一种利用抗冻蛋白-内含肽作为纯化标签实现重组蛋白纯化的方法和应用与流程

一种利用抗冻蛋白
‑
内含肽作为纯化标签实现重组蛋白纯化的方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种利用抗冻蛋白
‑
内含肽序列作为纯化标签实现外源重组蛋白分离纯化的方法和应用。


背景技术：

2.目前异源表达的重组蛋白常用亲和色谱进行分离纯化，该方法通常利用基因重组技术将亲和标签与目的蛋白融合表达，之后用偶联有特定配基的色谱填料一步纯化获得较高纯度的重组蛋白，具有条件温和、特异性好、适用范围广等优点。目前常用作亲和标签的多肽或蛋白主要包括多聚组氨酸、麦芽糖结合蛋白、小泛素相关修饰蛋白、谷胱甘肽巯基转移酶等。然而，利用亲和色谱纯化重组蛋仍然存在一些局限，如：(1)纯化过程需要使用较为昂贵的色谱填料和色谱柱；(2)对于一些蛋白，带有亲和标签会影响其功能活性，因此需要用蛋白酶切除亲和标签，不仅需要使用昂贵的蛋白酶，而且需要额外的分离过程去除蛋白酶和标签片段。上述局限导致工业上利用亲和色谱纯化重组蛋白的成本较高且耗时较长，不利于规模化生产过程。因此，发现和利用自然界中特定生物大分子间的特异性相互作用，开发新型纯化标签，建立低成本、操作简便、易切除标签序列的纯化方法具有重要意义。
3.抗冻蛋白(antifreeze protein，afp)是一类能特异性结合到冰晶表面抑制其进一步生长，并且能降低水溶液的冰点但对熔点影响较小从而产生热滞效应的蛋白质，它们最初发现于极地海洋鱼类的体内。afp与冰的结合作用是一种涉及分子间氢键、疏水相互作用、范德华力的特异性受体
‑
配体相互作用，结合强度较高，而将冰融化即可实现afp与冰的分离。来源于南极鱼lycodichthyus dearborni的afp是一种分子量约为7kda的球蛋白，不仅能特异性结合冰晶，而且具有较好的温度和ph稳定性。利用afp的冰结合特性，研究人员建立了以冰为吸附介质纯化afp的方法，包括使用带有温控系统的“手指”插入到细胞破碎上清液中，或将细胞破碎上清液倒入预先形成冰壳的圆底烧瓶中进行吸附从而纯化afp。
4.内含肽是未成熟前体蛋白中的一段序列，其通过重排、转酯、环化等自催化过程将自身切除并将紧邻内含肽n端和c端的多肽链通过一个新形成的肽键连接，形成成熟蛋白。将内含肽的n端或c端关键氨基酸残基突变后可以将原来的剪接反应转变为特定末端的断裂反应。如源自蟾分枝杆菌mycobacterium xenopi gyra基因的内含肽mxe gyra经过n198a突变后，c端不能发生断裂反应，但加入二硫苏糖醇(dithiothreitol，dtt)可以诱导n端发生断裂反应。由于内含肽能在特定溶液微环境中发生自催化剪接/断裂反应，反应条件温和且无需蛋白酶，因此在酶工程、合成生物学、蛋白分离纯化领域具有广泛的应用前景。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种利用抗冻蛋白
‑
内含肽序列作为纯化标签实现外源重组蛋白分离纯化的方法和应用，从而解决现有重组蛋白纯化技术中需要昂贵的色谱填料和色谱柱、切除标签序列需要使用蛋白酶进一步增加成本和分离步骤，导致分离纯化成本高、流
程复杂、难以规模化等问题。
6.为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
7.根据本发明的第一方面，提供一种利用抗冻蛋白
‑
内含肽作为纯化标签实现外源重组蛋白分离纯化的方法，所述方法包括以下步骤：
8.(1)构建含有抗冻蛋白
‑
内含肽纯化标签的基因和待分离纯化的外源重组蛋白基因的重组表达载体，再将该重组表达载体转入表达宿主细胞，获得重组工程菌；
9.(2)培养所述重组工程菌，诱导外源重组蛋白表达；
10.(3)收集菌体细胞并进行细胞破碎，将细胞破碎上清液稀释后加入到圆底烧瓶中制备的冰壳表面，利用冰作为吸附介质从细胞破碎上清液中进一步分离纯化带有抗冻蛋白
‑
内含肽纯化标签的融合蛋白；
11.(4)将吸附有融合蛋白的冰壳表面清洗后融化，加入断裂反应缓冲液，诱导内含肽的n端发生断裂反应，得到纯化标签和目的蛋白的混合物；
12.(5)透析后再次加到新的冰壳表面，利用冰吸附去除抗冻蛋白
‑
内含肽纯化标签，得到纯化后的外源重组蛋白。
13.优选地，所述抗冻蛋白基因是一种根据南极鱼lycodichthyus dearborni的afp基因进行密码子优化所得，该基因具有seq id no.1所示的核苷酸序列。
14.优选地，所述内含肽基因源自蟾分枝杆菌mycobacterium xenopi gyra经过n198a突变，存在于商品化质粒ptwin1上，具有seq id no.2所示的核苷酸序列。
15.优选地，所述抗冻蛋白
‑
内含肽纯化标签的基因为如seq id no.8所示的核苷酸序列。
16.所示抗冻蛋白
‑
内含肽纯化标签的基因从5’端至3’端依次包括：三个氨基酸mrm对应的核苷酸序列、mxe gyra内含肽基因、linker、抗冻蛋白afp基因。
17.优选地，所述linker序列具有如seq id no.3所示的核苷酸序列。
18.作为举例而非限制，所述表达宿主细胞优选为大肠杆菌e.coli bl21(de3)。
19.所述外源重组蛋白包括：绿色荧光蛋白、谷胱甘肽巯基转移酶等。本发明通过上述两种外源重组蛋白验证了抗冻蛋白
‑
内含肽纯化标签用于重组蛋白分离纯化的通用性，但是应当理解，此处仅作为举例而非限制，外源重组蛋白并不仅限于上述两种。
20.所述步骤(4)中的断裂反应缓冲液中带有断裂反应时终浓度为40mm的二硫苏糖醇(dtt)。
21.根据本发明的第二方面，还提供一种利用抗冻蛋白
‑
内含肽纯化标签实现外源重组蛋白分离纯化的方法在制备工业用酶制剂、多肽和蛋白类药物中的应用。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
23.根据本发明提供的方法，首次利用抗冻蛋白
‑
内含肽序列作为纯化标签，实现了外源重组蛋白的分离纯化，该方法与传统的纯化方法相比，分离纯化无需色谱填料和色谱柱、操作简单、无需使用蛋白酶即可去除纯化标签，节省了大量人力、物力和时间成本。
24.根据本发明提供的方法，抗冻蛋白
‑
内含肽纯化标签序列位于环状质粒载体上，易于保存和分子克隆操作。
25.总之，本发明提供了一种以抗冻蛋白
‑
内含肽序列作为纯化标签对外源重组蛋白进行分离纯化的方法，该方法无需色谱填料和色谱柱、操作简单、无需蛋白酶即可切除纯化
标签，相比传统的亲和色谱纯化方法以及利用蛋白酶切除标签和后续分离标签的方法节约了大量人力、物力和时间成本，为外源重组蛋白的高效分离纯化提供了一种新策略。
附图说明
26.图1为是本发明的以抗冻蛋白
‑
内含肽序列作为纯化标签对外源重组蛋白进行分离纯化的流程示意图。
27.图2是本发明用于冰吸附蛋白的设备装置。
28.图3是融合抗冻蛋白
‑
内含肽纯化标签的gst的蛋白分离纯化电泳图。其中，m：蛋白分子量标准品；1、2：重组工程菌诱导前、诱导后全菌样品；3、4：重组工程菌的细胞破碎上清液、稀释为1mg/ml的细胞破碎上清液；5：冰吸附的目的融合蛋白；6：断裂反应后的混合物样品；7：再次用冰吸附去除标签后的含目的蛋白gst样品。
29.图4是融合抗冻蛋白
‑
内含肽纯化标签的gfp的蛋白分离纯化电泳图。其中，m：蛋白分子量标准品；1、2：重组工程菌诱导前、诱导后全菌样品；3、4：重组工程菌的细胞破碎上清液、稀释为1mg/ml的细胞破碎上清液；5：冰吸附的目的融合蛋白；6：断裂反应后的混合物样品；7：再次用冰吸附去除标签后的含目的蛋白gfp样品。
具体实施方式
30.以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
31.本发明所用的试剂或原料，若无特殊声明，均为市售可得。
32.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南：第4版》中所述的条件进行，或按照试剂生产厂商所建议的条件。
33.实施例中用到的试剂、缓冲液和培养基如下：
34.主要试剂的配制：
35.卡那霉素：利用灭菌双蒸水配制100mg/ml的卡那霉素溶液，使用0.22μm灭菌滤膜过滤除菌，除菌后的卡那霉素溶液置于
‑
20℃保存。
36.10
×
tbe：tris：108g、na2edta
·
2h2o：7.44g、硼酸：55g，去离子水溶解定容至1000ml。
[0037]5×
蛋白电泳缓冲液：tris：15.1g、甘氨酸：94g、sds：5g，去离子水溶解定容至1000ml。
[0038]5×
loading buffer：ph 6.8的1m tris
‑
hcl：1.25ml、sds：0.5g、溴酚蓝：25mg、甘油2.5ml，去离子水溶解定容至5ml，以0.5ml分装一管，使用前加入25μl巯基乙醇。
[0039]
sds
‑
page染色液：考马斯亮蓝r
‑
250：1g、异丙醇：250ml、冰乙酸：100ml，去离子水定容至1000ml。
[0040]
sds
‑
page脱色液：无水乙醇：50ml、冰乙酸：100ml，去离子水定容至1000ml。
[0041]
lb培养基配方：蛋白胨：10g、酵母粉：5g、nacl：10g，溶于600ml去离子水后将ph调至7.2，定容至1000ml，121℃灭菌20min。
[0042]
tb培养基配方：溶液1：蛋白胨：12.0g、酵母粉：24.0g、甘油：4.0ml，用去离子水定容至900ml；溶液2：kh2po4：2.31g、k2hpo4·
3h2o：16.4g溶于100ml去离子水；溶液1和溶液2在
使用前以9:1(v/v)混合。
[0043]
冰吸附冷冻液：将100g cacl2·
6h2o、20ml去离子水、50g冰混合，温度约
‑
40℃。
[0044]
冰吸附制冷液：将20g cacl2·
6h2o、30ml去离子水、68g冰混合，温度约
‑
1.0℃～
‑
1.5℃。
[0045]
断裂反应缓冲液：终浓度为40mm dtt，1mm edta，ph 8.5的50mm tris
‑
hcl缓冲液，配制成5倍浓缩液。
[0046]
质粒提取试剂盒和dna胶回收试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司
[0047]
实施例1 pet
‑
24a
‑
gst
‑
mxe gyra
‑
linker
‑
afp表达载体的构建
[0048]
(1)分别合成以下引物：
[0049]
seq id no.4：引物p1：
[0050]5’‑
ggaattccatatgatgtcccctatactaggttattg
‑3’
，其中，下划线部分为quickcut
tm nde i识别位点。
[0051]
seq id no.5：引物p2：
[0052]5’
tgcatctcccgtgatgcacattcgcatttttggaggatggtcgccaccaccaaac
‑3’
，其中，下划线部分为三个氨基酸mrm对应的碱基序列。
[0053]
seq id no.6：引物p3：
[0054]5’‑
gtttggtggtggcgaccatcctccaaaaatgcgaatgtgcatcacgggagatgca
‑3’
，其中，下划线部分为三个氨基酸mrm对应的碱基序列。
[0055]
seq id no.7：引物p4：
[0056]5’‑
atcactcaagcttagcgtggctgacgaacccgttc
‑3’
，其中，下划线部分为quickcut
tm hind iii识别位点。
[0057]
(2)在上述p1和p2引物的引导下，以pgex
‑
4t
‑
1质粒为模板进行pcr扩增gst基因。在上述p3和p4引物的引导下，以ptwin1质粒为模板进行pcr扩增mxe gyra基因。利用1％琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒回收上述基因片段，以回收的两个基因片段为模板，在上述p1和p4引物的引导下进行重叠延伸pcr扩增得到gst
‑
mxe gyra基因。
[0058]
(3)合成带有如seq id no.1和seq id no.3所示的linker
‑
afp基因的核苷酸序列，该序列位于pet
‑
24a表达载体上，标识为pet
‑
24a
‑
linker
‑
afp，由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。将该质粒和gst
‑
mxe gyra基因分别用限制性核酸内切酶quickcut
tm nde i和quickcut
tm hind iii进行双酶切。回收线性载体和目的基因片段，用t4 dna连接酶进行连接反应，之后热激法转化大肠杆菌dh10b感受态细胞，用含50μg/ml卡那霉素的lb固体培养基进行筛选，挑取单菌落利用菌落pcr法鉴定阳性克隆。将阳性克隆利用摇瓶进行培养和提取质粒，经基因测序鉴定，获得正确的重组质粒，命名为pet
‑
24a
‑
gst
‑
mxe gyra
‑
linker
‑
afp。
[0059]
实施例2 gst
‑
mxe gyra
‑
linker
‑
afp的异源表达
[0060]
将实施例1中获得的重组表达质粒pet24a
‑
gst
‑
mxe gyra
‑
linker
‑
afp采用热激法转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，挑取单菌落在含有50μg/ml卡那霉素的5ml lb培养基中37℃培养12h，然后按2％(v/v)的比例转接到含50μg/ml卡那霉素的tb培养基中，在37℃继续培养至od
600
为0.6～0.8时，加入iptg至终浓度0.5mm。在16℃下诱导20h后，收集菌体细胞并重悬于ph 8.5的50mm tris
‑
hcl缓冲液中进行超声破碎后进行离心，收集上清液进
行sds
‑
page电泳。
[0061]
实施例3利用抗冻蛋白
‑
内含肽标签对gst的分离纯化
[0062]
制备冰壳：量取100ml预冷的去离子水倒入500ml圆底烧瓶中，将圆底烧瓶浸没在冷冻液中并快速旋转1min使圆底烧瓶中的部分去离子水形成紧贴圆底烧瓶内部壁面的冰壳，将剩余的去离子水倒出，继续将带有冰壳的圆底烧瓶浸没在冰吸附冷冻液中旋转2min，直到冰壳出现分布均匀的裂缝后可以进行后续实验。
[0063]
将细胞破碎上清液稀释为1mg/ml，经冰水混合物预冷后缓慢滴加于圆底烧瓶中的冰壳表面，如图2所示，将圆底烧瓶连接在旋转蒸发仪上并使圆底烧瓶浸于
‑
1.0～
‑
1.5℃的冰吸附制冷液中，利用旋转蒸发仪缓慢旋转圆底烧瓶，待吸附反应进行30min后将未被吸附的细胞破碎上清液样品倒出。向冰壳表面倒入预冷的细胞破碎缓冲液(称取3.029g tris，溶于400ml去离子水，4mol/l hcl调节ph至8.5，定容至500ml)迅速转动进行清洗后倒出。将清洗后的冰壳融化得到富集有融合蛋白gst
‑
mxe gyra
‑
linker
‑
afp的溶液。
[0064]
将冰壳融化后的蛋白溶液用量筒测定体积，与5
×
断裂反应缓冲液以4:1(v/v)混合，在25℃下孵育6h进行断裂反应，之后进行透析去除dtt和edta。
[0065]
将经过断裂反应和透析后的蛋白溶液滴加于新制备的冰壳表面，再次以冰为吸附介质吸附去除蛋白溶液中的抗冻蛋白
‑
内含肽纯化标签，最终得到含有目的蛋白gst的上清液，利用sds
‑
page进行检测，结果如图3所示，分离纯化到了高纯度gst蛋白。
[0066]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是根据本发明申请的权利要求书和说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆为本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
[0067]
实施例4 gfp
‑
mxe gyra
‑
linker
‑
afp的异源表达
[0068]
将苏州泓迅生物科技股份有限公司合成的质粒pet
‑
24a
‑
gfp
‑
mxe gyra
‑
linker
‑
afp采用热激法转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，挑取单菌落在含有50μg/ml卡那霉素的5ml lb培养基中37℃培养12h，然后按2％的比例转接到含50μg/ml卡那霉素的tb培养基中，在37℃继续培养至od
600
为0.6～0.8时，加入iptg至终浓度0.5mm。在16℃下诱导20h后，收集菌体细胞并重悬于ph 8.5的50mm tris
‑
hcl缓冲液中进行超声破碎后进行离心，收集上清液进行sds
‑
page电泳。
[0069]
实施例5利用抗冻蛋白
‑
内含肽标签对gfp的分离纯化
[0070]
制备冰壳：量取100ml预冷的去离子水倒入500ml圆底烧瓶中，将圆底烧瓶浸没在冷冻液中并快速旋转1min使圆底烧瓶中的部分去离子水形成紧贴圆底烧瓶内部壁面的冰壳，将剩余的去离子水倒出，继续将带有冰壳的圆底烧瓶浸没在冷冻液中旋转2min，直到冰壳出现分布均匀的裂缝后可以进行后续实验。
[0071]
将细胞破碎上清液稀释为1mg/ml，经冰水混合物预冷后缓慢滴加于圆底烧瓶中的冰壳表面，如图2所示，将圆底烧瓶连接在旋转蒸发仪上并使圆底烧瓶浸于
‑
1.0～
‑
1.5℃的制冷液中，利用旋转蒸发仪缓慢旋转圆底烧瓶，待吸附反应进行30min后将未被吸附的细胞破碎上清液样品倒出。向冰壳表面倒入预冷的细胞破碎缓冲液迅速转动进行清洗后倒出。将清洗后的冰壳融化得到富集有融合蛋白gfp
‑
mxe gyra
‑
linker
‑
afp的溶液。
[0072]
将冰壳融化后的蛋白溶液用量筒测定体积，与5
×
断裂反应缓冲液以4:1(v/v)混
合，在25℃下孵育6h进行断裂反应，之后进行透析去除dtt和edta。
[0073]
将经过断裂反应和透析后的蛋白溶液滴加于新制备的冰壳表面，再次以冰为吸附介质吸附去除蛋白溶液中的抗冻蛋白
‑
内含肽纯化标签，最终得到含有目的蛋白gfp的上清液，利用sds
‑
page进行检测，结果如图3所示，分离纯化到了高纯度gfp蛋白。
[0074]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是根据本发明申请的权利要求书和说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆为本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。