血清诱导型基因与Actin的结合位点的应用

血清诱导型基因与actin的结合位点的应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程与生物医药技术领域，更具体地说是涉及kindlin
‑
2与actin的结合位点在制备对抗肿瘤细胞药物中的应用。


背景技术：

2.肿瘤不仅由肿瘤细胞组成，还有很多不同类型的的细胞和非细胞因子组成的复杂的“生态系统”。肿瘤间质是肿瘤微环境的重要组成部分，它在肿瘤的发生、发展和转移中发挥着至关重要的作用。而在全球范围内，肿瘤已成为第二大死因，全球肿瘤发病率和死亡率每年都在升高。尽管针对肿瘤治疗的手段包括手术、放疗与化疗等的研究已经取得了很大的进展，但是，在改善肿瘤患者的预后过程中仍存在有较多问题。据此，人们提出了靶向治疗的方案，肿瘤靶向治疗是针对导致细胞恶性转化的环节，使用某些能与这些靶分子特异结合的抗体、配体等，在分子水平逆转该恶性生物学行为，从而抑制肿瘤细胞生长，甚至使其完全消退的一种全新的生物治疗模式，是现在临床研究的热点及肿瘤临床治疗的重要手段。
3.kindlin
‑
2是1994年有wick等人筛查出的新的血清诱导型基因。kindlin
‑
2属于kindlin家族，该家族是一类黏着斑蛋白，也是细胞骨架蛋白。kindlin
‑
2可维持细胞
‑
细胞连接和细胞骨架结构，能与细胞中的整合素、整合素连接激酶、踝蛋白、migfilin及桩蛋白等结合，影响细胞的增殖、粘附、迁移、分化以及参与整合素的活化等。在肝癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌等恶性肿瘤中，kindlin
‑
2在基因和蛋白水平表达增加，而kindlin
‑
2能够影响肿瘤细胞的侵袭力和耐药性。
4.细胞代谢受力学环境的强烈影响，有研究表明细胞外基质(extracellular matrix,ecm)硬化促进kindlin
‑
2向线粒体易位，并与pycr1相互作用，导致pycr1水平升高，脯氨酸合成和细胞增殖增加。肿瘤细胞多处于高代谢环境，且常常处于较高力学环境，因此，kindlin
‑
2的高表达可影响肿瘤细胞的增殖。kindlin
‑
2可与f
‑
actin相互作用并诱导actin聚集，可影响整合素的内
‑
外信号传导，说明kindlin
‑
2可调节细胞反应。综合上述研究结果，推断出kindlin
‑
2与actin的相互作用可影响肿瘤细胞的生物学功能，且该效应存在于特定的结合位点。
5.因此，准确找到靶向kindlin
‑
2与actin的结合位点并对其突变，并将该结合位点应用于抗肿瘤治疗中是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明准确找到了靶向kindlin
‑
2与actin的结合位点，对其突变后加以应用，显著抑制了肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.血清诱导型基因kindlin
‑
2与actin的结合位点在制备对抗肿瘤细胞药物中的应用，其特征在于，所述结合位点的序列为：
9.cggttcagcaacatgaagcagtggaatgtcaactgggagatcaagatggtcactgtagagtttgcagatgaggtccggttgtccttcatctgtaccgaagtagactgcaaggtggtccacgaattcattggtggttacatatttctctcaactcgtgcgaaagaccaaaatgaaagtttagatgaggagatgttctacaaactcaccagtggttgggtgtga，如seq id no.1所示。
10.作为本发明优选的技术方案，血清诱导型基因kindlin
‑
2与actin结合位点的突变能破坏kindlin
‑
2与actin的结合，进而抑制肿瘤细胞的侵袭能力。
11.作为本发明优选的技术方案，血清诱导型基因kindlin
‑
2与actin结合位点的突变能抑制肿瘤细胞的增殖。
12.作为本发明优选的技术方案，血清诱导型基因kindlin
‑
2与actin结合位点的突变能促进肿瘤细胞的凋亡
13.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明构建出结合位点突变的质粒，且该质粒带有红色融合蛋白，用该质粒转染细胞，通过观察红色荧光可确定转染效率，且可直观地观察kindlin
‑
2与actin的共定位。由本发明衍生出的质粒可短期内在细胞中高表达，表现出明显的生物学效应，该基因表达后显著抑制了肿瘤细胞的生长、存活。
14.本发明创新性地运用计算机分子模拟计算预测出kindlin
‑
2的结构，且通过分析其与actin相互结合间的盐桥、化学键等，预测出最有可能的关键位点，并将该位点进行突变，显著抑制了肿瘤细胞的增殖，并促进了肿瘤细胞的凋亡，为临床上癌症的治疗提供了生物治疗基础。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
16.图1附图为本发明提供的kindlin
‑
2与actin的结合位点突变前后免疫共沉淀结果图；
17.图2附图为本发明提供的kindlin
‑
2与actin的结合位点突变前后免疫荧光实验结果图；
18.图3附图为本发明提供的kindlin
‑
2与actin的结合位点突变前后肿瘤细胞增殖能力图；
19.图4附图为本发明提供的kindlin
‑
2与actin的结合位点突变前后肿瘤细胞增殖能力图；
20.图5附图为本发明提供的kindlin
‑
2与actin的结合位点突变前后肿瘤细胞增殖能力图；
21.图6附图为本发明提供的kindlin
‑
2与actin的结合位点突变前后肿瘤细胞侵袭能力图；
22.图7附图为本发明提供的kindlin
‑
2与actin的结合位点突变前后肿瘤细胞侵袭能力图。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.本发明实施例提供了kindlin
‑
2与actin的结合位点在制备对抗肿瘤细胞中的应用。
25.实施例1
26.从ncbi上获取完整准确的kindlin
‑
2序列，根据前期计算机分子模拟的结果，找到关键位点，对其进行片段删除，通过pcr技术，获得kindlin
‑
2全长及kindlin
‑
2突变体的dna片段，经测序结果匹配无误后，通过分子克隆技术分别构建kindlin
‑
2—wt(k2)和kindlin
‑
2—mutation(k2m)的表达载体。
27.kindlin
‑
2全长序列如下：atggctctggacgggataaggatgccagatggctgctacgcggacgggacgtgggaactgagcgtccatgtcacggacctgaaccgtgatgtcactctgagagtgaccggggaggtgcacatcggaggggtgatgctgaagttggtggaaaaactcgatgtcaaaaaagattggtcggaccatgctctctggtgggaaaagaagaggacttggctgcttaagacacactggaccttggataagtgtggcatccaggcagatgccaagctccagttcaccccgcagcacaaactgctccgcctgcagcttcccaacatgaagtatgtgaaggtgaaagtgaacttctctgaccgagtcttcaaggctgtgtctgacatctgcaagactttcaatataagacaccctgaagaactttctctcttaaaaaaacccagagatcccacaaagaaaaaaaagaaaaagctagatgaccagtctgaagacgaagcgcttgagctggaaggacctcttatcatgcctggatcaggcaccgatgttctttacattggccctctgaaaggaagcatatattcaagcccgggactttatagtaaaacaatgacccctacttacgacgctcatgatggaagccctttgtcaccaacttctgcctggtttggtgacagtgccctgtcagaaggcaatcctgggatacttgctgtcagtcagccagtaacatcaccagaaatactggcaaaaatgttcaagcctcaagctcttcttgataaagcaaaaaccaaccaagggtggctagattcctcaagatctctcatggagcaagatgtgaaggagaacgaggccttgctgctccgattcaagtactacagcttttttgatttgaatccaaagtatgatgccatcagaatcaatcagctttacgagcaggccaagtgggctcttctcctagaagagatcgaatgcacggaagaagagatgatgatgttcgcagccttgcagtatcatatcaataagctgtcaatcatgacatcagaaaatcatttaaacaacagtgacaaagaagttgatgaagttgacgctgccctttctgacctggagatcactttggaaggcgggaaaacatcaacaattctgggtgacattacttcaatcccagaacttgctgactatattaaagttttcaagccgaagaagctgactttaaaggggtacaagcagtactggtgcactttcaaagacacgtccatctcctgctacaagagccgagaagagtccagtggtacacctgctcatcagctgaacctcagaggatgtgaagttactccggatgtaaacatttcaggccagaaatttaacataaaactcctaattccggtagcagagggcatgaatgagatctggcttcgctgtgataacgagaagcagtacgcgcactggatggcagcttgcaggttagcctccaaaggcaagaccatggcagacagttcttacaacctggaagttcagaacattctttccttcctgaaaatgcagcatctgaacccagacccccagctgatccctgaccagatcacaaccgacgtcaaccccgagtgtctggtgtccccgcggtacctgaagaagtataagagcaaacagataacagcacggatcttggaggcccatcaaaatgtagcccagatgagcctgattgaagccaagatgagattcattcaagcctggcagtctctgcctgagttcggcatcacacacttcattgcgaggtttcaaggcggcaagagagaagaacttattggaattgcatacaacaggttgattcggatggacgccagcacaggtgacgccatcaaaacctggcggttcagcaacatgaagcagtggaatgtcaactgggagatcaagatggtcactgtagagtttgcagatgaggtccggttgtccttcatctgtaccgaagtagactgcaaggtggtccacgaattcattggtggttacatatttctctcaactcgtgcgaaagaccaa
aatgaaagtttagatgaggagatgttctacaaactcaccagtggttgggtgtga；如seq id no.2所示；
28.kindlin
‑
2第608
‑
680位氨基酸缺失的突变体序列如下：atggctctggacgggataaggatgccagatggctgctacgcggacgggacgtgggaactgagcgtccatgtcacggacctgaaccgtgatgtcactctgagagtgaccggggaggtgcacatcggaggggtgatgctgaagttggtggaaaaactcgatgtcaaaaaagattggtcggaccatgctctctggtgggaaaagaagaggacttggctgcttaagacacactggaccttggataagtgtggcatccaggcagatgccaagctccagttcaccccgcagcacaaactgctccgcctgcagcttcccaacatgaagtatgtgaaggtgaaagtgaacttctctgaccgagtcttcaaggctgtgtctgacatctgcaagactttcaatataagacaccctgaagaactttctctcttaaaaaaacccagagatcccacaaagaaaaaaaagaaaaagctagatgaccagtctgaagacgaagcgcttgagctggaaggacctcttatcatgcctggatcaggaagcatatattcaagcccgggactttatagtaaaacaatgacccctacttacgacgctcatgatggaagccctttgtcaccaacttctgcctggtttggtgacagtgccctgtcagaaggcaatcctgggatacttgctgtcagtcagccagtaacatcaccagaaatactggcaaaaatgttcaagcctcaagctcttcttgataaagcaaaaaccaaccaagggtggctagattcctcaagatctctcatggagcaagatgtgaaggagaacgaggccttgctgctccgattcaagtactacagcttttttgatttgaatccaaagtatgatgccatcagaatcaatcagctttacgagcaggccaagtgggctcttctcctagaagagatcgaatgcacggaagaagagatgatgatgttcgcagccttgcagtatcatatcaataagctgtcaatcatgacatcagaaaatcatttaaacaacagtgacaaagaagttgatgaagttgacgctgccctttctgacctggagatcactttggaaggcgggaaaacatcaacaattctgggtgacattacttcaatcccagaacttgctgactatattaaagttttcaagccgaagaagctgactttaaaggggtacaagcagtactggtgcactttcaaagacacgtccatctcctgctacaagagccgagaagagtccagtggtacacctgctcatcagctgaacctcagaggatgtgaagttactccggatgtaaacatttcaggccagaaatttaacataaaactcctaattccggtagcagagggcatgaatgagatctggcttcgctgtgataacgagaagcagtacgcgcactggatggcagcttgcaggttagcctccaaaggcaagaccatggcagacagttcttacaacctggaagttcagaacattctttccttcctgaaaatgcagcatctgaacccagacccccagctgatccctgaccagatcacaaccgacgtcaaccccgagtgtctggtgtccccgcggtacctgaagaagtataagagcaaacagataacagcacggatcttggaggcccatcaaaatgtagcccagatgagcctgattgaagccaagatgagattcattcaagcctggcagtctctgcctgagttcggcatcacacacttcattgcgaggtttcaaggcggcaagagagaagaacttattggaattgcatacaacaggttgattcggatggacgccagcacaggtgacgccatcaaaacctgg；如seq id no.3所示。
29.细胞培养
30.(1)细胞培养条件：hela细胞用含有10％fbs和1％青霉素和链霉素的dmem培养液培养。hct116细胞用含有10％fbs和1％青霉素和链霉素的mccoy’s 5a培养液培养。所有细胞均置于37℃，体积分数为5％的co2的无菌培养环境中进行培养。
31.(2)细胞换液：预热培养基、pbs至室温，将培养皿置于超净台内，弃去原培养基，加入2ml pbs，轻轻晃动培养皿后弃去pbs清洗一次，加入8ml新鲜培养基于直径为100mm的培养皿中，放入培养箱中继续培养。每种细胞单独换液以避免细胞之间的交叉污染。
32.(3)细胞传代：当细胞融合度至80％—90％时，预热培养基、pbs和胰酶至室温，弃去原培养基，加入2ml pbs清洗一遍，在加入1ml 0.05％的胰酶，轻轻晃动培养皿使胰酶均匀覆盖至全部细胞后，室温消化至细胞呈圆形白色亮点，加入2ml培养基终止消化。放入低速离心机，1000rpm/min离心3min后，弃去上清，加入3ml新鲜培养基重悬细胞，按照1:4的比例传代，放入培养箱中培养。每种细胞单独进行传代以避免细胞之间的交叉污染。
33.(4)细胞复苏：预热水浴锅至37℃以及培养基至室温。从
‑
80℃冰箱中取出冻存的
细胞，迅速放入水浴锅中，快速晃动直至融化。加入新鲜培养基，吹打混匀后接种于含有4ml新鲜培养基的直径为60mm的培养皿内。混匀后放入培养箱内培养。
34.(5)细胞冻存：收集消化的细胞，1000rpm/min离心3min后，弃去上清，用提前配置的含有50％fbs+40％新鲜培养基+10％dmso的混合液重悬细胞，混匀后加入冻存管中，在冻存管上标记冻存日期、细胞名称和细胞代数，细胞冻存于
‑
80℃冰箱内，一周内转移至液氮罐中长期保存。
35.(6)细胞计数：取适量消化重悬后的细胞至血球计数板，显微镜下计数，计算出每毫升细胞数目。
36.质粒转染
37.取细胞融合度为80％，处于对数生长期的hela/hct116细胞进行消化，加入2ml无双抗培养基终止消化。以直径60mm的培养皿为例，接种细胞至密度为30％—40％左右，当细胞贴壁后，进行转染。转染方法为：
①
各取250ul opti
‑
mem至两个1.5ml离心管中；
②
其中一管加入9ul转染试剂pei与opti
‑
mem混合成转染复合物a液，室温静置5分钟；
③
另一管加入3ug的质粒与opti
‑
mem混合成转染复合物b液，与a液充分混匀后，室温静置15分钟；
④
将混合液加入培养皿中；
⑤
将培养皿放入培养箱培养24h，弃去含有转染复合物的培养基，换入正常含双抗的新鲜培养基继续培养细胞。不同规格的培养皿/板按照培养皿/板的面积成倍增加或减少质粒以及转染试剂pei的用量。
38.过表达载体的构建
39.利用限制性内切酶bamh i/xho i对载体pcs2(+)进行酶切，获得线性化载体。pcr扩增制备目的基因片段k2/k2m，使得扩增产物5’和3’最末端的序列完全一致。其中，引物序列如下：
40.k2
‑
f:5
’‑
tatggatcccgagctcgaatggactacaaggacgacgacgacgacaagatggctctggacgggata aggatg，如seq id no.3所示；
41.k2
‑
r：5
’‑
tatctcgaggtcgactcacacccaaccactggtgagtttg，如seq id no.4所示；
42.k2m
‑
f:5
’‑
tatggatcccgagctcgaatggactacaaggacgacgacgac，如seq id no.5所示；
43.k2m
‑
r:5
’‑
tatctcgaggtcgacttaccaggttttgatggcgtcacc，如seq id no.6所示；
44.以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现线性化载体和目的基因片段的体外环化。重组产物直接转入感受态细菌，随后挑取平板上的单克隆进行酶切鉴定，对阳性克隆进行测序及结果分析。将正确克隆菌液扩大培养，用天根无内毒素大提试剂盒抽提，获得高纯度质粒k2/k2m，用于下一步实验的质粒转染。
45.实施例2
46.为了明确kindlin
‑
2与actin可相互作用，且发现的突变位点可影响二者的相互作用，采取下述实验：
47.采用co
‑
ip(免疫共沉淀)方法予以验证，实施方案具体如下：
48.①
取20ul protein
‑
g/a beads于低吸附的1.5ml离心管中，用pbs洗两遍后，再用lysisbuffer清洗一遍；
49.②
加入anti
‑
flag 2ul，10％bsa 10ul,lysis buffer 18ul，混匀后，在静音混合器上孵育磁珠过夜；
50.③
在含有磁珠的离心管中加入提取出的蛋白样品，放入静音混合器中混合孵育4小时；
51.④
将离心管放置在磁力架上，待磁珠完全被吸附之后，去除管内的蛋白抗体混合液，用lysis buffer清洗三遍后，加入用lysis buffer稀释好的1xloadingbuffer40ul，95℃加热5分钟；
52.⑤
通过westernblot的方法进行验证；结果见图1；证明kindlin2
‑
wt与actin可相互结合，而本发明可使上述结合作用被破坏；
53.为了验证kindlin
‑
2与actin相互作用，且存在共定位，而本发明所提出的突变位点抑制这一效应，采取免疫荧光的实验方法予以验证。该方案的具体实施如下：
①
爬片：在12孔板中放入合适数量的玻片；
②
种样：将对数生长期的hela细胞消化后，按照每孔30％的密度接种至孔板，用无双抗的培养基，在培养箱培养24h；
③
转染：待细胞贴壁后，按照质粒转染的方法处理细胞；
④
转染后24h弃去旧培养基，用完全培养基继续培养24h；
⑤
将孔板从培养箱中取出，弃去培养基，pbs清洗三遍，用4％的多聚甲醛固定10min，弃去，pbs清洗三遍；
⑥
0.5％的pbst处理10分钟破膜打孔，结束后pbs清洗三遍；
⑦
用10％的bsa封闭1h；
⑧
用2％bsa配置的一抗孵育，4℃过夜；
⑨
0.1％的pbst清洗三遍，用2％bsa配置的荧光二抗孵育1.5h；
⑩
0.1％的pbst清洗三遍，鬼笔环肽孵育15min后，0.1％pbst清洗三遍，用dapi
‑
prolong封片，室温避光晾干后，在荧光显微镜下观察。
54.结果见图2，可知，kindlin2
‑
wt与actin共定位，而本发明的突变位点会使共定位大幅减弱。
55.细胞生物学效应
56.细胞生物学效实验采用hela、hct116细胞进行，对上述细胞进行过表达k2/k2m转染，实验分组为con，oek2和oek2m组，过程如下：
57.(1)cck
‑
8实验：对细胞进行转染48h后，取对数生长期的细胞消化，按照hela细胞1x103个/孔的密度接种于96孔板，每孔100ul培养基。96孔板四周每孔加入100ul pbs以防过度挥发影响细胞生长，轻震孔板后放入培养箱培养。24h后，取出96孔板，弃去原有培养基，每孔加入10ul cck
‑
8试剂和100ul培养基，放入培养箱后，分别在培养箱孵育30min、1h、2h、3h后，使用酶标仪在450nm及630nm处检测每孔的吸光度值。细胞相对活力＝(a处理/450
‑
a处理/630)/(a对照/450
‑
a对照/630)。其中，450nm为cck
‑
8试剂最大吸收波长，630nm为cck
‑
8试剂最小吸收波长；结果见图3；由图3可知，kindlin2
‑
wt可在一定程度上促进肿瘤细胞的增殖，而kindlin2
‑
m则对肿瘤细胞的增殖起抑制作用。说明结合位点可有效抑制肿瘤细胞的增殖。
58.(2)细胞增殖实验：对细胞进行转染48h后，取对数生长期的细胞消化后，按照hela细胞200个/孔的密度接种于6孔板中，每孔2ml培养基。放入培养箱中进行培养，14天后取出孔板，吸弃培养基，pbs清洗三遍，用70％的乙醇固定细胞10
‑
15min，弃去乙醇，继续用结晶紫染色15
‑
20min后，弃去结晶紫，流水清洗孔板至无紫色出现，倒扣孔板，室温干燥。统计细胞群落数目，细胞增殖比例＝着色的细胞群落数/200；结果见图4和图5，证明该结合位点可有效抑制细胞的增殖能力，抑制肿瘤细胞生长。
59.(3)细胞迁移实验：取对数生长期的细胞消化，按照每孔30％的密度接种于12孔板中，每孔1ml无双抗培养基，放入培养箱培养24h后，弃去旧培养基，按照质粒转染方法，分别
处理细胞，转染24h后，弃去旧培养基，每孔加入1ml含有1％fbs的含双抗培养基饥饿24h，后用200ul的枪头在12孔板底部划一道笔直的无细胞区域，并用显微镜拍摄划痕区域，每孔拍摄4个视野，放入培养箱继续培养。细胞每隔24h进行拍摄并换液，直至细胞划痕区域接近愈合。划痕区域的宽度用imagej进行统计。细胞迁移率(％)＝(不同时间点的划痕宽度
‑
初始划痕宽度)/初始划痕宽度
×
100％；结果见图6和图7，表面结合位点的突变表现出明显的生长抑制，而且侵袭能力也受到明显影响。
60.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
61.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。