一种鉴别罗氏鼢鼠的试剂盒及方法

1.本发明属于鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别罗氏鼢鼠的试剂盒及方法。


背景技术：

2.鼢鼠是鼢鼠亚科(myospalacinae)动物的统称，主要分布于中国和西伯利亚南部地区。现存鼢鼠包括凸颅鼢鼠属(eospalax)和平颅鼢鼠属(myspalax)，我国几乎分布了所有现生鼢鼠物种。平颅鼢鼠包括草原鼢鼠(m.aspalax)和东北鼢鼠(m.psilurus)等2
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3个物种，凸颅鼢鼠属只分布在我国，包括中华鼢鼠(e.fontanieri)、斯氏鼢鼠(e.smithi)、罗氏鼢鼠(e.rothschildi)、高原鼢鼠(e.baileyi)、甘肃鼢鼠(e.cansus)和秦岭鼢鼠(e.rufescens)等6个物种。
3.罗氏鼢鼠主要分布在我国的湖北、四川东部以及陕西南部。罗氏鼢鼠主要栖息在海拔1500米以上的华山松幼林地、苗圃地、农耕地及草地下，拱洞筑巢，营地下生活。罗氏鼢鼠成鼠体长150
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215毫米，体重114
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365克。体粗壮呈圆筒形，毛细而密，夏毛基部灰黑色，毛尖黄色，成体呈棕黄色或锈红色，由体侧至腹部毛色渐淡。有的整个体背及两侧均为明显的锈红色，腹部均为灰黑色，在毛尖部分稍带锈红色。头宽而扁，鼻尖平钝，下唇毛色乳白，多数额部中央有明显的白色毛斑，眼极小，耳壳不发达，常被覆于绒毛之下。四肢短而粗壮，并具尖锐的爪，前足爪较后足爪发达，向外弯曲呈镰刀状。尾短小，被短毛，端部白色。
4.鼢鼠几乎终生都生活在密闭的地下洞道系统中，独特的地下生活方式使得其在觅食、婚配、繁殖等多方面具有特殊性，引起了科学家的广泛兴趣。识别鉴定生物种类是认识和保护生物多样性的基础，每种生物只有能够被准确识别后，才能开展更多领域的研究。但是由于不同鼢鼠生活环境相似而形态趋同，未经专业训练通过形态进行物种准确鉴定非常困难。
5.因此，研究一种能够快速、准确进行罗氏鼢鼠物种鉴定的方法与试剂，具有非常重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种能够简便、准确鉴定罗氏鼢鼠物种的试剂盒和方法，解决通过形态进行鼢鼠物种鉴定的难题。
7.本发明提供了一种鉴别罗氏鼢鼠的试剂盒，所述试剂盒包括检测待检物种的16s rrna基因中的如下snp位点的试剂：seq id no:3所示保守motif序列的第34位。
8.进一步地，所述snp位点的碱基如下：seq id no:3所示保守motif序列的第34位碱基为a。
9.进一步地，所述试剂为测序用试剂、kasp方法用试剂或限制性片段长度多态性方法用试剂。
10.进一步地，所述试剂盒还包括扩增16s rrna基因保守motif序列的试剂；所述保守motif序列为seq id no:3所示的序列。
11.进一步地，所述扩增16s rrna基因保守motif序列的试剂包括seq id no:1～2所示的引物对。
12.本发明还提供了扩增16s rrna基因保守motif序列的试剂在制备鉴别罗氏鼢鼠的试剂盒中的用途，所述保守motif序列是seq id no:3所示的序列。
13.进一步地，所述扩增16s rrna基因保守motif序列的试剂包括seq id no:1～2所示的引物对。
14.本发明还提供了一种鉴别罗氏鼢鼠的方法，包括如下步骤：
15.(1)提取待检鼢鼠样本的基因组总dna；
16.(2)检测16s rrna基因序列中如下snp位点：seq id no:3所示保守motif序列第34位，分析即可。
17.进一步地，步骤(1)所述的样本为组织样本或血液样本；
18.和/或，步骤(2)所述检测的步骤如下：
19.1)以步骤(1)提取的dna为模板，利用扩增试剂进行pcr扩增得到扩增产物；
20.2)对步骤1)所得pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
21.3)对步骤2)的检测结果中在1640bp有明亮条带的pcr扩增产物进行测序，得到16s rrna基因序列；
22.4)对步骤3)得到的16s rrna基因序列中的如下snp位点进行分析：seq id no:3所示保守motif序列第34位；
23.进一步地，步骤1)所述扩增试剂包括seq id no:1～2所示的引物对；所述的pcr扩增的退火温度52～56℃；步骤3)所述测序为双向sanger测序。
24.进一步地，步骤(2)所述分析方法为：若所述snp位点的碱基如下，则待检鼢鼠为罗氏鼢鼠：seq id no:3所示保守motif序列的第34位碱基为a。
25.本发明的有益效果：
26.本发明首次发现16s rrna基因中存在1个罗氏鼢鼠物种特异性snp基因型，检测到该特异的snp基因型即可判定待检测鼢鼠为罗氏鼢鼠，对测序长度要求低，判定结果准确可靠。
27.本发明的关键点在于发现了鼢鼠16s rrna基因片段保守motif序列中的1个snp位点与罗氏鼢鼠物种的关系，在此基础上，能够检测上述snp位点的碱基的任何试剂或设备，都可以用于进行罗氏鼢鼠的物种鉴定。
28.具体地，本发明实施例提供了采用测序的方式检测snp位点的实例。本发明提供的引物对特异性良好，利用其进行pcr，不与目标以外的dna片段产生非特异扩增；扩增目的基因为线粒体单拷贝基因，不需要克隆，可以直接用于测序，方法简单。本发明还提供了1段罗氏鼢鼠物种保守motif序列，可辅助确定罗氏鼢鼠物种特异性snp位点在16s rrna基因片段(dna条形码)中的位置，便于所述snp位点基因型的确定。
29.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
30.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
31.图1、实施例3中编号为zbx
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4的鼢鼠16s rrna基因pcr产物测序峰图(motif序列)。
32.图2、实施例3中编号为ld
‑
3的鼢鼠16s rrna基因pcr产物测序峰图(motif所在位置序列)。
具体实施方式
33.为了更清楚地理解本发明，现参照以下实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。
34.实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商建议的条件；实施例中所用到的各种化学试剂均可以商购获得，所用引物委托合成。
35.实施例1、本发明鉴别罗氏鼢鼠的试剂盒
36.本发明试剂盒的组分包括：
37.(1)pcr扩增试剂：包含seq no:1～2的引物对；(2)测序用试剂。
38.实施例2、pcr引物设计与snp位点的验证
39.本发明对8个鼢鼠物种121个鼢鼠个体的线粒体基因组序列进行比对，发现16s rrna基因存在1个罗氏鼢鼠物种特异性snp基因型，在这个snp位点两端存在保守序列，从而确定16s rrna基因片段为罗氏鼢鼠物种鉴定dna条形码。
40.8个鼢鼠物种121个鼢鼠个体：其中草原鼢鼠12个、东北鼢鼠10个、中华鼢鼠15个、斯氏鼢鼠18个、罗氏鼢鼠16个、高原鼢鼠14个、甘肃鼢鼠24个、秦岭鼢鼠12个。
41.将16s rrna基因序列，在保守区设计引物如下：
42.me16s
‑
1l：agaggagataagtcgtaacaaggt(seq id no:1)；
43.me16s
‑
1r：tcctgatccaacatcgaggt(seq id no:2)。
44.使用上述引物对不同鼢鼠物种的dna样本进行扩增，确认用于罗氏鼢鼠物种鉴定的16s rrna基因的以下snp位点：
45.罗氏鼢鼠扩增产物第391个碱基(即seq id no:3保守motif序列的第34位碱基)基因型为a，其他鼢鼠物种该位点基因型为t/c。
46.seq id no:3序列为：cccgaaaccaaacgagctacctaagaacaatttat。
47.结果证明，上述特定的snp位点的碱基在罗氏鼢鼠与其他鼢鼠不同，可以通过检测这个特定的snp位点来鉴别罗氏鼢鼠。
48.实施例3、罗氏鼢鼠物种鉴别
49.首先合成16s rrna引物对：
50.me16s
‑
1l：agaggagataagtcgtaacaaggt(seq id no:1)；
51.me16s
‑
1r：tcctgatccaacatcgaggt(seq id no:2)。
52.采用如下方法进行鉴别：
53.a)利用凯杰dneasy blood&tissue kit试剂盒，分别提取编号为zbx
‑
4的鼢鼠肌肉组织的基因组总dna、编号为dll
‑
5的鼢鼠肝脏组织的基因组总dna、编号为ld
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3的鼢鼠肝脏组织的基因组总dna；
54.b)以步骤a)所述的基因组总dna为模板，利用所述16s rrna引物对进行pcr反应，
编号为zbx
‑
4的鼢鼠组反应体系50μl，退火温度52℃；编号为dll
‑
5的鼢鼠组反应体系25μl，退火温度56℃；编号为ld
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3的鼢鼠反应体系25μl，退火温度55℃；
55.c)对步骤b)所得pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，观察到1460bp左右的明亮条带；
56.d)对步骤c)的pcr产物进行双向sanger测序，获得16s rrna基因测序峰图；
57.e)在所得测序峰图中找到seq id no:3的保守motif序列，分析snp位点碱基。
58.结果如下：
59.(1)编号为zbx
‑
4的鼢鼠：
60.seq id no:3的序列中第34位碱基为a(图1)，即判断编号zbx
‑
4的鼢鼠为罗氏鼢鼠。
61.(2)编号为dll
‑
5的鼢鼠：
62.seq id no:3的序列中第34位碱基为a，即判断编号dll
‑
5的鼢鼠为罗氏鼢鼠。
63.(3)编号为ld
‑
3的鼢鼠：
64.seq id no:3的序列中第34位碱基为t，不为a(图2)，即判断编号ld
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3的鼢鼠不是罗氏鼢鼠。
65.另外，通过传统形态鉴定方式，对编号为zbx
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4、dll
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5和ld
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3的鼢鼠进行鉴别。
66.zbx
‑
4和dll
‑
5个体体型小，前爪明显纤弱，鼻垫僧帽状，尾被密毛；头骨脑颅枕部隆起，颧弓扩展，顶嵴平行，不在中缝处靠近，在额部内折靠近，向前与发达的眶上嵴联合，门齿孔被前颌骨和上颌骨包围，证实了编号zbx
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4、dll
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5的鼢鼠为罗氏鼢鼠。
67.而ld
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3个体体型大，鼻垫椭圆形，尾较长，被稀白毛；头骨脑颅枕部隆起，颧弓扩展，顶嵴平行，在额部内折靠近，与发达的眶上嵴联合，枕中嵴发达，门齿孔被前颌骨和上颌骨包围，第三上臼齿(m3)不具后伸叶，表明它是甘肃鼢鼠，不是罗氏鼢鼠。
68.上述实验结果说明，本发明鉴别罗氏鼢鼠的方法准确，可以实际用于进行罗氏鼢鼠物种的鉴别检测。
69.综上，本发明提供了一种简便、准确鉴定罗氏鼢鼠物种的试剂盒以及鉴定罗氏鼢鼠的方法，解决了通过形态进行鼢鼠物种鉴定的难题，在鼢鼠的物种鉴别中具有优异的应用前景。