一种平足蛋白拮抗多肽及其衍生物和应用

1.本发明涉及生物技术和生物医药领域，具体涉及一种平足蛋白拮抗多肽及其衍生物和应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤(tumor)的发病率在全世界疾病发展中处于优先地位，严重威胁人类的健康。黑色素瘤，是一种恶性程度极高的癌型，发病率和死亡率在全球范围内差别很大。2012年黑色素瘤的调查数据显示，黑色素瘤发病率从东南亚的0.2/10万人年到美洲的7.7/10万人年不等。
3.黑色素瘤是一种源于黑色素细胞的癌症，黑色素细胞是皮肤中正常产生色素的细胞类型，黑色素细胞起源于发育过程中的神经嵴。黑色素细胞从神经嵴前体分化、存活和迁移在很大程度上依赖于经典的wnt信号通路(通过β
‑
catenin)、c
‑
kit受体酪氨酸激酶和下游转录因子，如mitf。黑色素细胞恶性转化为黑色素瘤是一个需要外源性和内源性触发因素以及肿瘤内在因素和免疫相关因素相互作用的结果。黑色素瘤发生的先决条件是在内外因素(种族与遗传、基因突变、外在创伤刺激、紫外线等)的影响下，黑色素细胞出现过度增殖和异常分化后，发展成为恶性黑色素瘤。大多数癌症通过调节这一过程的信号通路并持续激活来获得这种恶性增殖的能力。
4.对于黑色素瘤的患者，其黑色素细胞中braf基因的突变频率比正常人高出700倍。在大约50％的黑色素瘤病例中检测到braf突变，这是黑色素瘤中最常见的遗传变化。这种突变的高频率和黑素瘤细胞对braf“成瘾”使其成为极好的治疗靶标。到目前为止，两种针对braf的药物维莫非尼(vemurafenib)和达帕菲尼(dabrafenib)已被美国食品药品管理局(fda)接受，并且是患有braf突变的晚期黑色素瘤患者的标准治疗方案。但接受靶向治疗的患者的平均总生存期(os)为14个月，而黑色素瘤的一线化疗药物达卡巴嗪则为9个月。治疗结束后肿瘤的快速复发归因于黑色素瘤对braf抑制剂的内在或获得性耐药。为了克服靶向药物的耐药性，2013年批准了另一种mapk途径抑制剂曲美替尼(mek抑制剂)。与braf抑制剂单药治疗相比，braf和mek抑制剂(达布拉非尼和曲美替尼或维拉非尼和考比替尼)的联合用药显示出更久的存活周期。
5.除了基因突变，免疫逃逸也是恶性细胞不断发展的另一种标志，是癌细胞逃避宿主免疫反应的一种策略。由于特异性趋化因子产生失败而导致淋巴细胞t募集受损，以及由于t细胞无反应性导致的这些细胞活化受到抑制，被调节性t细胞抑制或负调节受体的连接。后一种机制涉及在t细胞上表达细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla
‑
4)和程序性细胞死亡1(pd
‑
1)蛋白，和程序性死亡配体
‑
1，
‑
2(pd
‑
l1，
‑
2)在黑色素瘤细胞上。fda已经批准了两种针对t细胞上pd
‑
1分子的药物用于晚期黑素瘤治疗：尼古鲁单抗和派姆单抗。由于它们在临床试验中的表现优于伊匹木单抗，因此它们已成为黑色素瘤免疫治疗的首选药物。两者的总反应率(orr)和功效均相似。接受尼古鲁单抗治疗的患者中几乎有60％可以存活2年。fda批准用于黑色素瘤治疗的另一种免疫疗法是talimogene laherparepvec(t
‑
vec)。
它是一种工程改造的溶瘤性单纯疱疹1型病毒，其中的神经毒性因子被粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)。t
‑
vec直接注射到黑色素瘤肿瘤(区域或皮肤转移)中，从而诱导黑色素瘤细胞死亡，并通过局部产生gm
‑
csf产生，gm
‑
csf将抗原呈递细胞募集到肿瘤微环境中，增强树突状细胞功能，并促进细胞毒性t细胞应答肿瘤相关抗原。在临床试验中，t
‑
vec的客观反应率为25％，16％的患者反应持久。
6.podoplanin(pdpn)又称为平足蛋白，是一种跨膜糖蛋白，主要表达于淋巴管内皮细胞，被作为淋巴管内皮和淋巴管生成标志物广泛使用。pdpn的结构是由三部分组成，胞外区是由162个氨基酸组成，含有大量的丝氨酸、苏氨酸残基，其中plag结构域，位于氨基酸序列的29
‑
54个氨基酸之间，这种序列在物种之间高度保守，plag区由三个重复序列组成，其中主要起作用的是plag3。pdpn，其主要配体表达在血小板的表面，肿瘤细胞表达的pdpn可与血小板表明的c型凝集素受体(clec
‑
2)结合，诱导血小板活化凝集，凝集的血小板可包裹在肿瘤细胞周围，在肿瘤细胞与免疫细胞之间形成一道屏障，让肿瘤细胞免受免疫细胞的攻击。另外，血小板与肿瘤细胞结合后，激活的血小板也可能会分泌许多细胞因子，来影响肿瘤微环境当中肿瘤细胞和免疫细胞的活性。近年来研究发现，pdpn蛋白也表达于一些恶性肿瘤组织，包括黑色素瘤、肺鳞癌、乳腺癌、脑胶质瘤等，pdpn在多种肿瘤细胞表面表达上调，并且与肿瘤的发生发展及侵袭转移有密切关系，pdpn蛋白在不同恶性肿瘤中的表达差异对于恶性肿瘤的诊断、治疗及预后有着良好的临床指导意义。目前，以pdpn蛋白为结合位点，用于预防和/或治疗恶性肿瘤的生物类多肽药物报道甚少。
7.1985年由smith等人提出噬菌体展示技术(phage display techniques,pdt)；1988年，噬菌体展示肽库首次构建成功；从1990年至今，噬菌体展示肽库得到快速发展和应用。噬菌体展示技术的原理是将外源dna通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上，使外源dna片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性；然后利用靶分子，采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体dna序列测序出来。该技术的显著特点是建立了基因型和表现型之间的对应关系。噬菌体展示技术适合用于全人源抗体药物的制备。治疗类风湿关节炎的抗肿瘤坏死因子α的humira是第一个应用噬菌体抗体库技术生产的并被美国食品药品管理局批准的全人源抗体药物。到2014为止，被美国食品药品管理局批准的应用噬菌体抗体库技术生产的抗体有6个，且同时有30种以上的相关药物处于临床试验阶段。除筛选制备型抗体外，噬菌体抗体库技术也能被用于筛选相应抗原。噬菌体展示技术抗体库因具有高库容、高效方便以及灵活筛选等优势，在生命科学的许多领域得到广泛应用，尤其在肿瘤诊断和肿瘤抗体药物制备等领域，可以作为筛选肿瘤表面抗原的靶向抗体工具。


技术实现要素：

8.为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种由噬菌体展示库筛选得到的pdpn拮抗多肽，该拮抗多肽与受体pdpn具有特异性高亲和力，能够通过与pdpn的结合来阻断pdpn的信号通路，在靶向抑制黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭，促进黑色素瘤细胞凋亡等方面起着重要的作用，在黑色素瘤靶向治疗方面具有巨大的应用价值。
9.本发明的另一目的在于提供上述pdpn拮抗多肽的衍生物，该衍生物与受体pdpn具有特异性高亲和力，且特异性与pdpn结合。
10.本发明的再一目的在于提供上述pdpn拮抗多肽及其衍生物的应用。
11.为了实现上述任务，具体技术方案如下：
12.本发明提供一种平足蛋白拮抗多肽，其氨基酸残基序列为his
‑
met
‑
asp
‑
asn
‑
asn
‑
ala
‑
phe
‑
ser
‑
pro
‑
leu
‑
gly
‑
arg，如seq id no:1所示。
13.本发明提供一种平足蛋白拮抗多肽衍生物，为所述的平足蛋白拮抗多肽氨基酸的侧链基团、氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物；或为所述的平足蛋白拮抗多肽连接标签得到的产物；
14.所述常规修饰为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇修饰和固定化修饰中的一种以上；优选地，所述平足蛋白拮抗多肽末端进行酰胺化修饰。
15.所述标签用于多肽或蛋白检测或纯化，优选为his6标签、gst标签、egfp标签、mbp标签、nus标签、ha标签、igg标签、flag标签、c
‑
myc标签和profinityexact标签中的一种以上。
16.亲水性分析表明，所述平足蛋白拮抗多肽为亲水性多肽。
17.所述的平足蛋白拮抗多肽及其衍生物可以来源于哺乳类动物或者鸟类，例如灵长类动物(人类)；啮齿类动物，包括小鼠、大鼠、仓鼠、兔、马、牛、犬类、猫等。
18.所述的平足蛋白拮抗多肽及其衍生物的获得，采用现有技术中的公知方法进行，用多肽自动合成仪进行化学合成；或者通过将短肽序列推导出核苷酸序列，然后克隆到载体中进行生物合成；或者从现有存在的生物体内进行大量提取和纯化。
19.本发明还提供编码所述的平足蛋白拮抗多肽或所述的平足蛋白拮抗多肽衍生物的多聚核苷酸。
20.本发明还提供含有所述多聚核苷酸的载体。
21.本发明还提供含有所述载体的宿主细胞或宿主菌。
22.本发明另一方面提供一种药物组合物，包含所述平足蛋白拮抗多肽和/或所述平足蛋白拮抗多肽衍生物；
23.优选地，所述药物组合物还包括治疗剂；所述治疗剂为任意的具有抗肿瘤活性的物质；
24.优选地，所述药物组合物含有一种以上药学上可接受的载体；优选地，所述药学上可接受的载体优选为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等。
25.所述的药物组合物可以进一步制成片剂、粒剂、胶囊、口服液或注射剂等多种形式，各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备。
26.本发明另一方面提供所述平足蛋白拮抗多肽和/或所述平足蛋白拮抗多肽衍生物在制备抑制高表达平足蛋白的肿瘤细胞增殖或促进高表达平足蛋白的肿瘤细胞凋亡的药物中的应用；
27.优选地，所述高表达平足蛋白的肿瘤细胞为黑色素瘤细胞。
28.本发明另一方面还提供所述平足蛋白拮抗多肽和/或所述平足蛋白拮抗多肽衍生
物在制备治疗高表达平足蛋白的肿瘤疾病的药物中的应用；
29.优选地，所述高表达平足蛋白的肿瘤疾病为黑色素瘤、脑胶质瘤、肺鳞癌、皮肤癌、乳腺癌或口腔鳞状细胞癌；更优选地，所述肿瘤疾病为黑色素瘤。
30.本发明还提供一种检测试剂，包含所述平足蛋白拮抗多肽或所述平足蛋白拮抗多肽衍生物。
31.发明还提供一种所述平足蛋白拮抗多肽或所述平足蛋白拮抗多肽衍生物的抗体。
32.本发明的有益效果：
33.(1)本发明提供的pdpn拮抗多肽及其衍生物能够专一性地与pdpn结合，抑制pdpn介导的信号通路，从而抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，促进肿瘤细胞发生凋亡。
34.(2)本发明筛选得到的pdpn拮抗多肽及其衍生物可以通过阻断pdpn的信号通路，可以作为pdpn结合位点的生物类多肽药物，用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物，能够在医学与生物学领域得到广泛的应用，并产生巨大的社会与经济效益。
附图说明
35.图1为实施例1中pdpn拮抗多肽的高效液相(hplc)检测图；
36.图2为实施例1中pdpn拮抗多肽的质谱(ms)检测图；
37.图3为实验例1中黑色素瘤细胞a375和a875中的pdpn mrna和蛋白表达水平的检测结果，其中，a为rt
‑
pcr检测的mrna水平，b为westernblotting蛋白印迹，c为蛋白表达量统计结果；
38.图4为实验例2中pdpn拮抗多肽对于黑色素瘤细胞a375和a875增殖能力的影响的检测结果；
39.图5为实验例3中pdpn拮抗多肽抑制黑色素瘤细胞a375的迁移能力的检测结果；
40.图6为实验例4中pdpn拮抗多肽抑制黑色素瘤细胞a375的侵袭能力的检测结果；
41.图7为实验例5中pdpn拮抗多肽抑制黑色素瘤细胞a375的裸鼠成瘤能力的检测结果。
具体实施方式
42.为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
43.实施例1：进行pdpn拮抗多肽cy12
‑
rp1的淘选、扩增、纯化、测序及合成。
44.本实施例主要是为了筛选获得与pdpn特异性结合的阳性噬菌体，再通过将阳性噬菌体扩增、纯化，提取噬菌体单链dna(ssdna)进行测序，将所获得的序列分析对比，最后合成高纯度的拮抗多肽cy12
‑
rp1。
45.具体如下：
46.1.建立永久高表达pdpn的293t细胞系：293t
‑
pdpn
+/+
:
47.①
选取生长旺盛的可发光的人293t细胞，在转染前一天以5
×
105个/孔，接种于6孔板中，培养至第二日后，细胞融合度为60％；
48.②
第二日进行转染，以6孔板的一个培养孔为单位，用200μl的opti
‑
mem培养基稀释3μg质粒，另以200μl的opti
‑
mem培养基稀释6μl脂质体lipofectamine2000，分别轻轻混匀后，室温放置5分钟；
49.③
将两管稀释液轻轻混合，室温静置20分钟后，向混合后的稀释液中轻轻加入600μl的opti
‑
mem培养基；
50.④
将待转染的细胞用pbs轻轻漂洗一次，然后将混合好的稀释液轻轻加入培养孔中，置于二氧化碳培养箱中培养；
51.⑤
培养4～6小时后弃尽转染所用培养基，向孔中加入3ml完全培养基；
52.⑥
48小时后选用含有1μg/ml嘌呤霉素(puromycin)的培养基进行筛选；待细胞不再出现死亡后即得到稳定表达pdpn的293t细胞系。
53.⑦
用trizol提取总rna，定量2μg rna进行逆转录(逆转录试剂盒，购于promega公司)，并用特异引物序列进行rt
‑
pcr。
54.所用特异引物序列为hu
‑
pdpn引物序列：
55.forward:5
′‑
tgactccaggaaccagcgaag
‑3′
，如seq id no:2所示；
56.reverse:5
′‑
gcgaatgcctgttacactgttga
‑3′
，如seq id no:3所示。
57.⑧
与转染了psm2c
‑
hu
‑
scramble rna的做比较，检测pdpn的高表达水平，并命名为：293t
‑
pdpn
+/+
，即可以用于阳性噬菌体筛选。
58.2.进行pdpn拮抗多肽的淘选、扩增、纯化、测序及合成
59.①
er2738宿主菌液的制备：无菌技术操作，先取200μl lb
‑
tet液体培养基于1.5ml灭菌离心管中，再从e.coli er2738的甘油冻存物中取0.2μl菌液与之充分混匀，全部吸取涂布于lb
‑
tet平板上，标记平板，室温放置3min，然后置于37℃恒温培养箱倒置过夜培养。次日观察，长出克隆后用封口膜封口，4℃避光保存备用。用灭菌枪头以无菌技术挑取单菌落，放入已预先加有3ml lb
‑
tet液体培养基的10ml灭菌离心管中，标记后于恒温摇床37℃，300rpm/min振荡培养过夜。次日，细菌扩增液于4℃储存备用。取10ml灭菌离心管，无菌操作加入3ml lb
‑
tet液体培养基，取30μl过夜培养的细菌接种其中，恒温摇床37℃，300rpm/min振荡培养2～3h，细菌处于指数生长期，肉眼观察呈雾状(od
600
～0.5)。
60.②
pdpn拮抗肽的淘选：将高表达pdpn细胞按105个/培养皿接种于预先包被多聚赖氨酸的60
×
15mm2培养皿中，常规培养至细胞密度80％～90％时，用于淘洗(同时用不表达pdpn的细胞系作为空白对照)每轮洗脱液先取1μl测滴度，剩下的将其加入到20ml lb培养液中扩增，再纯化、最后再测扩增后的滴度，扩增物于4℃短期保存，并取相等数量级用于下一轮淘选，剩下的扩增物用50％的甘油于
‑
20℃保存。
61.③
测定噬菌体的滴度:取4支灭菌的10ml离心管，每个噬菌体稀释度准备1个灭菌离心管，微波炉熔化顶层琼脂(agarose top)，每管加入3ml顶层琼脂，45℃水浴备用。每个噬菌体稀释度准备1块lb/iptg/xgal平板，37℃恒温培养箱预热备用。将od
600
～0.5的e.coli er2738大肠杆菌按照噬菌体稀释度200μl/管分装，4℃保存备用。取4支灭菌的1.5ml离心管，分别盛有100μl、90μl、90μl、90μl lb
‑
tet培养基，将待测噬菌体吸取1μl入100μl lb
‑
tet培养基中，按10倍梯度稀释，分别标记为10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4，每个稀释度轻轻振荡混匀，瞬间离心。取10μl待滴定的各稀释度的噬菌体与200μl e.coli er2738混合，轻轻振荡混匀，瞬间离心，室温孵育5min。将混合菌液迅速加入顶层琼脂中，快速振荡混匀，立
即倒入预热的lb/iptg/xgal平板，将其均匀展平，室温冷却5min，37℃恒温培养箱中，倒置平板培养过夜。
62.④
洗脱噬菌体的扩增及纯化：取250ml的锥形瓶，按1:100比例，将过夜培养的er2738宿主菌液加入至20ml lb液体培养基中，37℃，250rpm剧烈振荡培养2h；然后将待扩增的噬菌体液加入到锥形瓶中，37℃，250rpm剧烈振荡培养4.5h；将培养物转入50ml离心管中，4℃10,000rpm离心10min。上清液转入另一干净离心管中，4℃10,000rpm再次离心10min；取上清的80％转入另一干净离心管中，加入1/4体积的peg/nacl，颠倒混匀后于4℃沉淀过夜；第二天，将沉淀于4℃,12,000rpm离心20min。用干净枪头小心吸取上清液，再4℃12,000rpm离心1min，去掉残留上清液；然后用1ml tbs重悬沉淀物，轻轻吹打100次。然后将悬液转入2ml离心管中，4℃10,000rpm离心5min除去残余细胞；将上清加入1/4体积的peg/nacl后，于冰上孵育60min再次沉淀；取出离心管，4℃12,000rpm离心20min，去掉上清；用200μl tbs重悬沉淀，4℃10,000rpm离心1min。上清转入另一离心管中。4℃短期保存，也可以用50％的甘油于
‑
20℃长期保存。单克隆噬菌体的扩增，包括
⑴
按1:100比例，将过夜培养的er2738宿主菌液加入至2ml lb液体培养基中，37℃，250rpm剧烈振荡培养2h；用灭菌牙签，从第四轮滴度平板中选取少于100个噬菌斑的平板，挑取分隔良好的蓝色噬菌斑，加入到培养管中，37℃250r/min剧烈震荡培养4.5h；然后将培养物转入到新鲜离心管中，4℃10,000rpm离心30sec。上清转入以新鲜管中，再同样离心一次；将上清的80％转入新鲜离心管中，4℃贮存，也可以用50％的甘油于
‑
20℃长期保存。
63.⑤
琼脂糖凝胶电泳鉴定m13噬菌体ssdna：将凝胶成形模具水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与模具之间留1mm空间；称取dna电泳用琼脂糖1g放入250ml的三角烧瓶中，加入100ml 1
×
tae缓冲液，混匀后，将烧瓶置于微波炉中，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解；关闭电磁炉，取出三角烧瓶，将其置室温下冷却至室温(手握烧瓶可以耐受)，再加入溴化乙锭5μl，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液100ml；室温下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中；在电泳槽加入1
×
tae缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜；将样品用loading buffer稀释以后加入胶板中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外；接通电源，调节电压至50伏，电泳90min后，将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果。
64.⑥
ssdna测序及序列分析：将提取的m13噬菌体ssdna送到上海英潍捷基生物技术有限公司进行dna测序。测序以后用bioedit软件进行序列分析。通过分析结果可知，样品序列为his
‑
met
‑
asp
‑
asn
‑
asn
‑
ala
‑
phe
‑
ser
‑
pro
‑
leu
‑
gly
‑
arg(简写为：hmdnnafsplgr)，以cy12
‑
rp1表示，最后短肽由强耀生物科技有限公司合成。
65.3.pdpn拮抗多肽的合成和鉴定
66.采用cs936多肽合成仪(美国csbio公司)，fmoc固相合成法合成(由上海强耀生物公司合成)，合成过程包括下述步骤：
67.(1)去保护：用哌啶(piperidine，上海紫一试剂厂)溶液去除氨基的保护基团；
68.(2)激活与交联：下一个氨基酸的羧基被激活剂hbtu(hctu/hitu)+nmm所激活溶解，激活的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键；
69.(3)循环：(1)、(2)两步反应反复循环直到整条肽链合成完毕；
70.(4)洗脱和脱保护：根据肽链所含的残基不同，用不同的脱树脂溶剂从柱上洗脱下
来，其保护基团被一种脱保护剂(tfa)洗脱和脱保护；
71.(5)合成好的短肽经过varian prostar210纯化柱(美国varian公司)纯化，纯化的过程中采用uv
‑
vis
‑
detector:varian prostar345(美国varian公司)检测；
72.(6)采用system gold hplc(美国贝克曼公司)验证纯度达到99％以上；
73.(7)采用thermo finnigan lcq deca xp plus(美国thermo公司)检测合成短肽的分子量。
74.图1为pdpn拮抗多肽的高效液相(hplc)检测图，hplc色谱条件如下：
[0075][0076]
hplc结果表明，合成的pdpn拮抗多肽的纯度高达98.63％。
[0077]
图2为pdpn拮抗多肽的质谱(ms)检测图，ms质谱条件如下：
[0078]
ion source：esi nebulizer gas(neb)：12.00
[0079]
curtain gas(cur)：6.00 lonspray voltage(is)：
±
4500
[0080]
temperature(tem)：0.00 run time：0.5
‑
1min
[0081]
ms结果表明，合成的pdpn拮抗多肽的大小为1358.51da，分子量大小与预测值一致。
[0082]
实验例1：黑色素瘤细胞中pdpn mrna和蛋白的表达水平
[0083]
①
选取两株黑色素瘤细胞株a375和a875细胞，用trizol提取总rna，定量2μg rna进行逆转录(逆转录试剂盒，购于promega公司)，并用特异引物序列进行rt
‑
pcr。
[0084]
所用pdpn特异引物序列为：
[0085]
forward：5
′‑
tgactccaggaaccagcgaag
‑3′
，如seq id no：2所示；
[0086]
reverse：5
′‑
gcgaatgcctgttacactgttga
‑3′
，如seq id no：3所示。
[0087]
②
收取黑色素瘤细胞a375和a875细胞，加入预冷的pbs洗涤三次，再加入细胞裂解液(ripa∶pmsf＝100∶1)，4℃孵育40min，然后收集蛋白置于4℃冷冻离心机离心5min(12000g/min)，加入5
×
buffer，制成蛋白样品。再将蛋白样品进行电泳，转膜，得到含有蛋白的pvdf膜，用含质量分数为5％的脱脂奶粉的tbst室温封闭1h，然后用含质量分数为5％bsa的tbst稀释pdpn抗体(biolegend，916605)和β
‑
actin抗体(abclonal，ac026)，加入上述一抗后，4℃孵育过夜。次日，加入羊抗鼠的二抗(1:2000)后，用ecl试剂盒显色，用quantity
‑
one软件分析实验结果。
[0088]
结果如图3所示，其中，a为rt
‑
pcr检测的mrna水平，b为western blotting蛋白印迹，c为蛋白表达量统计结果，可以看出pdpn在黑色素瘤细胞a375和a875中mrna和蛋白水平均高表达。
[0089]
实验例2：cy12
‑
rp1可以显著抑制黑色素瘤细胞a375的增殖
[0090]
①
将黑色素瘤细胞a375以5
ⅹ
103个/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔培养基体积为200μl，培养24h，然后饥饿过夜；
[0091]
②
加入不同浓度梯度(100μm，50μm，25μm，10μm，5μm，1μm)的cy12
‑
rp1多肽培养48h；
[0092]
③
每孔加入10μl的cck8工作溶液，继续放入二氧化碳培养箱中培养1
‑
2h；
[0093]
④
取出96孔板，摇床上轻微震荡2
‑
3min，在酶标仪上选择450nm波长进行检测，绘制细胞的生长曲线。
[0094]
图4为pdpn拮抗多肽对于黑色素瘤细胞a375和a875增殖能力的影响的检测结果，结果显示，不同浓度的cy12
‑
rp1短肽可以显著抑制黑色素瘤细胞a375和a875细胞增殖。
[0095]
实验例3：cy12
‑
rp1可以显著抑制黑色素瘤细胞a375的迁移
[0096]
①
将黑色素瘤细胞系a375接种到transwell上室中按照5
ⅹ
104个细胞/每孔，加入不同浓度梯度(0μm、5μm、10μm)的cy12
‑
rp1多肽培养48h；
[0097]
②
下室加入800ul含有10％fbs的培养基；
[0098]
③
用pbs洗3次，4％多聚甲醛固定30min；
[0099]
④
用pbs洗3次，0.5％的结晶紫染色1h；
[0100]
⑤
用棉签小心刮掉上层细胞，显微镜下拍照；
[0101]
图5为pdpn拮抗多肽抑制黑色素瘤细胞a375的迁移能力的检测结果，通过transwell实验发现，随着作用浓度的升高，cy12
‑
rp1可以明显抑制黑色素瘤细胞a375的迁移能力。
[0102]
实验例4：cy12
‑
rp1可以显著抑制黑色素瘤细胞系a375的侵袭能力
[0103]
①
transwell上室中按照1：8的比例预先铺好matrigel，第二天在transwell上室中接种5
ⅹ
104个黑色素瘤细胞a375，将不同浓度a375(0μm、5μm、10μm)cy12
‑
rp1多肽加入到含2％fbs的培养基中培养48h；
[0104]
②
下室加入800ul含有10％fbs的培养基；
[0105]
③
用pbs洗3次，4％多聚甲醛固定30min；
[0106]
④
用pbs洗3次，0.1％的结晶紫染色1h；
[0107]
⑤
用棉签小心刮掉上层细胞，显微镜下拍照。
[0108]
图6为pdpn拮抗多肽抑制黑色素瘤细胞a375的侵袭能力的检测结果，通过transwell实验发现，随着作用浓度的升高，cy12
‑
rp1可以明显抑制黑色素瘤细胞系a375的侵袭能力。
[0109]
实验例5：cy12
‑
rp1可以显著抑制a375的成瘤能力
[0110]
①
将3
ⅹ
106个a375黑色素瘤细胞接种到6周、18g左右的裸鼠皮下，每组5只；
[0111]
②
第三天对荷瘤小鼠做尾静脉给药处理，分别是buffer组、cy12
‑
rp1(50mg/kg)组、cy12
‑
rp1(100mg/kg)组，给药频率为2天/1次；
[0112]
③
2天/1次对荷瘤小鼠的体重和肿瘤大小进行测量。
[0113]
图7为pdpn拮抗多肽抑制黑色素瘤细胞a375的裸鼠成瘤能力的检测结果，通过裸鼠成瘤实验可以看出，cy12
‑
rp1能显著抑制a375的成瘤能力，并且随着浓度的升高，cy12
‑
rp1的抑瘤能力更强。
[0114]
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