含色氨酸多肽烯烃化成环衍生物及其制备与应用

含色氨酸多肽烯烃化成环衍生物及其制备与应用
(一)技术领域
1.本发明涉及一种含色氨酸多肽烯烃化成环衍生物，及其制备方法和应用。
(二)

背景技术：

2.多肽是重要的生物活性分子，在药物化学、生物技术和化学生物学等领域有着广泛的应用。与线性肽相比，钉书肽具有较高的结合亲和力、靶向选择性、细胞通透性、蛋白水解稳定性和调节蛋白
‑
蛋白相互作用(ppis)的能力等突出优势。为了更好地了解它们的生理和药理功能，特别是对细胞内ppis的抑制作用，构建荧光钉书肽已被证明是药物化学领域的一种强有力的工具，因此备受关注。近年来，一些基于trp残基的后期修饰的方法已被成功开发出来。而传统对于trp残基的后期修饰的方法：通常需要先在trp的吲哚杂环的1号上引入保护基团或导向基团，完成其他位点的修饰后，最后脱保护或导向基团，实现修饰。这类方法方法步骤繁多，反应收率低，这些存在的问题大大的降低了对于含trp的多肽的后期修饰研究的进展。
(三)

技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种含色氨酸多肽烯烃化成环衍生物，及其制备方法和应用。
4.本发明采用的技术方案是：
5.一种含色氨酸多肽烯烃化成环衍生物，结构如(i)所示：
[0006][0007]
式(i)中，aa为氨基酸残基，m为0～1的自然数，n为2～3的自然数。
[0008]
优选的，所述烯烃化成环衍生物为下式之一：
[0009][0010]
本发明还涉及制备式(i)所示含色氨酸多肽烯烃化成环衍生物的方法，所述方法包括：以式(ii)所示丙烯酸酯修饰的含色氨酸多肽为底物，在催化剂、氧化剂存在下，于溶剂中、在50～100℃下搅拌反应12～36小时，制得式(i)所示含色氨酸多肽烯烃化成环衍生物；
[0011][0012]
环肽前体(ii)的一般合成步骤
[0013][0014]
如图所示，将二氯树酯(300mg，0.3mmol)悬浮在5ml二氯甲烷中，然后加入fmoc
‑
aa
‑
oh(0.9mmol)和diea(154.8mg，1.2mmol)，在振荡器中反应2小时后，300微升甲醇加入封端10分钟，然后用dmf将fmoc
‑
aa
‑
二氯树酯洗涤3次。fmoc
‑
aa
‑
二氯树酯用20％哌啶/dmf溶液脱fmoc保护30分钟。结束后，将h
‑
aa
‑
二氯树酯用dmf洗涤四次。随后的氨基酸偶联，使用
标准固相肽合成过程(spps)，直到最后一个氨基酸boc
‑
aa
‑
oh反应结束。使用25％六氟异丙醇/二氯甲烷反应1小时把多肽从二氯树酯上裂解下来，过滤，将树酯用二氯甲烷洗涤3次，合并滤液并真空浓缩，得到多肽。最后，利用常规的液相缩合反应步骤线性肽(0.2mmol)，1a(44mg，0.2mmol)，edci(60mg，0.3mmol)和hobt(40mg，0.3mmol)溶解在3ml dmf中，然后加入diea(78mg，0.6mmol)，在室温下搅拌12小时。反应完成后，加入10ml乙酸乙酯和10ml水，分离有机层，分别用5ml 1n盐酸，5ml饱和碳酸氢钠，5ml饱和氯化钠溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩至得到线性肽粗品(ii)，再通过硅胶柱以及制备硅胶板进一步分离纯化。
[0015]
所述催化剂为下列之一：醋酸钯，三氟乙酸钯，二氯化钯；
[0016]
所述氧化剂为下列之一：氧气，过氧苯甲酸叔丁酯，对苯醌，醋酸铜，醋酸银；
[0017]
所述溶剂为下列之一：对二甲苯，n,n
‑
二甲基甲酰胺，醋酸，甲苯，四氢呋喃/醋酸溶液，1,4二氧六环/醋酸溶液；
[0018]
所述含色氨酸多肽、催化剂、氧化剂的物质的量之比为1:0.05～0.15:0.5～2。
[0019]
具体的，所述四氢呋喃/醋酸溶液或1,4
‑
二氧六环/醋酸溶液的体积比为1～5:1。
[0020]
优选的，所述催化剂为醋酸钯，所述氧化剂为对苯醌，所述溶剂为1,4
‑
二氧六环/醋酸溶液(3:1，v/v)，所述反应温度为80℃，所述反应时间为24h，所述含色氨酸多肽、催化剂、氧化剂的物质的量之比为1:0.1:1。
[0021]
所述烯烃化衍生物分离纯化方法如下：反应混合物中加入饱和nacl水溶液，用乙酸乙酯萃取，取有机层经过无水硫酸钠干燥、过滤、常温下旋转蒸除溶剂，即得粗品；将粗品进行硅胶柱层析，收集得到的洗脱液经减压除去溶剂，干燥，得到(i)所示含色氨酸多肽烯烃化成环衍生物。
[0022]
本发明还涉及所述烯烃化衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0023]
优选的，所述肿瘤为肺癌。
[0024]
优选的，所述化合物结构如下式所示：
[0025][0026]
本发明的有益效果主要体现在：本发明化合物通过钯催化色氨酸侧链c(sp2)
‑
h直接氧化heck反应制得，操作过程简单，无导向基团，位点选择性高，反应高效，只需一步便可制得，该化合物具有较好抗肿瘤应用前景，为研发抗肿瘤药物提供了新的方案。
(四)附图说明
[0027]
图1为式(i
a
)所示化合物的核磁氢谱；
[0028]
图2为式(i
a
)所示化合物的碳谱；
[0029]
图3为式(i
b
)所示化合物的核磁氢谱；
[0030]
图4为式(i
b
)所示化合物的碳谱；
[0031]
图5为环肽化合物(i
a
)的抗肿瘤活性研究。
(五)具体实施方式
[0032]
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0033]
实施例1：化合物(i
a
)的制备
[0034][0035]
如式ii
a
所示含烯烃的色氨酸线性多肽(环肽前体(ii)的一般合成步骤)(0.2mmol)，对苯醌(0.4mmol)，pd(oac)2(0.02mmol)称于10ml规格的圆底烧瓶中，加入10ml 1,4二氧六环/acoh＝3：1溶液。盖上胶塞反应物加热至80摄氏度24小时。将40ml乙酸乙酯和20ml水加入到反应液中。有机层分别用20ml 1n盐酸，20ml饱和碳酸氢钠，20ml饱和氯化钠溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，得到的粗产物通过硅胶柱或制备硅胶板进一步纯化(乙酸乙酯：石油醚＝4：1，r
f
＝0.2)，获式i
a
所示的化合物纯品80.7mg(收率40％)，其核磁氢谱、碳谱参见图1～图2。
[0036]1h nmr(600mhz,dmso)δ11.43(s,1h),8.20(s,1h),8.15(d,j＝8.9hz,1h),7.94(s,1h),7.89(d,j＝7.2hz,1h),7.63(d,j＝15.9hz,1h),7.53(d,j＝8.0hz,1h),7.34(d,j＝8.2hz,1h),7.22(t,j＝7.5hz,1h),7.04(t,j＝7.6hz,1h),6.82(d,j＝9.0hz,1h),6.70(d,j＝15.4hz,1h),6.40(d,j＝15.9hz,1h),6.34(dd,j＝17.3,1.4hz,1h),4.78
–
4.68(m,2h),4.55(d,j＝8.3hz,1h),4.47
–
4.42(m,1h),4.32(dd,j＝13.6,7.5hz,1h),3.79(s,1h),3.69(s,3h),3.65(d,j＝6.0hz,1h),3.63(s,1h),3.29
–
3.19(m,2h),2.96(s,5h),2.84(dd,j＝15.3,5.7hz,1h),2.46(s,3h),2.41(s,3h),1.41(s,8h),1.39(s,8h),1.38(s,7h).
13
c nmr(151mhz,dmso)δ172.53,171.08,169.79,169.73,169.02,166.15,157.93,156.49,155.24,138.10,137.24,133.10,131.89,131.58,129.21,124.78,120.88,120.53,119.16,116.75,114.61,86.77,80.61,79.00,62.70,60.22,56.24,52.89,49.88,42.94,37.77,28.76,28.61,28.06,27.12,21.22,19.39,18.04,14.55,12.73.ms(esi)m/z(relative intensity)1094.81(100)[m+h
+
].
[0037]
实施例2：化合物(i
b
)的制备
[0038][0039]
如式ii
b
所示含烯烃的色氨酸线性多肽(环肽前体(ii)的一般合成步骤)(0.2mmol)，对苯醌(0.4mmol)，pd(oac)2(0.02mmol)称于10ml规格的圆底烧瓶中，加入10ml 1,4二氧六环/acoh＝3：1溶液。盖上胶塞反应物加热至80摄氏度24小时。将40ml乙酸乙酯和20ml水加入到反应液中。有机层分别用20ml 1n盐酸，20ml饱和碳酸氢钠，20ml饱和氯化钠溶液洗涤，并用无水硫酸钠干燥，过滤，真空浓缩，得到的粗产物通过硅胶柱或制备硅胶板进一步纯化(乙酸乙酯：石油醚＝4：1，r
f
＝0.45)，获式i
b
所示的化合物纯品80.7mg(收率40％)，其核磁氢谱、碳谱参见图3～图4。
[0040]1h nmr(600mhz,dmso)δ11.43(s,1h),8.20(s,1h),8.15(d,j＝8.9hz,1h),7.94(s,1h),7.89(d,j＝7.2hz,1h),7.63(d,j＝15.9hz,1h),7.53(d,j＝8.0hz,1h),7.34(d,j＝8.2hz,1h),7.22(t,j＝7.5hz,1h),7.04(t,j＝7.6hz,1h),6.82(d,j＝9.0hz,1h),6.70(d,j＝15.4hz,1h),6.40(d,j＝15.9hz,1h),6.34(dd,j＝17.3,1.4hz,1h),4.78
–
4.68(m,2h),4.55(d,j＝8.3hz,1h),4.47
–
4.42(m,1h),4.32(dd,j＝13.6,7.5hz,1h),3.79(s,1h),3.69(s,3h),3.65(d,j＝6.0hz,1h),3.63(s,1h),3.29
–
3.19(m,2h),2.96(s,5h),2.84(dd,j＝15.3,5.7hz,1h),2.46(s,3h),2.41(s,3h),1.41(s,8h),1.39(s,8h),1.38(s,7h).
13
c nmr(151mhz,dmso)δ172.53,171.08,169.79,169.73,169.02,166.15,157.93,156.49,155.24,138.10,137.24,133.10,131.89,131.58,129.21,124.78,120.88,120.53,119.16,116.75,114.61,86.77,80.61,79.00,62.70,60.22,56.24,52.89,49.88,42.94,37.77,28.76,28.61,28.06,27.12,21.22,19.39,18.04,14.55,12.73.ms(esi)m/z(relative intensity)1094.81(100)[m+h
+
].
[0041]
实施例9：化合物(i
a
)的抗肿瘤活性检测
[0042]
选取肿瘤细胞a549(肺癌细胞)，采用mtt法进行抗肿瘤细胞增殖活性检测。细胞以4000～5000个/孔的浓度接种至含有10％胎牛血清的1640培养液的96孔板中，并在板盖上加上注释，于5％co2、37℃培养12小时，待细胞在96孔板上贴壁，在无菌操作台中用移液枪加待测药物(实施例1制备的化合物(i
a
))，使每孔药物浓度分别为2μm、5μm、10μm、20μm、40μm五个浓度梯度，每个浓度设置有三个平行组，并再次将96孔板置于5％co2、37℃培养24小时。取出96孔板，向每个孔中加入10μl的mtt试剂盒试剂(购自promega公司)，避光在5％co2、37℃条件下孵化4小时，吸除上清后加入150ul无菌dmso溶解甲臜，进一步在37℃培养箱中溶解5～10min，最后利用酶标仪测其吸光度。从而计算细胞活力和细胞毒性，用graphpad prism software软件处理，计算ic
50
以及ic
50 95％可信区间为22.976
±
8.221，结果见图5。
[0043]
实验结果表明，化合物(i
a
)可靶向整合素αvβ3高表达的肿瘤细胞，并具有一定的抗肿瘤活性。