一种KCNH2突变基因及长QT综合征检测试剂盒的制作方法

一种kcnh2突变基因及长qt综合征检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及人类遗传学和内科心血管技术领域，尤其涉及一种kcnh2突变基因及长qt综合征检测试剂盒。


背景技术：

2.长qt综合征(long qt syndrome,lqts)是一种常染色体显性遗传性心脏病，以反复发作的晕厥，抽搐，甚至猝死为临床特征，心电图上表现为qtc延长，t波改变，尖端扭转性室性心动过速(torsade de pointes,tdp)。儿童和30岁之前的青年患者较多，多由运动和情绪应激(例如铃声、雷声或突然唤醒)诱发。由于发病年龄小，对家庭和社会影响巨大。
3.目前已知的lqts的最常见致病基因是kcnq1(突变引发lqts 1型)、kcnh2(突变引发lqts2型)和scn5a(突变引发lqts 3型)，约占遗传性lqts患者的90％以上，其中，我国最常见的lqts类型为lqt2。lqt2的致病基因位于7q35
‑
7q36，并由15个外显子组成的kcnh2突变引发。kcnh2基因编码快速激活延迟整流性钾通道(i
kr
)，i
kr
是心肌细胞复极3期的主要电流，在心肌细胞复极过程至关重要。现已证明，kcnh2基因突变主要通过“显性失活”和“运输异常”两种机制发生效应，“显性失活”是通过突变体与野生型蛋白形成四聚体，导致离子通道封闭，丧失功能；“运输异常”是突变发生后引起蛋白化学修饰障碍，导致突变蛋白质阻滞于内质网中，引起细胞膜上通道减少，ikr电流减弱。
4.kcnh2基因突变与lqts 2型的发病密切相关，但是目前报道的kcnh2基因的突变位点还非常有限，发现任何一个kcnh2基因的突变位点都是对本领域的重要技术贡献，都有助于预防和诊断lqts 2型，为更多患者带来新生的希望。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种kcnh2突变基因及长qt综合征检测试剂盒，以解决上述技术问题之一。
6.本发明通过对长qt综合征的家系成员进行分析，意料不到地发现了，家系中的长qt综合征患者具有如下突变：
[0007][0008]
kcnh2基因编码一种电压激活型钾离子通道，在心室动作电位的复极末期起到重要作用，也被称为herg基因。
[0009]
c.1015a>t表示，在kcnh2基因的cds区，第1015位的碱基a突变为碱基t，kcnh2基因编码蛋白的氨基酸由天冬酰胺变为酪氨酸。kcnh2基因的cds区的序列为seq id no:1。kcnh2基因cds区编码蛋白的氨基酸序列为seq id no:2。
[0010]
在基因组chr7:150654482
‑
chr7:150654513处，野生型kcnh2基因的序列为：seq id no:3，具体序列为：aagattccccaaatcaccctcaactttgtgga，其中a为突变前碱基。
[0011]
在基因组chr7:150654482
‑
chr7:150654513上，kcnh2突变基因的序列为：seq id no:4，具体序列为：aagattccccaaatcaccctctactttgtgga，其中t为突变后碱基。
[0012]
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
[0013]
一、本发明提供一种kcnh2突变基因，在基因组位置chr7:150654492，碱基a突变为碱基t；参考基因组版本是grch37。
[0014]
查询人群频率数据库发现该变异为罕见变异(千人基因组：无，esp6500：无，exac：无)。采用多个生物信息预测软件(包括sift和polyphen
‑
2等)交叉预测，结果多为有害(sift为“d”，polyphen
‑
2为“p”，mutationtaster_pred为“d”，vest3评分为“0.847”，其他为“4个d/1个n/1个m”)，氨基酸由极性不带电荷的天冬酰胺变为极性不带电荷的酪氨酸，提示该变异所致的氨基酸改变可能会对蛋白功能产生影响。查询数据库发现该位置的氨基酸在脊椎动物中保守性好。查询clinvar、hgmd数据库未发现该变异，文献检索未发现该变异与疾病相关的报导。根据现有证据：该变异为罕见变异、软件预测该变异可能会对蛋白功能产生影响、该位置氨基酸在脊椎动物中保守性好，为可疑致病变异。
[0015]
优选地，在基因组chr7:150654482
‑
chr7:150654513处，kcnh2突变基因的序列为：seq id no:4。
[0016]
二、本发明还提供了上述kcnh2突变基因在制备长qt综合征检测试剂盒中的应用。
[0017]
优选地，包括根据kcnh2突变基因设计的正向引物和反向引物，正向引物的序列为seq id no:5，反向引物的序列为seq id no:6。
[0018]
三、本发明的有益效果在于：
[0019]
(1)本发明提供的人类kcnh2突变基因c.1015a>t杂合错义变异可以将长qt综合征患者和正常人群区分开，可以作为临床辅助诊断长qt综合征的生物标志物。
[0020]
(2)通过检测受试者是否携带了上述变异，检测该变异的携带者，可以为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生；为人类攻克长qt综合征提供可能的药物靶点，促进创新药物研发。
附图说明
[0021]
图1为长qt综合征家系图；
[0022]
图2为先证者sanger测序图；
[0023]
图3为家系中非患病成员的sanger测序图。
具体实施方式
[0024]
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
[0025]
实施例1
‑
先证者验证实验
[0026]
样本来源：阜外医院，在先证者(女，20岁)及家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5
‑
10ml全血样本，建立病历资料库，详细记录先证者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。
[0027]
先证者临床概况：
[0028]
表1先证者的临床概况
[0029][0030]
采用sanger测序法对先证者及其家属的kcnh2基因进行基因检测，具体步骤如下：
[0031]
s1、制备基因组dna
[0032]
使用江苏百世诺医疗科技有限公司的磁珠法全血基因组dna提取试剂，对先证者和验证样本的人类全血edta抗凝样本进行全基因组dna的提取，对dna的浓度和纯度进行检测。
[0033]
s2、对kcnh2突变基因进行扩增；
[0034]
(1)配制pcr扩增试剂，pcr扩增试剂的组成具体参见下表2：
[0035]
表2 pcr扩增试剂的组成
[0036][0037]2×
taq mastermix(dye)中包含如下成分：taq dna polymerase、pcr buffer、mg
2+
、dntps、pcr稳定剂和增强剂等常规pcr所需要的组份。
[0038]
扩增所需的引物信息如下表3所示：
[0039]
表3引物信息
[0040]
序列编号引物名称序列(5
’→3’
)seq id no:5kcnh2
‑
000238
‑
e5fctcctggctgcttccttagagtseq id no:6kcnh2
‑
000238
‑
e5rccacccggctctggatcaca
[0041]
(2)目的片段扩增
[0042]
将反应体系混合，在pcr仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序如下表3所示。扩增完成后，使用agencourt ampure xp磁珠(购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司)对pcr产物进行纯化。
[0043]
pcr扩增程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共30循环。72℃终延伸2min。
[0044]
取2μl的pcr产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物为预期的大小，选用1000bp marker作为参考。
[0045]
s3、使用3730xl genetic analyzer全自动测序仪对s2获得的pcr产物进行sanger测序，从ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获得参考序列和测序结果进行比对。
[0046]
图1为长qt综合征家系图；图2为先证者sanger测序图；图3为家系中非患病成员的sanger测序图。结果如图1
‑
图3所示：先证者携带的kcnh2突变基因遗传自先证者母亲，先证者母亲携带的kcnh2突变基因遗传自先证者外公。先证者舅舅，以及先证者舅舅的儿子也携带了kcnh2突变基因。
[0047]
实施例2
‑
一种长qt综合征检测试剂盒
[0048]
本实施例提供用于检测人类kcnh2突变基因c.1015a>t杂合错义变异的试剂盒，试剂盒组成如下表4所示：
[0049]
表4试剂盒组成
[0050][0051]
利用本试剂盒筛选长qt综合征的具体步骤为：按照实施例1的步骤提取待测者dna，然后使用经设计的引物组合(seq id no:5和seq id no:6)对kcnh2基因进行扩增，得到pcr产物，最后对pcr产物进行测序。从ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获得参考序列和测序结果进行比对，判断待测者kcnh2基因是否携带c.1015a>t杂合错义变异，协助临床确诊待测者是否患有长qt综合征2型。
[0052]
实施例3
‑
针对家系外的正常人的突变验证
[0053]
参照实施例1的方法，对463例同种族无关正常人(即家系外正常人)进行kcnh2基因c.1015a>t突变位点检测，结果均未能检测到该突变。
[0054]
综上结果，并基于kcnh2基因的c.1015a>t杂合错义变异会导致kcnh2基因编码的蛋白质发生p.asn339tyr的改变，而kcnh2基因是长qt综合征的已知致病基因，从而再次证明了kcnh2基因的c.1015a>t杂合错义变异为长qt综合征的致病突变。
[0055]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。