苹果砧木抗盐胁迫相关基因MdLysMe3及其编码蛋白与应用的制作方法

苹果砧木抗盐胁迫相关基因mdlysme3及其编码蛋白与应用
技术领域
1.本发明属于农业生物技术领域，涉及苹果基因，尤其是涉及苹果砧木抗盐胁迫相关基因mdlysme3及其编码的蛋白的应用。


背景技术：

2.我国是苹果生产大国，多年来种植面积和产量均居世界首位。苹果是采用嫁接繁殖的果树，砧木的抗逆性直接影响着其栽植分布、产量及品质的形成。近年来，随着城市化进程加快、劳动力短缺和果园管理成本增加等问题的突显，我国苹果主要栽植区域正处于从环渤海湾、黄河故道、西北黄土高原至新疆中西部等新兴产区逐步西移的发展进程。然而在此过程中，我国西部以钠盐为主的高盐土质对苹果砧木的抗盐能力提出了更高要求，选育具有强抗盐性的砧木品种已成为我国苹果产业发展的迫切需要。
3.已有研究显示，细胞溶素基序(lysin motif，lysm)在植物识别几丁质、脂多糖等病原相关植物免疫中具有重要作用。目前对已鉴定的苹果lysm基因家族的功能研究主要集中于植物与真菌互作关系及对重金属胁迫的应答反应等，在非生物胁迫抗性功能与作用机制的研究方面尚属空白。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的在于提供苹果砧木盐胁迫抗性相关基因mdlysme3。
5.本发明的第二目的在于提供苹果砧木盐胁迫抗性相关基因mdlysme3编码的蛋白。
6.本发明的第三目的在于提供苹果砧木盐胁迫抗性相关基因mdlysme3在培育盐胁迫抗性增强的苹果砧木中的应用。
7.苹果砧木盐胁迫抗性蛋白mdlysme3，其氨基酸序列如seq id no：2所示。
8.编码权利要求1所述的苹果砧木盐胁迫抗性蛋白mdlysme3的基因。
9.所述的基因，其核苷酸序列如seq id no：1所示。
10.一种过表达载体，含有上述的基因。
11.所述的过表达载体，其骨架载体为表达载体pcambia1304。
12.上述基因在培育盐胁迫抗性增强的植物中的应用。
13.所述的应用，为构建上述基因的过表达载体，并将其转化到植物中，获得盐胁迫抗性增强的转基因植物。
14.所述转化采用农杆菌介导转化法或基因枪介导转化法。
15.所述植物为苹果砧木。
16.所述培育盐胁迫抗性增强的苹果砧木可采用如下方法：
17.构建苹果砧木盐胁迫相关基因mdlysme3的过表达载体，在其转录起始核苷酸前加上增强型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子；并将其转化到苹果砧木，筛选获得盐胁迫抗性增强的苹果砧木。
18.利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明的mdlysme3基因
导入植物细胞，可获得对盐逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。
19.本发明中通过构建一个苹果砧木中含有lysm功能域的抗盐胁迫相关蛋白mdlysme3的过表达载体，利用发根农杆菌进行侵染转化，使其在苹果砧木根系中过量表达。通过对转基因植株进行200mm nacl盐溶液胁迫处理，观察盐胁迫后的盐害反应，确定了mdlysme3基因在苹果砧木中的抗盐功能。本发明中的苹果砧木盐胁迫相关基因mdlysme3的过表达转基因植株在盐胁迫处理后，相对生长速率显著高于对照组，盐害指数显著低于对照组。表明该基因的过表达转基因植株能够显著提高苹果砧木对盐胁迫的抗性。本发明为培育盐胁迫抗性增强的苹果砧木提供了一条重要途径，对扩大苹果栽培适生区、加速抗逆分子育种进程等具有重要意义。
附图说明
20.图1为苹果抗盐砧木g935与敏盐砧木sh6盐胁迫下的mdlysme3基因表达水平检测。在200mm nacl模拟盐胁迫处理下，在多个时间点分别取样，荧光定量qpcr检测mdlysme3基因在两种砧木中的相对表达量。
21.图2为mdlysme3基因的克隆及其编码蛋白的亚细胞定位结果图。其中a为克隆mdlysme3基因的电泳结果图，m：dna分子量标准，泳道1：pcr空白对照，泳道2：mdlysme3基因。b为mdlysme3编码蛋白亚细胞定位结果图，将mdlysme3
‑
gfp融合蛋白表达载体与细胞质膜标记蛋白(osmca1
‑
mcherry)表达载体共转化玉米原生质体进行瞬时过表达，以过表达gfp非融合蛋白细胞为对照，共转化后避光培养16h，进行荧光定位观察。
22.图3为mdlysme3基因的植物过表达载体图。
23.图4为利用发根农杆菌msu4404侵染苹果砧木sh6的发根效果图。对继代后20d左右的sh6砧木组培苗进行侵染，2w左右开始发根，其后迅速生长，3
‑
4w根系长度达到5cm以上。
24.图5为mdlysme3基因过表达转基因植株中mdlysme3基因的相对表达量qpcr检测结果。对照植株为空载体转化植株，oe
‑
1～oe
‑
24为mdlysme3基因过表达转基因植株。
25.图6为对mdlysme3基因过表达转基因植株及对照植株的盐胁迫处理结果。200mm nacl胁迫处理21d，其中a为3个过表达转基因株系与对照植株(空载体)的盐害表型观察结果；b为盐胁迫下植株相对生长速率统计结果；c为盐胁迫下植株盐害指数统计结果。
具体实施方式
26.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
27.下面所用生物材料及试剂均为市售。
28.实施例1：抗盐胁迫相关基因mdlysme3的克隆
29.对比分析苹果抗盐砧木g935与敏盐砧木sh6盐胁迫下的基因表达水平显示，mdlysme3基因对苹果砧木抗盐胁迫起正向调控作用(图1)。本发明中以苹果抗盐砧木g935根系为材料，盐胁迫处理12h后提取总rna，通过反转录试剂盒将rna反转录为cdna。以cdna为模板，扩增目的片段。引物序列为：
30.mdlysme3
‑
f:5
’‑
atggcatcaagaaaactggcag
‑3’
31.mdlysme3
‑
r:5
’‑
tcattcggtaggagtgatcttg
‑3’
32.pcr扩增的反应体系为：takara la taq(5u/μl)0.2μl，10
×
la pcr buffer 2.0μl，dntp mixture(2.5mm each)3.2μl，mdlysme3
‑
f、mdlysme3
‑
r引物溶液(10pm/μl)各1.0μl，cdna模板1.0μl，ddh2o 11.6μl，共20μl。
33.pcr扩增的条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃30s，循环数为33个循环；72℃延伸5min；4℃保温。
34.对pcr产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为0.4kb左右的条带(图2中a)，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该片段。将该回收片段与pgem
‑
t easy连接，将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，根据pgem
‑
t easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒，再pcr鉴定阳性菌落后提取质粒进行测序。
35.测序结果表明扩增到的mdlysme3基因的开放阅读框(orf)为seq id no.1的自5’端第1至312位脱氧核糖核苷酸，其编码的氨基酸序列为seq id no.2蛋白质。将含序列seq id no.1所示mdlysme3基因的重组载体命名为pgem
‑
mdlysme3。进一步利用植物瞬时表达载体pezs
‑
nl进行玉米原生质体亚细胞定位，结果显示mdlysme3编码的蛋白为细胞质膜蛋白(图2中b)。
36.实施例2：用mdlysme3基因增强苹果敏盐砧木的抗盐性
37.1.构建重组表达载体
38.以上述重组载体pgem
‑
mdlysme3为模板，用含有bgl ii和bste ii接头序列的特异引物进行mdlysme3基因的pcr扩增；连接至pgem
‑
t easy载体、转化大肠杆菌、提取质粒测序验证后，进行bgl ii和bste ii双酶切，再将酶切产物正向插入植物表达载体pcambia1304的camv 35s启动子之后的bgl ii和bste ii酶切位点之间，得到重组载体pcambia1304
‑
mdlysme3(图3)。
39.引物序列如下：
40.mdlysme3
‑
oe1:5
’‑
agatctatggcatcaagaaaactggcag
‑3’
41.mdlysme3
‑
oe2:5
’‑
ggtaacctcattcggtaggagtgatcttg
‑3’
42.2.转基因苹果砧木的获得
43.将上述构建的重组表达载体pcambia1304
‑
mdlysme3及pcambia1304空载体(对照)用冻融法分别转化发根农杆菌msu4404，阳性菌落鉴定后，大量摇菌培养、集菌，再重悬于侵染缓冲液(ms+10mm mes+200μm as，ph 5.6)。
44.取继代后20d左右(高2
‑
3cm)的sh6砧木组培苗，去除下部叶片，于底部剪切面、茎部侧面，进行注射侵染(1ml规格的无菌注射器)；随后将整株植株浸入侵染液10min，期间震荡3
‑
5次。侵染结束后，无菌滤纸吸干，转入共培养培养基(1/2ms+30g/l suc+0.5mg/l6
‑
ba+7g/l agar,ph5.6)，23℃暗培养2
‑
3天。共培养结束后，无菌水清洗1次，浸洗液(ms+250mg/l cef)浸洗5min，再用无菌水清洗3次，随后无菌滤纸吸干，转移至生根培养基(1/2ms+30g/l suc+250mg/l cef+250mg/l timentin+7g/l agar,ph5.6)，26℃光下培养。
45.待3
‑
4周后根系长度达到5cm以上时(图4)，切取长1
‑
2cm左右根尖通过sds法提取dna，进行pcr鉴定，再对阳性植株炼苗、移栽至花盆中。引物序列如下：
46.35s
‑
f：5
’‑
ggattgatgtgacatctccactgac
‑3’
47.mdlysme3
‑
oe2：5
’‑
ggtaacctcattcggtaggagtgatcttg
‑3’
48.3.过表达转基因植株抗盐胁迫能力分析
49.为检测mdlysme3基因在转基因植株中的表达量，首先提取过表达转基因植株根系组织的总rna，以空载体转化的转基因植株根系为对照，以苹果β
‑
actin基因为内参进行荧光定量qpcr反应。引物序列为：
50.mdlysme3
‑
f1：5
’‑
atggcatcaagaaaactggcagat
‑3’
51.mdlysme3
‑
f2：5
’‑
tcattcggtaggagtgatcttg
‑3’
52.actin
‑
f1：5
’‑
ctgaacccaaaggctaatcg
‑3’
53.actin
‑
f2：5
’‑
actggcgtagagggaaagaa
‑3’
54.qpcr扩增的反应体系为：采用10μl反应体系，包括takara sybr 5.0μl，10pm/μl引物溶液各0.5μl，cdna模板1.0μl，ddh2o 3.0μl。
55.qpcr扩增的条件为：95℃预变性3min；94℃变性15s，60℃退火及延伸15s，40次循环，每次循环第2步进行荧光采集；最后退火至65℃，每隔30s上升0.5℃至95℃变性1min，采集荧光强度，分析基因相对表达量。
56.通过对35株转基因植株根系中mdlysme3基因表达水平的检测，挑选出相对于对照(空载体)植株中表达量提高10倍以上的植株24株(图5)，随机分成3组(8棵/组)用于进一步高盐胁迫处理。
57.200mm nacl水溶液处理21d后，观察盐害表型、统计相对生长速率及盐害指数。盐害指数(si)计算公式为si＝(s0
×
0+s1
×
1+s2
×
2+s3
×
3+s4
×
4)/n。其中s0为无盐害症状植株数；s1为轻度盐害，有少部分叶尖、叶缘或叶脉变黄植株数；s2为中度盐害，有一半以上的叶尖、叶缘焦枯的植株数；s3为重度盐害，大部分叶尖、叶缘焦枯或落叶的植株数；s4为极重度盐害，枝枯、叶落或死亡的植株数；n为总株数。
58.结果显示，就叶片焦枯程度而言，mdlysme3基因表达水平相对较高的植株其地上部受盐害程度较轻，如oe
‑
2、oe
‑
10、oe
‑
18、oe
‑
21、oe
‑
23等植株(图6)。统计结果显示，mdlysme3转基因植株相对生长速率为45.6％，对照植株的相对生长速率为21.4％；mdlysme3转基因植株盐害指数为0.62，对照植株的盐害指数为1.93，表明mdlysme3基因在一定盐浓度水平下具有提高苹果砧木抗盐性的功能。
59.相对生长速率([h
处理后
‑
h
处理前
]/h
处理前
×
100％)。