一种促进间充质干细胞向成骨细胞分化的方法与流程

一种促进间充质干细胞向成骨细胞分化的方法
(一)技术领域
1.本发明涉及一种通过alx1
‑
lncrna
‑
igf2通路促进间充质干细胞向成骨细胞分化的方法。
(二)

背景技术：

2.人体的骨组织存在着具有一定分化潜能的干细胞。相关的研究已经表明，来自于骨髓的间充质干细胞(mscs)可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和心肌细胞等，尤其是间充质干细胞向成骨细胞分化的研究成为基于干细胞的骨损伤修复以及骨组织工程技术发展的重要基础，在医学上将具有成骨细胞移植和骨组织工程化的重大应用价值。
3.目前在间充质干细胞定向分化成骨细胞技术方面，采取的主要是添加相关细胞因子，或采取施加力学作用来促进间充质干细胞向成骨细胞分化。添加细胞因子的方法是依据骨分化和发育相关的分子机制，在体外间充质干细胞定向诱导分化培养液中添加骨形态发生蛋白(bmp)和胰岛素样生长因子(igf2)等细胞因子调节骨分化和发育相关的细胞信号通路活性进行成骨细胞分化诱导。对于力学作用的方法，是在特定的装置(如流体剪切板或灌流装置)中通过培养液流经贴壁的间充质干细胞，从而对间充质干细胞产生一定的流体剪切力，这种流体剪切力作用于细胞的胞外基质和受体，从而将胞外的力学信号转化为胞内的化学信号，再通过调节骨细胞分化和发育相关的细胞信号通路活性，最终促进间充质干细胞向成骨细胞分化。但是这两种技术方法在实际应用上具有一定的局限性，尤其是在临床应用和骨组织工程种子细胞制备上具有诸多的不便：细胞因子方法不但增加成本，而且骨细胞诱导分化效率较低，并不便于临床体内应用；流体剪切力方法需要特殊的设备，且也不适用于体内骨损伤修复治疗。
4.因此，如果通过大量的基因表达组分析，寻找到新的、骨分化相关的关键分子靶点，并针对新靶点采用新的技术促进成骨细胞分化，则不但可开辟新的干细胞定向分化成骨细胞研究思路，同时对可大大降低体外成骨细胞制备成本，提高成骨细胞分化效率，也可促进骨损伤修复的临床应用研究。
(三)

技术实现要素：

5.为了有效提高间充质干细胞定向分化成骨细胞的能力，本发明依据在rna
‑
seq分析基础上发现一种新的骨分化特异相关的长链非编码rna(lncrna)，即lncrna ac132217.4，构建其上游转录因子型盒1(alx1)的高表达载体，促进间充质干细胞高效表达lncrna ac132217.4，提高lncrna
‑
igf2信号通路活性，目的是提供一种有效促进间充质干细胞定向分化成骨细胞的方法。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明提供一种促进间充质干细胞向成骨细胞分化的方法，所述方法为：
8.(1)构建alx1基因的表达载体，并将所述alx1基因的表达载体转入所述间充质干细胞中，得到高效表达外源alx1的间充质干细胞；
9.(2)取步骤(1)制备的所述的高效表达外源alx1的间充质干细胞用成骨细胞诱导液进行定向诱导培养，得到所述成骨细胞。
10.基因高表达技术是采用慢病毒过表达载体(plenti
‑
cmv
‑
puro)，目标基因alx1扩增引物序列为：引物cgc gtc gac atg gag ttt ctg agc gag a和cat ggc cca tga aat att ggc tag cta gc。表达载体通过慢病毒包装质粒pspax2和pmd2g转染293t细胞进行病毒包装后感染第3代间充质干细胞。
11.进一步，所述间充质干细胞可来自下列组织之一：骨髓、脂肪、新生儿脐带、胎盘等。本发明使用的间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞。
12.进一步，所述alx1基因的表达载体是通过将alx1基因连接到慢病毒过表达载体上构建而成。
13.优选地，所述alx1基因的表达载体按如下方法制备：通过引物cgc gtc gac atg gag ttt ctg agc gag a和cat ggc cca tga aat att ggc tag cta gc对人alx1基因的cdna序列进行pcr扩增，得到目的基因，用限制性内切酶sali和nhei分别对慢病毒过表达载体plenti
‑
cmv
‑
puro和所述目的基因进行酶切，得到带粘性末端的目的基因和线性载体，用连接酶将所述带粘性末端的目的基因和线性载体进行连接，得到所述alx1基因的表达载体(所述alx1基因的表达载体的序列如seq id no：2所示)。
14.进一步，本发明的所述人alx1基因的cdna序列采用如下方法获得：采用trizol试剂(invitrogen,carlsbad,ca)分离提取人骨髓间充质干细胞总rna，然后采用cdna第一链合成试剂盒(fermentas公司)进行cdna第一链合成，即获得所述人alx1基因的cdna序列。
15.优选地，所述alx1基因的表达载体通过lip8000转导试剂盒(碧云天生物有限公司)转入所述间充质干细胞中。
16.具体地，所述高效表达外源alx1的间充质干细胞按如下方法得到：所述alx1基因的表达载体通过慢病毒包装质粒pspax2和pmd2g转染293t细胞进行病毒包装后，在8μg/ml的1,5
‑
二甲基
‑
1,5
‑
二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene,sigma,st.louis,mo)辅助下对间充质干细胞继续培养12个小时，即获得所述的高效表达外源alx1的间充质干细胞。
17.进一步，每升所述成骨细胞诱导液由以下组分组成：900ml dmem
‑
lg培养液，100ml胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素、10mmβ
‑
甘油磷酸钠、50μm抗坏血酸。
18.进一步，所述定向诱导培养的条件为：37℃，7天。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
20.(1)本发明提供的技术中采用成骨细胞分化特异的长链非编码lncrna ac132217.4上游特异的转录因子alx1基因高表达载体转导间充质干细胞，能有效提高间充质干细胞中长链非编码lncrna ac132217.4的表达，促进了成骨细胞分化特异的igf2细胞信号通路的活化。
21.(2)本发明技术构建的外源性表达alx1的间充质干细胞在成骨细胞诱导分化体系中，省去了培养体系中对外加细胞因子或特殊设备的需要，降低了间充质干细胞定向诱导分化成骨细胞的培养成本。
22.(3)本发明技术产生的间充质干细胞定向诱导分化成骨细胞培养体系与传统的成骨细胞定向诱导分化比较，有效提高了间充质干细胞定向分化成骨细胞的效能。
23.本发明关键在于依据新的成骨特异性长链非编码lncrna(lncrna ac132217.4)及
其上游特异性转录因子alx1的验证，进行alx1表达载体构建和间充质干细胞转染，制备高效表达alx1的间充质干细胞，促进间充质干细胞定向分化成骨细胞的能力。表达载体构建、间充质干细胞转染以及成骨细胞定向分化过程中的其他参数，均可采用本领域常规手段进行。
(四)附图说明
24.图1.lncrna ac132217.4随成骨分化的增加其表达量增加:(a)人骨髓间充质干细胞成骨分化中差异表达的lncrnas。(b
‑
c)ac132217.4随成骨分化表达增加。数据分析依照mean
±
sd；n≥3；*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。
25.图2.绿色荧光蛋白分析alx1病毒的感染效率
26.图3.ac132217.4通过调节igf2基因mrna的稳定性促进成骨分化:(a)starbase数据库查验lncrna ac132217.4下游的潜在靶向性mrna。(b)定量pcr检测lncrnaac132217.4敲低后对igf2基因mrna的稳定性的影响；(c
‑
d)igf2敲低对成骨分化分化相关蛋白和基因的影响；(e
‑
f)igf2敲低对成骨分化alp活性和茜素红的影响；(g
‑
h)lncrna ac132217.4敲低的细胞中过表达igf2对成骨分化分化相关蛋白和基因的影响；(i
‑
j)此成骨分化lncrna ac132217.4敲低的细胞中过表达igf2对成骨分化alp活性和茜素红的影响。ach:ac132217.4过表达的人骨髓间充质干细胞；ctr：过表达空载的人骨髓间充质干细胞；igf2 shrna:igf2敲低的人骨髓间充质干细胞；ctr shrna：干扰空载质粒感染的人骨髓间充质干细胞。ach+igf2 shrna：ac132217.4过表达的同时igf2敲低的人骨髓间充质干细胞。标尺:50um.数据分析依照mean
±
sd；n≥3；*p<0.05,**p<0.01,**p<0.001。
27.图4.alx1通过结合在lncrna ac132217.4的启动子处影响其转录水平:(a)人间充质干细胞成骨分化7天后差异表达的转录因子；(b)promo数据库预测lncrna ac132217.4的起始位点上游3000bp内的alx1的结合位点；(c
‑
d)alx1敲低对ac132217.4和igf2表达的影响；(e
‑
f)构建ac132217.4启动子野生型和突变的的报告基因，验证alx1与ac132217.4启动子的结合位点。alx1 shrna1:alx1干扰序列1敲低的人骨髓间充质干细胞；alx1 shrna2:alx1干扰序列2敲低的人骨髓间充质干细胞；shctr：干扰空载质粒感染的人骨髓间充质干细胞；wt：野生型的ac132217.4启动子序列的荧光素酶报告基因；mut：alx1结合位点突变的ac132217.4启动子序列的荧光素酶报告基因；alx1h：alx1过表达的人骨髓间充质干细胞；ctr：过表达空载的人骨髓间充质干细胞。数据分析依照mean
±
sd；n≥3；*p<0.05,**p<0.01,**p<0.001。
28.图5.alx1过表达促进lncrna ac132217.4和igf2的表达:(a)定量pcr检查alx1过表达对lncrna ac132217.4和igf2的基因表达水平的影响。(b)western检测alx1过表达对alx1和igf2的蛋白表达水平的影响。alx1h：alx1过表达的人骨髓间充质干细胞；ctr：过表达空载的人骨髓间充质干细胞。数据分析依照mean
±
sd；n≥3；*p<0.05,**p<0.01,**p<0.001。
29.图6.alx1过表达对成骨分化的影响:(a)碱性磷酸酶检测alx1过表达对成骨分化的影响。(b)茜素红检测alx1过表达对成骨钙化的影响。alx1h：alx1过表达的人骨髓间充质干细胞；ctr：过表达空载的人骨髓间充质干细胞。标尺:50um。
(五)具体实施方式
30.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
31.以下细胞培养除特殊说明外培养条件为：在37℃、5％二氧化碳细胞培养箱中进行培养。
32.实施例1：基因表达谱分析
33.收集第3代人骨髓间充质干细胞，制备成单细胞悬液，以2
×
104个/培养皿接种于直径30mm的培养皿进行α
‑
mem培养基贴壁培养，待细胞达到铺层80～90％时，用成骨细胞诱导液(dmem
‑
lg培养液900ml，添加100ml胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素、10mmβ
‑
甘油磷酸钠、50μm抗坏血酸)进行成骨细胞定向诱导。
34.定向诱导7天后，取分化诱导后的细胞和未经诱导分化的细胞各5
×
105个细胞，加入1ml的trizol裂解液中进行细胞裂解，细胞裂解液加入1/5体积的三氯甲烷后，室温静置5min后，13000rpm 4℃离心15分钟后取最上层的水相，加入5/3体积的异丙醇，室温静置10min后，13000rpm 4℃离心10分钟，去上清，加1ml 75％的乙醇后再在4℃下7500rpm离心5分钟，去上清，真空去除残留75％的乙醇后用depc水(检测方提供)溶解。经rna总浓度测定，浓度超过100ng/μl,总量超过1μg后送检测方进行rna
‑
seq测试分析。
35.rna
‑
seq分析数据存储在ncbi基因表达数据库(可通过geo系列登入号gse114117进入)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi)。分析发现在所有发生表达水平变化的基因中，长链非编码lncrnaac132217.4表达水平变化极为显著(图1a，b)，并通过qrt
‑
pcr方法分析得以证实(图1c)。
36.其中图1：(a)人骨髓间充质干细胞成骨分化中差异表达的lncrnas。(b
‑
c)ac132217.4随成骨分化表达增加。数据分析依照mean
±
sd；n≥3；*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。
37.实施例2：lncrna ac132217.4敲低载体的构建
38.lncrna ac132217.4敲低载体由吉玛基因公司购入，采用pgpu6/gfp/neo载体构建，载体构建采用同源重组的方法。构建成短发夹rna(shrna)慢病毒载体如seq id no：1所示。
39.实施例3：lncrna ac132217.4的短发夹rna(shrna)慢病毒载体转染间充质干细胞
40.采用lip8000转导试剂盒(碧云天生物有限公司)进行重组病毒载体悬浮液的制备和对间充质干细胞的转导。按照试剂盒说明书，采用兼噬性包装细胞系293t细胞(atcc,rockefeller,ma)制备重组病毒载体悬浮液，。在8μg/ml的1,5
‑
二甲基
‑
1,5
‑
二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene；sigma,st.louis,mo)辅助下，在37℃细胞培养箱中，于10
‑
cm的培养皿(nunc公司)中对2.0
×
105个间充质干细胞进行8个小时的重组病毒载体转导。细胞转导效率采用增强绿色荧光蛋白(gfp)进行分析(如图2)，其结果表明转导的shrna能在间充质干细胞内长期表达。
41.实施例4：lncrna ac132217.4对成骨细胞分化特异性分析
42.通过starbase数据库查验lncrna ac132217.4下游的潜在靶向性mrna，发现胰岛素样生长因子igf2的mrna与lncrna ac132217.4具有最高的生信评分(silign score)(图3a)，表明igf2基因的mrna可能是lncrna ac132217.4下游的靶向性mrna。：
43.为验证igf2基因的mrna是lncrna ac132217.4下游的靶向性mrna，取转染lncrna ac132217.4的短发夹rna(shrna)慢病毒载体的间充质干细胞，采用成骨细胞诱导培养液(dmem
‑
lg培养液900ml，添加100ml胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素、10mmβ
‑
甘油磷酸钠、50μm抗坏血酸)培养7天后用放线菌素d处理以阻断mrna的合成，由此考察lncrna ac132217.4敲低后igf2基因mrna的稳定性。结果表明，lncrna ac132217.4敲低后igf2基因mrna的稳定性显著下降(图3b)。
44.通过实时定量pcr(real
‑
time pcr)技术(实时定量pcr的反应体系为：1μl cdna+1μl引物+8μl超纯水+10μl 2x syrb定量pcr酶mix；反应条件为：95℃5分钟预变性后40个循环,每个循环95℃10s,60℃40s)分析成骨细胞特异的碱性磷酸酶(alp)、胶原蛋白1(col1a1)和runt相关转录因子2(runx2)基因信使rna(mrna)的表达水平。alp、,col1a1和runx2的扩增引物见下表：
[0045][0046]
免疫印迹(western blot)技术分析col1a1和骨钙蛋白(ocn)活性以及碱性磷酸酶活性检测技术和茜素红染色技术分析alp活性与细胞矿化结节，分析lncrna ac132217.4敲低后间充质干细胞的成骨细胞定向分化能力如图3c
‑
j，显示lncrna ac132217.4敲低导致间充质干细胞的成骨细胞特异性基因与转录因子的表达水平显著下降，lncrna ac132217.4敲低的成骨细胞中过表达igf2后间充质干细胞定向分化成骨细胞的能力恢复表明lncrna ac132217.4通过调节igf2基因mrna的稳定性而提高。
[0047]
图3中：(a)starbase数据库查验lncrna ac132217.4下游的潜在靶向性mrna。(b)定量pcr检测lncrna ac132217.4敲低后对igf2基因mrna的稳定性的影响；(c
‑
d)igf2敲低对成骨分化分化相关蛋白和基因的影响。(e
‑
f)igf2敲低对成骨分化alp活性和茜素红的影响。(g
‑
h)lncrna ac132217.4敲低的细胞中过表达igf2对成骨分化分化相关蛋白和基因的影响。(i
‑
j)此成骨分化lncrna ac132217.4敲低的细胞中过表达igf2对成骨分化alp活性和茜素红的影响。ach:ac132217.4过表达的人骨髓间充质干细胞；ctr：过表达空载的人骨髓间充质干细胞；igf2 shrna:igf2敲低的人骨髓间充质干细胞；ctr shrna：干扰空载质粒感染的人骨髓间充质干细胞。ach+igf2 shrna：ac132217.4过表达的同时igf2敲低的人骨髓间充质干细胞。标尺:50um.数据分析依照mean
±
sd；n≥3；*p<0.05,**p<0.01,**p<0.001。
[0048]
实施例5：lncrna ac132217.4上游特异性转录因子alx1分析
[0049]
为了在间充质定向分化成骨细胞期间能增加lncrna ac132217.4的转录表达水平，依据实施例1中的rna
‑
seq技术分析结果寻找ac132217.4上游的潜在特异性转录因子，结果发现有12个上调和17个下调的转录因子(图4a)。然后我们利用promo数据库分析了lncrna ac132217.4启动子区(lncrna ac132217.4上游约3000bp的基因组区)的转录因子
gac atg gag ttt ctg agc gag a和cat ggc cca tga aat att ggc tag cta gc。alx1的pcr反应的总体积为25μl，95℃5分钟预变性后30个循环，每个循环包括94℃60秒，55℃45秒，72℃60秒。扩增片段长度为981bp。
[0056]
pcr反应体系(20μl)为：1μcdna+1μl引物+8μl超纯水+10μl 2x pcr酶mix。
[0057]
alx1的pcr扩增片段通过sali和nhei(takara公司)酶切位点用连接酶(takara公司)连接到慢病毒过表达载体(plenti
‑
cmv
‑
puro)(济南维真生物有限公司)上，构建成alx1慢病毒过表达载体如seq id no：2所示。
[0058]
构建的alx1慢病毒过表达载体通过lip8000转导试剂盒(碧云天生物有限公司)进行重组病毒载体悬浮液的制备和对间充质干细胞的转导。按照试剂盒说明书，采用包装细胞系293t(atcc,rockefeller,ma)制备重组病毒载体悬浮液。(病毒包装方案：将15ug的总质粒(alx1过表达质粒：pspax2：pmd2g＝4：3：1)与750ul的opti
‑
mem培养基混匀，之后加入24ul的lip8000转染试剂(碧云天生物有限公司)混匀，将转染液加入密度为70
‑
90％的10cm皿的293t细胞中，6小时更换新鲜293t细胞培养基(dmem高糖培养基+10％fbs)，72h后收集上清，上清即为病毒原液)在8μg/ml的1,5
‑
二甲基
‑
1,5
‑
二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene；sigma,st.louis,mo)辅助下，于6
‑
cm的培养皿(nunc公司)中对2.0
×
105个间充质干细胞进行12个小时的重组病毒载体转导。western blotting验证其过表达效率，结果表明转导的过表达质粒能在间充质干细胞内长期表达。
[0059]
对感染了alx1过表达质粒的间充质干细胞定量pcr检测分析lncrna ac132217.4和igf2的基因表达水平(图5a
‑
b)，western和elisa检测了igf2的蛋白表达水平，结果发现alx1的过表达促进了ac132217.4和igf2的表达水平。
[0060]
图5中：(a)定量pcr检查alx1过表达对lncrna ac132217.4和igf2的基因表达水平的影响。(b)western检测alx1过表达对alx1和igf2的蛋白表达水平的影响。alx1h：alx1过表达的人骨髓间充质干细胞；ctr：过表达空载的人骨髓间充质干细胞。数据分析依照mean
±
sd；n≥3；*p<0.05,**p<0.01,**p<0.001。
[0061]
实施例7：转导alx1高表达载体促进间充质干细胞定向分化成骨细胞能力分析
[0062]
将未转染alx1高表达载体的间充质干细胞与转染alx1高表达载体的间充质干细胞，消化成单细胞悬液，以3
×
104个/毫升的密度接种于16孔培养板中，待细胞达到80％
‑
90％融合后，加入用成骨细胞诱导液(dmem
‑
lg培养液900ml，添加100ml胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素、0.1μmol地塞米松、10mmβ
‑
甘油磷酸钠、50μm抗坏血酸)进行成骨细胞定向诱导进行7天的定向诱导。每隔2天换液一次。
[0063]
终止诱导后，碱性磷酸酶染色观察分化效果：所得细胞用pbs(ph 7.2)洗3次，每次1分钟，在室温下用含7.5％蔗糖的1％多聚甲醛固定10～20分钟，然后用碱性磷酸酶试剂盒染色.根据厂家说明,先用底物缓冲液平衡,在新鲜配制的5
‑
溴
‑4‑
氯
‑3‑
吲跺磷酸/氮蓝四唑(bcip/nbt)染色液中室温避光的条件下染色30分钟以上，水洗。在100倍倒置显微镜下观察分化细胞如图6a。
[0064]
终止诱导后，茜素红s染色观察分化效果：用pbs(ph 7.2)洗涤分化细胞3次，每次1分钟，4％多聚甲醛固定标本，2％茜素红s染液37℃孵育5分钟，蒸馏水漂洗后观察(图6b)。
[0065]
图6中：(a)碱性磷酸酶检测alx1过表达对成骨分化的影响。(b)茜素红检测alx1过表达对成骨钙化的影响。alx1h：alx1过表达的人骨髓间充质干细胞；ctr：过表达空载的人
骨髓间充质干细胞。标尺:50um。
[0066]
综上：
[0067]
(1)本发明技术有效地提高了间充质干细胞定向分化成骨细胞的能力：
[0068]
经构建alx1高表达载体并转染间充质干细胞，能有效提高细胞中长链非编码lncrna ac132217.4的表达水平，并由此增强了igf2基因mrna的稳定性，由此提高了igf2信号通路的活性，显著促进了间充质干细胞定向分化成骨细胞的效率，与未转染alx1高表达载体的间充质干细胞相比，定向分化效率提高了68.2％。
[0069]
(2)本发明技术具有降低间充质干细胞定向诱导分化成骨细胞实验成本的优势：
[0070]
经本技术诱导分化以及制备成骨细胞可免除添加相关细胞因子以及特殊设备的需求，有效降低了由昂贵的细胞因子以及特殊设备所造成的高昂成本。
[0071]
(3)本发明技术可应用于临床骨损伤修复治疗和骨组织工程技术的研究：
[0072]
本发明提供了一种具有高效的成骨细胞分化效率的间充质干细胞定向诱导分化成骨细胞的方法，可为骨组织工程研究和应用提供充足的种子细胞，同时alx1和lncrna ac132217.4的高表达技术可应用于临床骨损伤修复及骨不连患者的基因治疗技术研究。