一种山羊KCNJ15基因CNV标记辅助检测生长性状的方法及其专用试剂盒与流程

一种山羊kcnj15基因cnv标记辅助检测生长性状的方法及其专用试剂盒
技术领域
1.本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种基于qpcr技术检测山羊kcnj15基因cnv标记的方法。


背景技术：

2.dna分子标记(dna molecular marker)，是反映每个个体和种群间基因组特异性的dna片段。dna分子标记包括限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，rflp)标记、随机扩增基因组dna多态性(random amplified polymorphic dna，rapd标记、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，aflp)标记、微卫星dna(microsatellite，ms)和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，snp)标记等。
3.相比之下，拷贝数变异(cnv)是指长度为1kb至数mb的dna片段拷贝数的突变，包括dna单一片段的扩增、缺失、插入、倒置等变异形式，也包括复杂的染色体扩增、缺失和插入的各种组合。cnvs具有片段长度大、普遍存在，且覆盖的基因组范围广等优点，已逐渐被更多的用作研究和分子育种标记。日趋成熟的人类基因组cnvs检测技术对研究山羊cnvs具有借鉴作用。山羊基因组测序图谱的逐渐完善对cnvs的发展至关重要，随着cnvs图谱的建立和逐步完善，对山羊经济性状、功能性状的研究具有重要意义。
4.kcnj15基因表达产物是钾内向整流通道亚家族重要成员，其与atp调控密切相关，而生长发育的相关过程需要充足的能量。但目前，尚未见有关kcnj15基因cnv与山羊生长性状的关联性研究的文献报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种山羊kcnj15基因cnv标记辅助检测生长性状的方法及其专用试剂盒，从而加快山羊良种选育进程。
6.为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
7.一种检测山羊kcnj15基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：以山羊(例如，河南波槐山羊、槐山羊、贵州黑山羊、贵州白山羊、太行山羊个体)基因组dna为模板，以引物对p1以及引物对p2为引物，分别通过实时荧光定量pcr扩增kcnj15基因的拷贝数变异区域以及作为内参的mc1r基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定个体kcnj15基因的拷贝数变异类型；
8.所述引物对p1为：
9.上游引物f1：5
’‑
ccgctttcttgtgaacttccat
‑3’
10.下游引物r1：5
’‑
ctgtcacgtgtccagaaagtaga
‑3’
11.所述引物对p2为：
12.上游引物f2：5
’‑
gggcagtcccttgacaaaga
‑3’
13.下游引物r2：5
’‑
atctccccagcctcctcatt
‑3’
。
14.优选的，所述kcnj15基因的拷贝数变异区域位于山羊kcnj15基因参考基因组序列nc_030808.1的150479082位到150489041位。
15.优选的，所述拷贝数变异类型是根据2*2
‑
δδct
将定量结果分为的三类：多拷贝型，2*2
‑
δδct
>2；缺失型，2*2
‑
δδct
<2；正常型，2*2
‑
δδct
＝2。
16.优选的，所述实时荧光定量pcr所用的扩增体系包括10ng/μl模板dna 1μl以及10μmol/l的引物对p1或引物对p2所对应的上、下游引物各0.5μl。
17.优选的，所述实时荧光定量pcr所用的反应程序为：94～95℃预变性2min；94～95℃变性10s，60℃退火20～30s，共39～40个循环。
18.优选的，基于引物对p1扩增的pcr产物片段大小为80bp，基于引物对p2扩增的pcr产物片段大小为129bp。
19.上述检测山羊kcnj15基因拷贝数变异的方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。
20.优选的，不同品种的山羊(例如，槐山羊、贵州黑山羊、贵州白山羊、太行山羊)群体中，具有多拷贝型或正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状上较优。
21.优选的，所述生长性状选自体高、体斜长、胸围、管围、体重中的一种或多种。
22.一种检测山羊kcnj15基因拷贝数变异的试剂盒，该试剂盒包括上述引物对p1及引物对p2。
23.本发明的有益效果体现在：
24.本发明公开的检测山羊kcnj15基因拷贝数变异的方法，通过实时荧光定量pcr技术检测kcnj15基因cnv位点在山羊群体中的拷贝数变异情况。与高通量测序方法、基因芯片等方法相比，本发明的检测方法快速、简单、成本低，能够准确的鉴定个体的拷贝数变异类型，从而依据所发现的定位于kcnj15基因的dna分子标记(cnv标记)辅助检测具有生长性状优势的个体，快速建立山羊遗传资源优势种群，加快山羊优良性能的选育进程。
25.进一步的，本发明通过将检测的kcnj15基因cnv位点的拷贝数变异情况与山羊体高、体斜长、胸围、管围、体重等重要生长性状进行关联分析，结果表明在该位点具有多拷贝型或正常型拷贝数变异类型的个体具有明显的生长性状优势，为山羊分子育种提供分子标记和实践依据。
附图说明
26.图1为实施例中进行qpcr绘制的扩增曲线(kcnj15基因)。
27.图2为实施例中进行qpcr绘制的溶解曲线(kcnj15基因)。
28.图3为实施例中kcnj15基因拷贝数在山羊群体中的分布。
具体实施方式
29.下面结合附图和实施例对发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。
30.基于前期的山羊基因组重测序研究的发现，即位于山羊kcnj15基因参考基因组序列nc_030808.1的150479082位到150489041位的区域存在拷贝数变异，考虑到kcnj15基因
在生长发育中的潜在功能以及cnv的调节机制，对kcnj15基因在该区域的拷贝数变异与生长性状的关联性进行了实验分析，实验结果为山羊分子育种、选育优良性状提供重要的实践依据。具体说明如下。
31.1.样品的采集及基因组dna提取
32.(1)样品采集和数据收集
33.本发明中使用的样品主要为血样和组织样(表1)。血液的采集方法为颈静脉采血，组织样是利用剪耳豁剪下的耳组织样品，均用冰盒带回实验室，于
‑
80℃储存；同时进行基础数据收集和测定：采样时对相应个体进行基础数据测定、采集和录入，以用于后期的关联分析。
34.表1.样品采集信息
[0035][0036]
(2)样品基因组dna的提取(利用酚
‑
氯仿法对样品进行基因组dna提取)
[0037]
①
血样(主要为血细胞)：室温解冻，吸取2ml血液于2.0ml离心管中，4℃、12000rpm离心10min；弃掉液体，保留沉淀，加入1.5ml的pbs缓冲液，涡旋震荡使沉淀悬浮，冰上温和摇动15min；4℃、12000rpm离心10min，弃掉液体，保留沉淀；
[0038]
耳组织：剪碎后加入600μl se缓冲液。
[0039]
②
将沉淀捣碎，呈絮状，在离心管中加入dna抽提缓冲液500μl和蛋白酶k 6μl，在恒温水浴箱中37℃温育过夜(16h左右)，至沉淀物被完全消化，溶液澄清。
[0040]
③
加入1ml tris饱和酚，放置冰上温和摇动20min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌2.0ml离心管。
[0041]
④
加入0.5ml的饱和酚和0.5ml的氯仿，放置冰上温和摇动20min；，将上层水相转入另一灭菌的2.0ml离心管。
[0042]
⑤
加入1ml的氯仿，放置冰上温和摇动20min；4℃、12000rpm离心10min；将上层水相用移液器移到1.5ml离心管中。
[0043]
⑥
加入1ml预冷无水乙醇(
‑
20℃)，轻轻口底摇晃多次至dna析出，然后
‑
20℃放置30min；4℃、12000rpm离心10min，弃去乙醇。
[0044]
⑦
加入70％乙醇1ml，温和摇动10min；4℃、12000rpm离心10min，弃乙醇；重复漂洗一次；室温放置30min，60℃烘箱放置30s，使乙醇挥发干净。
[0045]
⑧
加入超纯水50μl，4℃保存至dna完全溶解，分光光度计测定浓度后，
‑
80℃保存。
[0046]
2.目的基因及参考基因的扩增
[0047]
在ncbi上查找到重测序中筛选出的拷贝数变异区域的序列(参考山羊kcnj15基因组序列nc_030808.1)。利用prime 5.0软件设计被包含在此区域的引物，并在ncbi_blast中
进行比对。同时，以ncbi所公布的山羊mcr1基因序列为参考序列(nc_030825.1)，采用相同的方法设计扩增该参考基因(mcr1基因)序列中特定片段的引物。引物序列具体如表2所示。
[0048]
表2.实时荧光定量pcr的引物信息
[0049][0050][0051]
3.实时荧光定量pcr
[0052]
qpcr反应体系如表3所示。
[0053]
表3.qpcr的反应体系
[0054][0055]
qpcr所用的反应程序为：
[0056]
(1)预变性：94℃，2min；
[0057]
(2)扩增反应：94℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。
[0058]
绘制的扩增曲线平滑表明qpcr试剂质量好且扩增体系和条件合适；绘制的溶解曲线中各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体、非特异扩增引起的杂峰，表明引物质量好。通过绘制扩增曲线和溶解峰确定引物适用于实时荧光定量pcr分析(图1、图2)。
[0059]
4.cnv类型的计算
[0060]
每个样品分别用目标序列和参考序列的引物(引物对p1和p2)进行扩增，并且每对引物3个重复。本发明基于qpcr技术来检测cnv类型：根据2
‑
δδct
方法进行拷贝数(cn)的分析，δδct＝(ct
目的基因
‑
ct
参考基因
)
实验组
‑
(ct
目的基因
‑
ct
参考基因
)
对照组
。其中，实验组即为待检测有无cnvs的样品，对照组即为已知无拷贝数变异的样品，可以采用重测序试验中所选择的参照组各品种个体，ct即cycle threshold，为pcr扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。2
‑
δδct
表示的是实验组目标序列的拷贝数相对于对照组的倍数。然后将基因的表达丰度进行对数转化(以2为底2
‑
δδct
的对数)使之符合正态分布，进行方差齐性检验后，统计检验各组间的差异。
[0061]
当目标序列为正常型序列时，根据2*2
‑
δδct
计算出归一化值0左右(2*2
‑
δδct
＝2)。
当目标序列为缺失型序列时，根据2*2
‑
δδct
计算出归一化值(2*2
‑
δδct
<2)。当目标序列为多拷贝型序列时，根据2*2
‑
δδct
计算出归一化值(2*2
‑
δδct
>2)。
[0062]
5.数据分析
[0063]
统计检测群体中各种cnv类型(deletion、normal和duplication)的个体数，并计算各种拷贝数的频率(图3)。计算公式如下：
[0064]
pc＝nc/n
[0065]
其中，pc代表某种拷贝数的频率；nc代表群体中具有c这种拷贝数的个体数；n代表检测群体的总个体数量。
[0066]
利用spss(18.0)进行关联性分析。在数据处理中，根据影响生长性状指标的因素的不同，考虑到环境效应、年龄、遗传效应及其互作效应，采用固定模型进行分析，同时根据实际情况进行简化。完整的模型如下：
[0067]
y
ijk
＝μ+g
j
+e
ijk
[0068]
其中，y
ijk
为个体表型记录；μ为群体均值；g
j
为各位点的拷贝数类型；e
ijk
为随机误差。
[0069]
关联分析结果如表4、表5、表6、表7及表8所示。
[0070]
表4.贵州黑山羊kcnj15基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析
[0071][0072]
注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(p>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(p<0.05)。n表示具有相同拷贝数的个体数。
[0073]
参见表4，贵州黑山羊kcnj15基因拷贝数变异位点(nc_030808.1的150479082位到150489041位)与个体的管围具有显著的相关性(p<0.05)，且正常型的个体生长性状更优。
[0074]
表5.贵州白山羊kcnj15基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析
[0075][0076]
注：n表示具有相同拷贝数的个体数。
[0077]
参见表5，贵州白山羊kcnj15基因拷贝数变异位点(nc_030808.1的150479082位到150489041位)与个体的体重和胸围具有显著的相关性(p<0.05)，且拷贝数为3的个体生长性状更优。
[0078]
表6.河南波槐山羊kcnj15基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析
[0079][0080]
注：n表示具有相同拷贝数的个体数。
[0081]
参见表6，河南波槐山羊kcnj15基因拷贝数变异位点(nc_030808.1的150479082位到150489041位)对个体生长性状影响不明显。
[0082]
表7.槐山羊kcnj15基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析
[0083][0084][0085]
注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(p>0.05)，平均值肩标上字母不
同表示差异显著(p<0.05)。n表示具有相同拷贝数的个体数。
[0086]
参见表7，槐山羊kcnj15基因拷贝数变异位点(nc_030808.1的150479082位到150489041位)与个体的体斜长具有显著的相关性(p<0.05)，且多拷贝型的个体生长性状更优。
[0087]
表8.太行山羊kcnj15基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析
[0088][0089]
注：平均值肩标上字母不同表示差异显著(p<0.05)。n表示具有相同拷贝数的个体数。
[0090]
参见表8，太行山羊kcnj15基因拷贝数变异位点(nc_030808.1的150479082位到150489041位)与个体的体高和体重具有显著的相关性(p<0.05)，且正常型的个体生长性状更优。
[0091]
总之，以上结果表明kcnj15基因的拷贝数变异影响山羊的生长发育，而且kcnj15基因拷贝数变异位点(nc_030808.1的150479082位到150489041位)与体高、胸围、管围、体斜长和体重这些重要生长性状的优势显著相关，因此，该位点可以作为一个提高山羊生长性状的候选分子遗传标记(cnv标记)位点，加快山羊的选育进程。