1.本发明涉及一种烟酸的转化方法，特别涉及一种利用微生物转化烟酰胺为烟酸的方法。
背景技术：
2.烟酰胺与烟酸统称为维生素b3，在酵母、米糠、麦麸和肉类中含量丰富。家畜体内能由色氨酸合成，但合成量不能满足需要，必须从饲料中获取补充。烟酰胺与烟酸均为白色结晶性粉末，溶于水及酒精，化学性质稳定，不易破坏，应密封保存。
3.烟酰胺在体内与核糖、磷酸、腺膘呤构成辅酶ⅰ和辅酶ⅱ，它们是许多脱氢酶的辅酶，在体内生物氧化中起脱氢和加氢作用，与很多代谢过程包括葡萄糖酵解、脂肪代谢、丙酮酸代谢和高能磷酸键的生成等有密切关系。烟酸在体内变为烟酰胺，才能发挥上述作用。此外烟酸还有较强的外周血管扩张作用。烟酰胺与烟酸缺乏时，犬发生黑舌病，雏鸡出现腿骨弯曲、肿胀。玉米中缺乏色氨酸和烟酸，当长期单纯给猪喂玉米时，可发生维生素pp缺乏症，呈现口炎、皮肤领裂、腹泻等糙皮病的症状。鱼烟酸缺乏时，鲤鱼出现表皮出血，眼球突出，烂鳍，鳍基部出血，食欲不振，生长减慢，神经痉挛，迟钝，平衡减退等症状。此时可在饲料中补充烟酸，或给患畜注射烟酰胺进行治疗。
4.虽然烟酰胺与烟酸可以在体内可以相互转化，但是在实际应用中却是互为主要杂质，特别是在烟酰胺的皮肤相关应用中，烟酸受体是g
‑
蛋白偶联受体，刺激导致外周血管扩张，致使皮肤潮红反应。大多数使用者对此强烈排斥，所以对烟酸含量有着非常严苛的规定。现阶段主要的烟酰胺/烟酸制取方法主要分两种，1.化学法，通过原料3
‑
氰基吡啶在一定条件下进行反应，2.生物法，如腈水合酶、腈水解酶等，但这些方法大部分存在一些弊端，就是会产生烟酰胺/烟酸副产物，而常规方法是很难进行有效分离的。
5.现阶段的主要分离方法是进行重结晶或者水洗/有机溶剂冲洗，这虽然能解决一部分问题，但是大量的滤液无法正常利用，存在很大程度的浪费。也有利用水解将烟酰胺全部转化为烟酸，方法可行，但是化学法的转化率不高，无法将烟酰胺完全转化，且效率较低。
技术实现要素：
6.本发明的目的在于提供一种利用微生物转化烟酰胺为烟酸的方法，对筛出的烟酰胺降解菌进行诱导和驯化，通过多批次筛选，得到高效转化烟酰胺为烟酸的大肠杆菌。其在烟酰胺溶液中可以高效转化底物烟酰胺，生成烟酸，转化率高达100％，剩余烟酰胺含量在30mg/l以内，经济性好，反应温和，污染小，以解决上述背景技术中提出高烟酸含量的烟酰胺物料或者高烟酰胺含量的烟酸物料分离问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.一种利用微生物转化烟酰胺为烟酸的方法，包括如下步骤：
9.s100：紫外诱变筛选高表达烟酰胺菌株；
10.s200：高效烟酰胺菌训化；
11.s300：将驯化后的菌株接入常规微生物液体培养基培养至对数期，离心收集菌体，用生理盐水重悬，在200
‑
500g/l浓度的烟酰胺溶液中加，每100ml溶液中加入0.5
‑
5u酶量的菌悬液，反应在ph6.0
‑
8.0、温度18
‑
40℃条件下进行2
‑
8h，结束后，烟酰胺含量低于30mg/l。
12.进一步地，s100的步骤如下：
13.s101：取对数生长期的大肠杆菌m110020，平铺于90mm的无菌培养皿，置于15w紫外灯下25cm处，分别在避光条件下照射处理15s、30s、60s、75s、90s、120s，150s；
14.s102：照射后的培养皿放置在冰水中，静置1.5小时，将培养的菌液均匀涂布在筛选培养基上，30℃静置培养4天；生长的单菌落用于发酵摇瓶筛选，20℃
‑
35℃摇床培养，摇床转速150
‑
300rpm；
15.s103：挑取若干单菌落，接种于筛选培养基；
16.s104：高效烟酰胺菌通过hplc检测筛选获得，并用于后续训化。
17.进一步地，s103的筛选培养基配方如下：葡萄糖：0.1
‑
30(g/l)、酵母浸粉0.1
‑
1(g/l)、蛋白胨0.1
‑
1(g/l)、烟酰胺5
‑
50(g/l)、kh2po
4 0.5
‑
1.5(g/l)、k2hpo
4 0.5
‑
1.5(g/l)、mgso4·
7h2o 0.1
‑
1(g/l)、nacl 1(g/l)、(nh4)2so
4 1
‑
5(g/l)。
18.进一步地，s200的步骤如下：
19.s201：首先配制一系列液体培养基(编号1,2,3}
…
):按编号由小到大的顺序，培养基中筛选时用的营养比例逐渐减小，烟酰胺的物质比例在逐渐增大，121℃，高温灭菌200
‑
30min；
20.s202：将高效烟酰胺菌分别接种到1号培养基中，在摇床中进行培养，待培养基中od600大于0.5时，吸取一定量的1号培养基中的菌液至2号培养基中，依次类推，直至将菌液接种至烟酰胺含量为200
‑
500g/l培养基中进行培养，以此实现从富营养到贫营养的驯化；
21.s203：接下来再配制一系列液体培养基(编号1,2,3}
…
):按照编号由小到大的顺序，培养基中筛选时用的营养比例在逐渐增大，烟酰胺比例在逐渐减小，将这些培养基121℃，高温灭菌200
‑
30min，待用。然后，从高含量烟酰胺的培养基中吸取一定量菌液至1号培养基中，操作同上，实现从贫营养到富营养的驯化；
22.s204：反复几次富营养到贫营养，贫营养到富营养的驯化，最后的菌液也用于实际烟酰胺转化中，并要将驯化后的烟酰胺菌保存。
23.进一步地，所述富营养培养基组成为：kh2po
4 0.5
‑
1.5(g/l)、k2hpo
4 0.5
‑
1.5(g/l)、mgso4·
7h2o 0.1
‑
1(g/l)、nacl 1
‑
10(g/l)、胰蛋白胨5
‑
10(g/l)、酵母粉5
‑
15(g/l)、氯化铵0.1
‑
1(g/l)、甘油0.1
‑
1(g/l)，其余为水，ph 6.5
‑
7.5。
24.进一步地，s300的常规微生物液体培养基为lb液体培养基、na液体培养基或pda液体培养基。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
26.本发明解决了现有的烟酸/烟酰胺杂质难以分离、无法利用的问题。本发明通过筛菌、紫外诱变筛选出高效降解烟酰胺生成烟酸的菌株，并通过驯化实验，使筛选的菌株适应不同条件，最后得到一株能够高效转化烟酰胺并生成烟酸的大肠杆菌。并通过实验证明其可以在200
‑
500g/l的烟酰胺溶液中转化99.9％以上的底物，使最终的烟酰胺浓度低于30mg/l，烟酸含量在200
‑
500g/l。本发明利用大肠杆菌转化烟酰胺为烟酸，具有经济性好，反应温和，污染小，适合处理高烟酸的烟酰胺或高烟酰胺的烟酸物料，并生成高浓度的烟酸
溶液。
具体实施方式
27.下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.从污水池不同角度取污泥样100余批，分批富集培养后进行筛选和鉴定：
29.称取10克污泥，加无菌水50ml，用玻璃珠摇碎后取5ml悬浊液接种到45ml富集培养基中，放置30℃摇床上，120rpm振荡培养3天。之后取该培养液进行梯度稀释，取10
‑6、10
‑7、10
‑8的梯度稀释液涂布到含初筛固体培养基的平板上，置30℃恒温培养箱培养3～6天。挑取生长出的单菌落接种到新的初筛固体培养基上扩大培养，培养条件同上。待菌长出后刮取3～5环接种到液体发酵培养基中进行培养。在30℃摇床上120rpm下振荡培养3天，取15ml培养液3000rpm下离心10min，倒去上清液后用等体积的生理盐水冲洗沉淀菌体，继续离心得菌体。将所得菌体分别添加到含1％(％：g/100ml)烟酰胺的pbs缓冲液中转化2小时，反应体系中菌体浓度为0.5g/l。取5ml转化液4000rpm下离心10min得上清液，hplc法分析上清液。如果转化液含有烟酸，则说明该菌会转化烟酰胺，生成烟酸；选择其中烟酸转化率最高的一株，按《简明伯杰细菌鉴定手册》第八版进行鉴定为大肠杆菌。
30.筛选方法中的所述的液体富集培养基、固体初筛培养基、液体复筛培养基如下：
31.富集培养基：葡萄糖：0.1
‑
30(g/l)、酵母浸粉0.1
‑
1(g/l)、蛋白胨0.1
‑
1(g/l)、烟酰胺5
‑
50(g/l)、kh2po
4 0.5
‑
1.5(g/l)、k2hpo
4 0.5
‑
1.5(g/l)、mgso4·
7h2o 0.1
‑
1(g/l)、nacl 1(g/l)、(nh4)2so
4 1
‑
5(g/l)，ph：7，121℃灭菌20min。
32.固体初筛培养基(g/100ml)：葡萄糖：0.1
‑
30(g/l)、酵母浸粉0.1
‑
1(g/l)、蛋白胨0.1
‑
1(g/l)、烟酰胺5
‑
50(g/l)、kh2po
4 0.5
‑
1.5(g/l)、k2hpo
4 0.5
‑
1.5(g/l)、mgso4·
7h2o 0.1
‑
1(g/l)、nacl 1(g/l)、(nh4)2so
4 1
‑
5(g/l)、琼脂：2，ph：7，121℃灭菌20min。
33.液体发酵培养基(g/100ml)：葡萄糖：3，酵母浸粉：0.5，蛋白胨：0.5，氯化钠：0.1，磷酸二氢钾：0.1，磷酸氢二钾：0.1，硫酸镁：0.05，甘油：0.5，ph：7，121℃灭菌20min。
34.酶活测定
35.本实施例采用大肠杆菌发酵液进行酶活测定。酶活的定义：在25℃下，1ml发酵液与1.75g烟酰胺反应催化10分钟后生成的烟酸的毫摩尔数，该毫摩尔数即为总酶活力单位数u。该检测的反应体系为0.5ml，其中50mm磷酸缓冲溶液中含35μg底物烟酰胺，加入适当的发酵液，在25℃下反应10分钟后，立即添加0.5ml纯乙腈终止反应。12000rpm离心3分钟后，去上层清液采用高效液相色谱(hplc)测定上层清液中的烟酸的含量。高效液相色谱的检测条件如下：
36.色谱柱：eclipse plus c18 5um 4.6*250mm
37.柱温：30℃
38.流动相：a：80ml水+0.1g庚烷磺酸钠+0.02ml三乙胺+0.1ml冰醋酸
39.b：乙腈
40.a:b＝9:1
41.流速：0.8ml/min
42.检测波长：265nm
43.进样量：20μl
44.紫外诱变筛选高表达烟酰胺菌
45.a.取对数生长期的m110020,平铺于90mm的无菌培养皿，置于15w紫外灯下25cm处，分别在避光条件下照射处理15s、30s、60s、75s、90s、120s，150s。
46.b.照射后的培养皿放置在冰水中，静置1.5小时，将培养的菌液均匀涂布在筛选培养基上，30℃静置培养4天；生长的单菌落用于发酵摇瓶筛选，20℃
‑
35℃摇床培养，摇床转速150
‑
300rpm。
47.c.挑取若干单菌落，接种于筛选培养基，配方如下：kh2po
4 0.5
‑
1.5(g/l)、k2hpo
4 0.5
‑
1.5(g/l)、mgso4·
7h2o 0.1
‑
1(g/l)、nacl 1
‑
10(g/l)、胰蛋白胨5
‑
10(g/l)、酵母粉5
‑
15(g/l)、氯化铵0.1
‑
1(g/l)、甘油0.1
‑
1(g/l)，其余为水，ph 6.5
‑
7.5。
48.d.高效烟酰胺菌通过hplc检测酶活，获得最高酶活的菌种m110022。
49.高效烟酰胺菌训化：
50.a.首先配制一系列液体培养基(编号1,2,3}
…
):按编号由小到大的顺序，培养基中筛选时用的营养比例逐渐减小，烟酰胺的物质比例在逐渐增大，121℃，高温灭菌200
‑
30min。
51.b.将高效烟酰胺菌分别接种到1号培养基中，在摇床中进行培养，待培养基中od600大于0.5时，吸取一定量的1号培养基中的菌液至2号培养基中，依次类推，直至将菌液接种至烟酰胺含量为200
‑
500g/l培养基中进行培养，以此实现从富营养到贫营养的驯化。
52.c.接下来再配制一系列液体培养基(编号1,2,3}
…
):按照编号由小到大的顺序，培养基中筛选时用的营养比例在逐渐增大，烟酰胺比例在逐渐减小，将这些培养基121℃，高温灭菌200
‑
30min，待用。然后，从高含量烟酰胺的培养基中吸取一定量菌液至1号培养基中，操作同上，实现从贫营养到富营养的驯化。
53.d.反复几次富营养到贫营养，贫营养到富营养的驯化，最后的菌液也用于实际烟酰胺转化中，并要将驯化后的烟酰胺菌保存。
54.(4)将驯化后的菌株接入常规微生物液体培养基(lb液体培养基、na液体培养基或pda液体培养基)培养至对数期，离心收集菌体，用生理盐水重悬，调节od600nm＝3.5
‑
4.5作为菌悬液。在200
‑
500g/l浓度的烟酰胺溶液中加，每100ml溶液中加入0.5
‑
5u酶量的菌悬液，反应在ph6.0
‑
8.0、温度20
‑
40℃条件下进行2
‑
8h，结束后，溶液中的烟酰胺含量低于30mg/l，烟酸含量在200
‑
500g/l。
55.烟酰胺菌200ml反应实验
56.1.获得一批高烟酸含量的烟酰胺物料，经检测烟酸含量为1058mg/l，烟酰胺含量在99.73％。
57.2.将驯化后的烟酰胺菌m110022接入常规微生物液体培养基(lb液体培养基、na液体培养基或pda液体培养基)，25℃，180rpm，培养至对数期，12000rpm离心，弃上清，菌体用生理盐水重悬。
58.3.将烟酰胺物料配置成40％浓度的烟酰胺溶液1000ml，放置在20℃环境下，调节ph为7.5，加入m110022酶量为400u，搅拌，控制ph为7.5
±
0.2；
59.4.6h后，取样检测其中的烟酸和烟酰胺含量，经检测，烟酸含量在399.59g/l，烟酰胺含量在28mg/l。
60.烟酰胺菌1000ml反应实验
61.1.获得一批高烟酸含量的烟酰胺物料，经检测烟酸含量为1252mg/l，烟酰胺含量在99.51％；
62.2.将驯化后的烟酰胺菌m110022接入常规微生物液体培养基(lb液体培养基、na液体培养基或pda液体培养基)，25℃，180rpm，培养至对数期，12000rpm离心，弃上清，菌体用生理盐水重悬。
63.3.将烟酰胺物料配置成40％浓度的烟酰胺溶液1000ml，放置在20℃环境下，调节ph为7.5，加入m110022酶量为2200u，搅拌，控制ph为7.5
±
0.2；
64.4.6h后，取样检测其中的烟酸和烟酰胺含量，经检测，烟酸含量在401.56g/l，烟酰胺含量在21mg/l。
65.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。