的相对信号传递具有重要意义。表皮生长因子受体（egfr）是原癌基因c
‑
erbb
‑
1（her
‑
1）的表达产物，定位于细胞膜上。egfr主要通过两条途径将信号传递至细胞核，一条是ras
→
raf
→
mapk途径；另一条是pi3k
→
pkc
→
ikk途径。当信号传导至细胞核后，引起核内基因转录水平的增加，使细胞增殖、转化。egfr信号传导的异常是导致多种肿瘤发生的原因。
3.表皮生长因子受体
‑
酪氨酸激酶抑制剂（egfr
‑
tkis）等靶向药物已经成为晚期非小细胞肺癌重要的治疗方式之一。在egfr基因突变的晚期非小细胞肺癌患者，国际国内多中心临床研究已经证实egfr靶向治疗能显著降低疾病进展或死亡风险、改善患者生活质量。这些临床研究和系统分析均指出egfr基因突变检测是晚期肺癌患者使用egfr
‑
tkis治疗的先决条件。
4.egfr 基因编码区的突变主要发生在外显子18～21上。egfr基因两种主要的突变为19外显子缺失（约占45%）和21外显子l858r突变（约占40%），二者均可导致酪氨酸激酶结构域活化，且均为egfr
‑
tkis的敏感性突变。肺腺癌患者egfr基因敏感突变阳性率在高加索人群约为10%，在亚裔人群和我国均为50%左右。此外，大部分患者在服用egfr
‑
tkis一段时间后会出现耐药，其中约60%耐药患者可检测到egfr 20号外显子t790m突变。
5.在我国，非小细胞肺癌患者egfr基因突变检测专家共识指出：所有非小细胞肺癌患者，不限组织学类型，只要条件许可，均应尝试进行肿瘤组织的egfr基因突变检测。但是在实际诊断治疗过程中，由于肿瘤组织的种种局限，使得患者血液作为补充或替代的生物标本类型参与到患者egfr基因突变检测的过程，具有重要的临床意义，有助于提高临床患者的总体egfr基因受检率。研究显示，大部分（并非全部）晚期非小细胞肺癌患者的血液中存在循环游离dna（cfdna，cell
‑
free dna）。cfdna重要来源于凋亡或坏死的细胞，包括正常细胞和肿瘤细胞。既往的系列研究已经在非小细胞肺癌患者的血浆或血清样本中发现egfr基因突变，同时对230例中国晚期非小细胞肺癌组织与血浆游离dna配对分析等研究也同样显示血液样本egfr基因突变对于预测靶向药物治疗的临床获益与组织突变者高度一致。
6.目前在egfr基因突变检测技术的研究中，大部分检测体系适用于组织样本患者的检测。针对组织样本易得的患者，可以使用单个突变位点检测的体系完成其egfr基因突变检测的目标。但是对于组织样本取样困难、或是预后监控阶段无组织样本的患者，目前的研究表明，采用血浆游离dna样本同样可以达到识别egfr基因突变状态的目标。但是，由于血浆游离dna的特殊性，其在血浆中的含量及其微量，一次采样不能满足单个位点分别检测的实验样本需求。
7.

技术实现要素：

8.本发明针对现有技术的不足及临床检测的实际需求，提供一种egfr基因突变检测的体系。本发明所述的检测体系在同一个反应体系中可以同步进行egfr基因 t790m、19del、l858r三个位点的检测，使得微量dna样本的检测得以实现，同时基于多色荧光通道的数字pcr检测平台，可以明确提示发生基因突变的位点，为后续临床诊断及评价提供准确可靠的参考依据。本发明的egfr 基因突变检测体系尤其适用于血浆游离dna（cfdna）的检测，基于数字pcr技术平台的同一反应体系可进行多个egfr基因突变位点的检测，对于微量样本患者、组织样本取样困难的患者，弥补了临床实践应用的空白，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
9.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种egfr基因突变检测体系，包含引物探针混合物，所述引物探针混合物由检测egfr t790m位点的特异性引物及特异性探针、检测egfr 19del位点的特异性引物及特异性探针和检测egfr l858r位点的特异性引物及特异性探针组成：（1）所述特异性引物的组成及序列为：egfr t790m正向引物：5
’‑
gcctgctgggcatctgcc
‑3’
;egfr t790m反向引物：5
’‑
tctttgtgttcccggacatagtcca
‑3’
;egfr 19del正向引物：5
’‑
gaaggtgagaaagttaaaattcccg
‑3’
;egfr 19del反向引物：5
’‑
agcaaagcagaaactcacatcg
‑3’
;egfr l858r正向引物：5
’‑
gccaggaacgtactggtgaa
‑3’
;egfr l858r反向引物：5
’‑
ccttctgcatggtattctttctcttc
‑3’
;（2）所述特异性探针的组成及序列为：egfr t790m野生型探针：5
’‑
tgagctgcgtgatgag
‑3’
;egfr t790m突变型探针：5
’‑
tgagctgcatgatgag
‑3’
;egfr 19del突变型探针：5
’‑
cgctatcaaaacatctc
‑3’
;egfr l858r突变型探针：5
’‑
agcagtttggcccgc
‑3’
;优选地，所述egfr t790m野生型探针5’端具有vic荧光基团修饰，egfr t790m突变型探针5’端具有fam荧光基团修饰，egfr 19del突变型探针5’端具有cy5荧光基团修饰，egfr l858r突变型探针5’端具有rox荧光基团修饰。
10.优选地，所述野生型探针和突变型探针的3’末端经过双脱氧修饰、氨基修饰或磷酸化修饰以阻断探针在扩增过程中延伸；进一步优选地，所述探针的3’末端位修饰mgb非荧光淬灭基团。
11.优选地，所述野生型探针和突变型探针的核苷酸序列中野生型或突变型对应的核苷酸为经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性的核苷酸；进一步优选地，所述经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性的核苷酸为锁核酸修饰的核苷酸。
12.优选地，所述锁核酸修饰的核苷酸序列为：egfr t790m野生型探针：5
’‑
tgagctgc/ixna_g/tgatgag
‑3’
;egfr t790m突变型探针：5
’‑
tgagctgc/ixna_a/tgatgag
‑3’
;
egfr l858r突变型探针：5
’‑
agcagtttggcc/ixna_c/gc
‑3’
。
13.优选地，所述检测体系由dpcr
‑
酶反应液、10
×
引物探针混合物、dna模板和去离子水组成。
14.例如，本发明中，若所述检测体系的总体积为40μl，则其中dpcr
‑
酶反应液10μl、10
×
引物探针混合物4.0μl、模板dna 1
‑
25μl，去离子水补齐至40μl。
15.优选地，所述引物探针混合物的浓度分别为：egfr t790m正向引物浓度为4.5
‑
10.0 μmol/l；egfr t790m反向引物浓度为4.5
‑
10.0 μmol/l；egfr 19del正向引物浓度为3.5
‑
8.0 μmol/l；egfr 19del反向引物浓度为3.5
‑
8.0 μmol/l；egfr l858r正向引物浓度为5.5
‑
10.0 μmol/l；egfr l858r反向引物浓度为5.5
‑
10.0 μmol/l；egfr t790m野生型探针浓度为3.5
‑
5.0 μmol/l；egfr t790m突变型探针浓度为3.5
‑
5.0 μmol/l；egfr 19del突变型探针浓度为3.0
‑
5.0 μmol/l；egfr l858r突变型探针浓度为5.0
‑
7.0 μmol/l。
16.第二方面，本发明提供一种egfr基因突变检测试剂盒，含有如上所述的egfr 基因突变检测体系。
17.优选的，采用试剂盒检测组织样本或血浆游离dna样本中 egfr基因 t790m、19del、l858r位点突变的方法包括如下步骤：(1)提取组织样本或血浆游离dna样本；(2)采用由dpcr
‑
酶反应液、10
×
引物探针混合物、dna模板和去离子水组成的检测体系配制pcr扩增反应；(3)将反应混合物加到dpcr纳米微孔板加样孔中，随即密封纳米微孔板；(4)数字pcr反应系统自动对纳米微孔板中的反应液进行分配、热循环扩增反应以及结果解读；(5)热循环扩增反应按照如下条件进行反应：95℃热启动，2分钟；95℃变性，15秒；58
‑
65℃退火，15秒；72℃延伸，15秒；扩增40个循环；反应结束；(6)通过采集荧光信号，数据分析，得到检测样本中egfr基因多个位点的变异情况，给出判定结果。
18.优选的，若检测样本dna的平均长度大于20kb，在配制pcr扩增反应时加入限制性内切酶，pcr扩增反应前将反应体系在15
‑
25℃的室温下放置10分钟，进行酶切消化，酶切反应所选的限制性内切酶为ecorⅰ、pvuⅱ、xbaⅰ、aluⅰ、cviqⅰ和haeⅲ中的任意一种。
19.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：（1）本发明提供的egfr基因突变检测体系，是基于数字pcr平台展开，具有极高的特异性和灵敏性，相比荧光定量pcr平台上的检测产品，其特异性和灵敏度均有数量级程度的提高。本发明所述的检测体系 ，每个样本的反应体系被分配到26000个纳米级微孔中，精确的体系控制及高效扩增反应可保证液滴无破裂、无交叉污染，最大效率地提高微量模板、低丰度靶标的检测精度。
20.（2）本发明提供的egfr基因突变检测体系，基于五色荧光通道的数字pcr检测平台，在同一个反应体系中可以同步进行egfr基因t790m、19del、l858r三个位点的检测，大大减少了反应中dna的用量，使得微量dna样本的检测得以实现，为后续临床诊断及评价提供准确可靠的参考依据。
21.（3）本发明所述的对于血浆游离dna样本这一类低丰度的样本类型，检测成功率高，在反复检测、反复取样等实际需求中，大幅度缩短检测周期，对组织样本取样困难、或是预后监控阶段无组织样本的患者的临床检验具有较高的应用价值。
22.附图说明
23.图1
‑
图3分别为采用本发明检测细胞系dna在egfr t790m/19del/l858r三个位点的基因分型结果；图4
‑
图6分别为采用本发明检测ffpe dna
‑
1在egfr t790m/19del/l858r三个位点的基因分型结果；图7
‑
图9分别为采用本发明检测ffpe dna
‑
2在egfr t790m/19del/l858r三个位点的基因分型结果；图10
‑
图12分别为采用本发明检测cfdna
‑
1在egfr t790m/19del/l858r三个位点的基因分型结果；图13
‑
图15分别为采用本发明检测cfdna
‑
2在egfr t790m/19del/l858r三个位点的基因分型结果；图16
‑
图18分别为采用本发明检测cfdna
‑
3在egfr t790m/19del/l858r三个位点的基因分型结果。
具体实施方式
24.为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
25.实施例1 egfr基因突变检测体系的设计与建立1.引物探针组合的设计首先，参照文献报道的egfr（表皮生长因子受体）基因的genebank序列号，从ncbi数据库找到各位点所对应的基因序列，在经研究确认的t790m、19del、l858r突变位点上下游设计特异性扩增引物对，同时在覆盖突变位点核苷酸的情况下分别设计野生型和突变型特异性探针。
26.引物设计原则：本发明中用于检测egfr基因突变位点t790m、19del、l858r的引物对是由primer5和ncbi blast软件设计完成；引物长度在18
‑
26个核苷酸之间，引物的gc含量在40%
‑
60%之间，引物的tm值≥60℃。各引物的tm值大致接近，以确保引物对能在同一退火温度下高效扩增。设计完成后将各引物用ncbi blast软件进行比对，确保各引物在合适范围内能够特异比对到目标区域。引物的扩增产物大小在70
‑
120bp范围内。所设计的引物用auto dimer软件分析引物二聚体情况，确保特异性和避免二聚体的出现。
27.探针设计的原则：本发明中用于检测egfr 基因突变位点t790m、19del、l858r的野
生型和突变型特异性探针，在3’末端均经过修饰以阻断探针在扩增过程中延伸，同时3’末端位修饰mgb非荧光淬灭基团。egfr t790m野生型探针5’端具有vic荧光基团修饰，egfr t790m突变型探针5’端具有fam荧光基团修饰，egfr 19del突变型探针5’端具有cy5荧光基团修饰，egfr l858r突变型探针5’端具有rox荧光基团修饰。其中egfr t790m和l858r两个位点的野生型或（和）突变型核苷酸使用锁核酸技术增强探针与目的产物的特异性结合，从而达到增强结合效率、加强荧光信号的效果。
28.egfr t790m、19del、l858r位点扩增的特异性引物及探针序列如表1所示：表1表12. 检测系统建立2.1 将上述设计的引物探针按照不同的浓度比例配制10
×
引物探针混合物，具体的各引物和探针的浓度如表2所示：表2
2.2 按照数字pcr反应体系配制扩增反应：其中4
×
dpcr
‑
酶反应液10μl、10
×
引物探针混合物4.0μl、限制性内切酶（如有需要）10u、模板dna 1
‑
25μl，去离子水补齐至40μl。
29.2.3 将反应混合物加到dpcr纳米微孔板加样孔中，随即密封纳米微孔板。
30.2.4 若检测样本dna的平均长度大于20kb，需要进行限制性内切酶消化反应，反应体系在室温（15
‑
25℃）放置10分钟，进行酶切消化；若检测血浆游离dna样本，则无需酶切消化反应，直接进行pcr扩增反应。
31.本实施例中选用的限制性内切酶为ecorⅰ，对细胞系dna进行消化处理。
32.2.5qiacuity system 数字pcr反应系统自动对纳米微孔板中的反应液进行分配、热循环扩增反应以及结果解读。
33.2.6 热循环扩增反应按照如下条件进行反应：95℃热启动，2分钟；95℃变性，15秒；60℃退火，15秒；72℃延伸，15秒；扩增40个循环；反应结束。
34.2.7 通过采集荧光信号，数据分析，得到检测样本中egfr基因多个位点的变异情况，给出判定结果。
35.根据读取到的vic、fam、cy5和rox信号，可对样本的egfr基因突变情况进行分析。其中，egfr t790m位点野生型（vic）和突变型（fam）的信号可以判断为t790m位点发生突变（阳性），并进行突变比例的计算分析；egfr 19del位点突变型（cy5）的信号可以判断为egfr 19del位点发生缺失（阳性）；egfr l858r位点突变型（rox）的信号可以判断为egfr l858r发生突变（阳性）。
36.由图1
‑
图3可知，根据数字pcr结果图谱，可以比较直观地观察到待检测样本在egfr t790m、19del、l858r位点的突变情况。
37.本例细胞系dna的检测结果为egfr t790m阳性，突变比例为85.97%，其中fam检测的突变型信号copies为1894 copies/40μl（图1 y轴坐标数据为egfr t790m突变型探针fam信号）；vic检测的野生型信号copies为309 copies/40μl（图1x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）；egfr 19del阳性，其中cy5检测的突变信号copies为1875 copies/40μl（图2 y轴坐标数据为egfr 19del突变型探针cy5信号，图2x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）；egfr l858r阳性，其中rox检测的突变信号copies为1895 copies/40μl（图3 y轴坐标数据为egfr l858r突变型探针rox信号，图3 x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信
号）。
38.实施例2 病人组织样本的检测选取了2例非小细胞肺癌ffpe样本，采用本发明的检测体系，对其细胞系dna进行检测，具体操作步骤如下：1. 非小细胞肺癌ffpe样本dna提取使用qiagen公司的qiaamp dna ffpe tissue kit对非小细胞肺癌ffpe样本进行dna提取，使用qubit进行dna浓度及质量检测，最后稀释成10ng/μl浓度，备用。
39.2. pcr扩增2.1 dpcr扩增体系配制按照qiacuity system 数字pcr反应系统的体系配制扩增反应：其中4
×
dpcr
‑
酶反应液10μl、10
×
引物探针混合物4.0μl、ffpe dna 2.0μl，去离子水补齐至40μl。
40.2.2 将反应混合物加到dpcr纳米微孔板加样孔中，随即密封纳米微孔板。
41.2.3 qiacuity system 数字pcr反应系统自动对纳米微孔板中的反应液进行分配、热循环扩增反应以及结果解读。
42.2.4 热循环扩增反应按照如下条件进行反应：95℃热启动，2分钟；95℃变性，15秒；60℃退火，15秒；72℃延伸，15秒；扩增40个循环；反应结束。
43.2.5 通过采集荧光信号，数据分析，得到检测样本中egfr基因多个位点的变异情况，给出判定结果。
44.由图4
‑
图6、图7
‑
图9可知，根据数字pcr结果图谱，可以比较直观地观察到待检测样本（ffpe dna
‑
1和ffpe dna
‑
2）在egfr t790m、19del、l858r位点的突变情况。
45.ffpe dna
‑
1的检测结果为egfr t790m阴性，突变比例为0.00%，其中fam检测的突变型信号copies为0 copies/40μl（图4 y轴坐标数据为egfr t790m突变型探针fam信号）；vic检测的野生型信号copies为2424 copies/40μl（图4 x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）；egfr 19del阳性，其中cy5检测的突变信号copies为1346 copies/40μl（图5 y轴坐标数据为egfr 19del突变型探针cy5信号，图5 x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）；egfr l858r阴性，其中rox检测的突变信号copies为1 copies/40μl（图6 y轴坐标数据为egfr l858r突变型探针rox信号，图6 x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）。
46.ffpe dna
‑
2的检测结果为egfr t790m阳性，突变比例为46.29%，其中fam检测的突变型信号copies为1348 copies/40μl（图7 y轴坐标数据为egfr t790m突变型探针fam信号）；vic检测的野生型信号copies为1564 copies/40μl（图7 x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）；egfr 19del阴性，其中cy5检测的突变信号copies为0 copies/40μl（图8 y轴坐标数据为egfr 19del突变型探针cy5信号，图8 x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）；egfr l858r阳性，其中rox检测的突变信号copies为1367 copies/40μl（图9 y轴坐标数据为egfr l858r突变型探针rox信号，图9 x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）。
47.实施例3 血浆游离核酸样本的检测
选取了3例肺癌病人的血浆样本，采用本发明的检测体系，对其血浆游离核酸（cfdna）进行检测，具体操作步骤如下：1.血浆游离核酸（cfdna）提取使用applied biosystems公司的magmax
™ꢀ
cell
‑
free dna isolation kit分别对3例肺癌病人的血浆样本cfdna提取，然后使用qubit进行cfdna浓度和质量检测。
48.2.pcr扩增2.1 dpcr扩增体系配制按照qiacuity system 数字pcr反应系统的体系配制扩增反应：其中4
×
dpcr
‑
酶反应液10μl、10
×
引物探针混合物4.0μl、cfdna 20.0μl，去离子水补齐至40μl。
49.2.2 将反应混合物加到dpcr纳米微孔板加样孔中，随即密封纳米微孔板。
50.2.3qiacuity system 数字pcr反应系统自动对纳米微孔板中的反应液进行分配、热循环扩增反应以及结果解读。
51.2.4 热循环扩增反应按照如下条件进行反应：95℃热启动，2分钟；95℃变性，15秒；60℃退火，15秒；72℃延伸，15秒；扩增40个循环；反应结束。
52.2.5 通过采集荧光信号，数据分析，得到检测样本中egfr基因多个位点的变异情况，给出判定结果。
53.由图10
‑
图12、图13
‑
图15、图16
‑
图18可知，根据数字pcr结果图谱，可以比较直观地观察到待检测样本在egfr t790m、19del、l858r位点的突变情况。
54.cfdna
‑
1的检测结果为egfr t790m阳性，突变比例为2.44%，其中fam检测的突变型信号copies为18 copies/40μl（图10 y轴坐标数据为egfr t790m 突变型探针fam信号）；vic检测的野生型信号copies为721 copies/40μl（图10 x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）；egfr 19del阴性，其中cy5检测的突变信号copies为0 copies/40μl（图11 y轴坐标数据为egfr 19del突变型探针cy5信号，图11x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）；egfr l858r阳性，其中rox检测的突变信号copies为35 copies/40μl（图12 y轴坐标数据为egfr l858r突变型探针rox信号，图12 x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）。
55.cfdna
‑
2的检测结果为egfr t790m阴性，突变比例为0.07%，其中fam检测的突变型信号copies为1 copies/40μl（图13 y轴坐标数据为egfr t790m突变型探针fam信号）；vic检测的野生型信号copies为1380 copies/40μl（图13 x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）；egfr 19del阳性，其中cy5检测的突变信号copies为51 copies/40μl（图14 y轴坐标数据为egfr 19del突变型探针cy5信号，图14 x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）；egfr l858r阳性，其中rox检测的突变信号copies为31 copies/40μl（图15 y轴坐标数据为egfr l858r突变型探针rox信号，图15 x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）。
56.cfdna
‑
3的检测结果为egfr t790m阴性，突变比例为0.00%，其中fam检测的突变型信号copies为0 copies/40μl（图16 y轴坐标数据为egfr t790m 突变型探针fam信号）；vic
检测的野生型信号copies为1641 copies/40μl（图16 x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）；egfr 19del阳性，其中cy5检测的突变信号copies为196 copies/40μl（图17y轴坐标数据为egfr 19del突变型探针cy5信号，图17 x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）；egfr l858r阴性，其中rox检测的突变信号copies为0 copies/40μl（图18 y轴坐标数据为egfr l858r突变型探针rox信号，图18 x轴坐标数据为t790m野生型探针vic信号）。
57.综上所述，本发明提供的egfr基因突变检测体系，是基于qiacuity system 数字平台展开，具有极高的特异性和灵敏性，相比荧光定量pcr平台上的检测产品，其特异性和灵敏度均有数量级程度的提高。本发明所述的每个样本的反应体系被分配到26000个纳米级微孔中，精确的体系控制及高效扩增反应可保证液滴无破裂、无交叉污染，最大效率地提高微量模板、低丰度靶标的检测精度。同时，基于五色荧光通道，在一个反应体系中同步进行egfr基因t790m、19del、l858r三个位点的检测，大大减少了反应中dna的用量，使得微量dna样本的检测得以实现，为后续临床诊断及评价提供准确可靠的参考依据。尤其是对于血浆游离dna样本这一类低浓度的样本类型，检测成功率高，在反复检测、反复取样等实际需求中，大幅度缩短检测周期，对组织样本取样困难、或是预后监控阶段无组织样本的患者的临床检验具有较高的应用价值。