一种稳定同位素标记硝西泮内标试剂的制备方法与流程

1.本发明涉及一种食品安全检测用稳定同位素标记硝西泮内标试剂的制备方法，属于食品安全检测用标准物质研发领域。


背景技术：

2.硝西泮是一种苯二氮类药物，为二类精神类药品，临床上常用于治疗失眠及抗惊厥，肌阵挛性癫痫。因其具有镇静催眠、抗焦虑、抗惊厥和肌肉松弛作用常被不法厂商添加于镇静安神类中成药及保健食品中，以增强其疗效；或被个别畜牧业饲养者作为生长促进剂添加于饲料中，使动物嗜睡少动，减少动物维持体能的营养物质消耗，有益于增重；或在动物运输和屠宰过程中使用，减轻动物机体对不良刺激的反应，降低死亡率，防止肉质的变化。但过量服用硝西泮可产生头晕嗜睡、乏力、昏迷、呼吸抑制等副作用，长期服用容易产生耐受性、依赖性和成瘾性。因此，我国《药品管理法实施条例》与《食品卫生法》明确规定，禁止在中成药及保健食品中添加化学药物成分；农业部第176号公告也规定在动物饲料和饮用水中严禁使用苯二氮类药物。目前相关的检测方法有：饲料中的检测标准为农业部发布的《ny/t1757
‑
2009饲料中苯骈二氮杂类药物的测定液相色谱
‑
串联质谱法》；食品中相关的检测标准方法为国家市场监督管理总局发布的食品补充检验方法《bjs 201710保健食品中75种非法添加化学药物的检测》和海关总署发布的《sn/t 3847
‑
2019出口食品中苯二氮卓类药物残留量的测定液相色谱
‑
质谱/质谱法》。其中《sn/t 3847
‑
2019出口食品中苯二氮卓类药物残留量的测定液相色谱
‑
质谱/质谱法》中已采用稳定同位素内标法进行定量，并以硝西泮(苯基
‑
d5)作为同位素内标来使用。
3.目前，稳定同位素标记的硝西泮只有国外的标准品公司所提供，只能靠进口解决，严重制约了该化合物在国内食品安全检测中的应用。迄今为止，稳定同位素标记硝西泮的合成文献只有karlsen m.salihi等于2014年发表的专利(wo 2014013063 a1)。该专利是从稳定同位素标记的苯
‑
13
c6开始，通过傅
‑
克酰基化、成环、重铬酸盐氧化等3步反应而得到，条件要求苛刻，最后氧化步骤需用到有毒且致癌的强氧化剂重铬酸盐，增加实验人员的健康风险及废液处理的环境风险，实验废液处理成本高。
4.因此，亟需开发一种操作简单、条件温和、对人员及环境友好的稳定同位素标记硝西泮的制备方法，以满足该化合物在食品安全检测方面的日益增长的应用需求。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种适用于食品安全检测用稳定同位素标记硝西泮的制备方法。该合成方法原料易得、反应路线短、操作简单、条件温和、避免使用有毒及致癌化学试剂；最终产品化学纯度高，同位素丰度不稀释，有效降低了产品成本。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
7.1.一种稳定同位素标记硝西泮内标试剂的制备方法，该稳定同位素标记硝西泮内标试剂的化学结构如式(labeled
‑
nitrazepam)所示：
[0008][0009]
其中r为h或d，*为
12
c或
13
c，其特征在于，其制备步骤总路线为：
[0010][0011]
其中r为h或d，*为
12
c或
13
c，x和y分别为cl、br、i中的一种，制备步骤如下：
[0012]
(1)在催化剂、配体、添加剂、有机溶剂存在条件下，加入稳定同位素标记苯硼酸，然后加入2
‑
氨基
‑5‑
硝基苯甲腈，在30℃～120℃条件下，反应12～48小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应混合溶液用水淬灭，过滤，滤液用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记2
‑
氨基
‑5‑
硝基二苯甲酮；
[0013]
该步骤反应如下所示：
[0014][0015]
其中稳定同位素标记苯硼酸的化学结构如式(i)所示，稳定同位素标记2
‑
氨基
‑5‑
硝基二苯甲酮的化学结构如式(ii)所示，其中r为h或d，*为
12
c或
13
c；
[0016]
(2)将稳定同位素标记2
‑
氨基
‑5‑
硝基二苯甲酮溶于有机溶剂中，加入卤乙酰卤，在20℃～80℃条件下，反应1～10小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应混合溶液用水淬灭，过滤，滤液用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记2
‑
卤乙酰胺基
‑5‑
硝基二苯甲酮；
[0017]
该步骤反应如下所示：
[0018][0019]
其中稳定同位素标记2
‑
卤乙酰胺基
‑5‑
硝基二苯甲酮的化学结构如式(ⅲ)所示，其中r为h或d，*为
12
c或
13
c，x和y分别为cl、br、i中的一种；
[0020]
(3)将稳定同位素标记2
‑
卤乙酰胺基
‑5‑
硝基二苯甲酮溶于有机溶剂中，加入乌洛托品和铵盐，在30℃～120℃条件下，反应1
‑
8小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应混合溶液旋干，加入水，用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥；减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记硝西泮。
[0021]
该步骤反应如下所示：
[0022][0023]
其中稳定同位素标记硝西泮的化学结构如式(labeled
‑
nitrazepam)所示，其中r为h或d，*为
12
c或
13
c。
[0024]
所述步骤(1)中，催化剂为醋酸钯、氯化钯、双(三苯基膦)二氯化钯、四(三苯基膦)钯、双(二苯基膦苯基醚)二氯化钯、双(二苯基膦二茂铁)二氯化钯、乙酰丙酮钯、三氟乙酸钯、双(二苯基磷)乙烷二氯化钯、三(二亚苄基丙酮)二钯、三(二亚苄基丙酮)二钯氯仿加合物中的一种或几种；配体为2,2
’‑
联吡啶、4,4
’‑
二甲基
‑
2,2
’‑
联吡啶、5,5
’‑
二甲基
‑
2,2
’‑
联吡啶、4,4
’‑
二甲氧基
‑
2,2
’‑
联吡啶、1,10
‑
菲罗啉、4,7
‑
二甲基
‑
1,10
‑
菲罗啉、4,7
‑
二苯基
‑
1,10
‑
菲罗啉中的一种或几种；添加剂为盐酸、硫酸、冰醋酸、甲酸、三氟乙酸、二氯乙酸、甲烷磺酸、对甲苯磺酸、苯甲酸中的一种或几种；溶剂为四氢呋喃、二氧六环、甲苯、二甲苯、
2
‑
甲基四氢呋喃、n,n
‑
二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、苯、氯苯中的一种或几种；稳定同位素标记的苯硼酸为氘标记的苯硼酸、
13
c标记的苯硼酸中的一种；反应温度为30℃～120℃；反应时间为12～48小时。
[0025]
所述步骤(2)中，卤乙酰卤为氯乙酰氯、氯乙酰溴、溴乙酰氯、溴乙酰溴、碘乙酰氯中的一种或几种；有机溶剂为四氢呋喃、2
‑
甲基四氢呋喃、二氧六环、苯、甲苯、二甲苯、乙腈、n,n
‑
二甲基甲酰胺中的一种或几种；反应温度为20℃～80℃；反应时间为1～10小时。
[0026]
所述步骤(3)中，有机溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇中的一种或几种；所用铵盐为氯化铵、甲酸胺、乙酸铵、硫酸铵中的一种或几种；反应温度为30℃～120℃；反应时间为1～8小时。
[0027]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：该合成方法原料易得、操作简单、条件温和、并且避免使用剧毒及致癌的化学试剂，有效降低了人员健康及环境污染风险。本制备方法得到的食品安全检测用稳定同位素标记硝西泮对我国相关的食品安全监管检测工作具有重要意义。
附图说明：
[0028]
图1：2
‑
氨基
‑5‑
硝基二苯甲酮(苯基
‑
d5)的1hnmr图
[0029]
图2：2
‑
氨基
‑5‑
硝基二苯甲酮(苯基
‑
d5)的lc
‑
ms图
[0030]
图3：2
‑
氯乙酰胺基
‑5‑
硝基二苯甲酮(苯基
‑
d5)的1h nmr图
[0031]
图4：硝西泮(苯基
‑
d5)的1h nmr图
[0032]
图5：硝西泮(苯基
‑
d5)的lc
‑
ms图
[0033]
图6：硝西泮(苯基
‑
d5)的hplc图
具体实施方式
[0034]
下面结合实施例及其附图进一步叙述本发明，但它并不是对本发明的范围的任何限制。
[0035]
实施例1：2
‑
氨基
‑5‑
硝基二苯甲酮(苯基
‑
d5)制备
[0036][0037]
在500ml三口瓶中，加入氘代苯硼酸(12.71g，0.1mol)、2
‑
氨基
‑5‑
硝基二苯甲酮(8.15g，0.05mol)、催化剂四(三苯基膦)钯(2.89g，2.5mmol)、配体4,4
’‑
二甲基
‑
2,2
’‑
联吡啶(920mg，5mmol)、添加剂三氟乙酸(57g，0.5mol)和四氢呋喃：水＝1：1的混合溶剂(250ml)；在90℃下反应24小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，反应液冷却至室温，加入200ml水，用乙酸乙酯(3
×
300ml)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记2
‑
氨基
‑5‑
硝基二苯甲酮(苯基
‑
d5)(11.49g，收率93％)。1hnmr(dmso
‑
d6，600mhz)：δ8.20(s，1h)，8.20(s，2h)，8.12(dd，1h)，6.97(d，1h，)，参见附图1；lc
‑
ms(esi+)248[m+h]
+
，
参见附图2。
[0038]
实施例2：2
‑
氯乙酰胺基
‑5‑
硝基二苯甲酮(苯基
‑
d5)的制备
[0039][0040]
在100ml三口瓶中，加入2
‑
氨基
‑5‑
硝基二苯甲酮(苯基
‑
d5)(2.37g，10mmol)、氯乙酰氯(1.69g，15mmol)和干燥的二氧六环(20ml)；充入氮气，在20℃条件下反应12小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，加入20ml水，用乙酸乙酯(3
×
30ml)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记2
‑
氯乙酰胺基
‑5‑
硝基二苯甲酮(苯基
‑
d5)(2.97g，收率95％)。1h nmr(dmso
‑
d6，600mhz)：δ11.0(s，1h)，8.50(dd，1h)，8.20(d，1h)，8.06(d，1h，)，4.23(s，2h)，参见附图3。
[0041]
实施例3：硝西泮(苯基
‑
d5)的制备
[0042][0043]
在50ml三口瓶中，加入稳定同位素标记2
‑
氯乙酰胺基
‑5‑
硝基二苯甲酮(苯基
‑
d5)(3.23g，10mmol)、乌洛托品(2.80g，20mmol)、氯化铵(1.07g，20mmol)、甲醇(20ml)；在氮气保护下，加热至回流，并在该温度反应24小时；tlc跟踪反应原料反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，加入20ml水，用乙酸乙酯(3
×
30ml)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记硝西泮(苯基
‑
d5)(2.57g，收率90％)。1hnmr(dmso
‑
d6，600mhz)：δ11.16(s，1h)，8.44(dd，1h)，8.03(d，1h)7.45(d，1h)，4.26(s，2h)，参见图4；lc
‑
ms(esi+)287[m+h]
+
，参见附图5；hplc测得化学纯度＝99.55％，参见附图6；同位素丰度＝98.56％，参见表1。
[0044]
表1硝西泮(苯基
‑
d5)的同位素丰度
[0045][0046]
质量标准满足食品安全检测用液相色谱串联质谱法所需同位素内标试剂要求。
[0047]
13
c标记标记的硝西泮合成步骤同上述实施例中硝西泮(苯基
‑
d5)的合成步骤。
[0048]
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。