一种鉴别中华鼢鼠的试剂盒及方法

1.本发明属于鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别中华鼢鼠的试剂盒及方法。


背景技术：

2.鼢鼠是鼢鼠亚科(myospalacinae)动物的统称，是一种适应地下生活的啮齿类动物。鼢鼠体型粗壮、圆柱形，头宽扁，头部具有触须，鼻端平钝，有裸露鼻垫，尾及四肢短，眼睛极小，视力差，几乎被毛所隐盖，耳廓退化，隐于毛下。鼢鼠主要分布于我国，也见于蒙古和西伯利亚，栖息于森林边缘、草原和农田，白天居住在地洞中，晚上偶尔会到地面活动，以植物的根、茎、种子为食，在洞穴中储存大量食物。鼢鼠挖洞速度极快，洞穴系统复杂，分支多，平时地面没有明显出口，但附近有不规则的土堆。
3.现存鼢鼠包括凸颅鼢鼠属(eospalax)和平颅鼢鼠属(myspalax)，平颅鼢鼠属内物种较少，目前普遍认为平颅鼢鼠属下有3个物种，即草原鼢鼠(m.aspalax)、阿尔泰鼢鼠(m.myospalax)和东北鼢鼠(m.psilurus)；凸颅鼢鼠属下有6个物种：中华鼢鼠(e.fontanieri)、甘肃鼢鼠(e.cansus)、秦岭鼢鼠(e.rufescens)、罗氏鼢鼠(e.rothschildi)、斯氏鼢鼠(e.smithi)和高原鼢鼠(e.baileyi)。鼢鼠几乎终生都生活在密闭的地下洞道系统中，独特的地下生活方式使得其在觅食、婚配、繁殖等多方面具有特殊性，引起了科学家的广泛兴趣。
4.识别鉴定生物种类是认识和保护生物多样性的基础，每种生物只有能够被准确识别后，才能开展更多领域的研究。但是由于不同鼢鼠生活环境相似而形态趋同，未经专业训练通过形态进行物种准确鉴定非常困难。
5.因此，研究一种能够快速、准确进行中华鼢鼠物种鉴定的方法与试剂，具有非常重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种能够简便、准确鉴定中华鼢鼠物种的试剂盒和方法，解决通过形态进行鼢鼠物种鉴定的难题。
7.本发明提供了一种鉴别中华鼢鼠的试剂盒，它包括检测待检物种的如下3个snp位点中任意一个或多个的试剂：
8.12s rrna基因中的seq id no:5所示保守motif序列的第37位，seq id no:6所示保守motif序列的第23位；
9.16s rrna基因中的seq id no:7所示保守motif序列的第18位。
10.进一步地，上述试剂是同时检测所述3个snp位点的试剂；
11.更进一步地，上述snp位点的碱基如下：
12.12s rrna基因中的seq id no:5所示保守motif序列的第37位为a，seq id no:6所示保守motif序列的第23位为t；
13.16s rrna基因中的seq id no:7所示保守motif序列的第18位为t。
14.经过发明人研究发现，本技术前述3个snp位点通常是同时存在，即当seq id no:5所示保守motif序列的第37位碱基为a时，seq id no:6所示保守motif序列的第23位碱基为t、seq id no:7所示保守motif序列的第18位碱基为t。进一步的实验还发现，只有中华鼢鼠的基因组具有前述3个snp位点，因而通过检测前述3个snp中的任意一个或者任意多个位点，即可鉴别待检物种是否为中华鼢鼠。
15.进一步地，上述试剂为：测序用试剂、kasp方法用试剂或限制性片段长度多态性方法用试剂。
16.更进一步地，上述试剂盒还包括扩增12s rrna基因和/或16s rrna基因保守motif序列的试剂；所述保守motif序列为seq id no:5～7所示的任意一个或多个序列。
17.进一步地，上述扩增12s rrna基因保守motif序列的试剂包括seq id no:1～2所示的引物对；所述扩增16s rrna基因保守motif序列的试剂包括seq id no:3～4所示的引物对。
18.本发明还提供了扩增12s rrna基因和/或16s rrna基因保守motif序列的试剂在鉴别中华鼢鼠的试剂盒中的用途，所述保守motif序列是seq id no:5～7所示的任意一个或多个序列；
19.优选地，所述试剂包括seq id no:1～2所示的引物对和/或seq id no:3～4所示的引物对。
20.本发明还提供了一种鉴别中华鼢鼠的方法，包括如下步骤：
21.(1)提取待检鼢鼠样本的基因组总dna；
22.(2)检测如下3个snp位点中任意一个或多个，分析即可：
23.12s rrna基因中的seq id no:5所示保守motif序列的第37位，seq id no:6所示保守motif序列的第23位；
24.16s rrna基因中的seq id no:7所示保守motif序列的第18位。
25.优选的，步骤(1)所述的样本为组织样本、血液样本或粪便样本。
26.进一步地，上述步骤(2)所述检测的步骤如下：
27.1)以步骤(1)提取的dna为模板，利用扩增试剂进行pcr扩增得到扩增产物；
28.2)对步骤1)所得pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
29.3)对步骤2)的检测结果中在490bp有明亮条带的12s rrna基因pcr扩增产物和/或1450bp左右的明亮条带的16s rrna基因pcr扩增产物进行测序，得到12s rrna和/或16s rrna基因序列；
30.4)对步骤3)得到的12s rrna基因序列和/或16s rrna基因序列中的如下3个snp位点中的一个或多个进行分析：12s rrna基因序列中的seq id no:5所示保守motif序列的第37位，seq id no:6所示保守motif序列的第23位；16s rrna基因序列中的seq id no:7所示保守motif序列的第18位；
31.优选地，步骤1)所述扩增试剂包括seq id no:1～2所示的引物对和/或seq id no:3～4所示的引物；所述的pcr扩增的退火温度52～56℃；步骤3)所述测序为双向sanger测序。
32.更进一步地，上步骤(2)所述检测是同时检测所述3个snp位点；
33.更进一步地，上述snp位点的碱基如下，则待检鼢鼠为中华鼢鼠：
34.12s rrna基因中的seq id no:5所示保守motif序列的第37位为a，seq id no:6所示保守motif序列的第23位为t；
35.16s rrna基因中的seq id no:7所示保守motif序列的第18位为t。
36.本发明的有益效果：
37.首先，本发明提供的3个中华鼢鼠特异的snp基因型在12s rrna基因和16s rrna片段(dna条形码)中同时出现，检测到其中1个或多个均可判定待检测鼢鼠为中华鼢鼠，对测序长度要求低。本发明应用3个具有中华鼢鼠特异性基因型的snp位点进行鼢鼠物种鉴定，所述snp位点间可以互相印证，结果更加准确可靠。
38.本发明的关键点在于发现了鼢鼠12s rrna和16s rrna基因片段保守motif序列中的3个snp位点与中华鼢鼠物种的关系，在此基础上，能够检测上述任意一个或者任意多个snp位点的碱基的任何试剂或设备，都可以用于进行中华鼢鼠的物种鉴定。
39.具体地，本发明实施例提供了采用测序的方式检测snp位点的实例。本发明引物对特异性良好，利用其进行pcr，不与目标以外的dna片段产生非特异扩增；扩增目的基因为线粒体单拷贝基因，不需要克隆，可以直接用于测序，方法简单。本发明还提供了3段中华鼢鼠物种保守motif序列，可辅助确定中华鼢鼠物种特异性snp位点在12s rrna和16s rrna基因片段(dna条形码)中的位置，便于所述snp位点基因型的确定。
40.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
41.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
42.图1、实施例5中编号为zyx
‑
4的鼢鼠12s rrna基因pcr产物测序峰图(第一段motif序列)。
43.图2、实施例5中编号为zyx
‑
4的鼢鼠12s rrna基因pcr产物测序峰图(第二段motif序列)。
44.图3、实施例5中编号为zyx
‑
4的鼢鼠16s rrna基因pcr产物测序峰图(第三段motif的反向互补序列)。
45.图4、实施例5中编号为dll
‑
5的鼢鼠12s rrna基因pcr产物测序峰图(第一段motif所在位置序列)。
46.图5、实施例5中编号为dll
‑
5的鼢鼠12s rrna基因pcr产物测序峰图(第二段motif所在位置序列)。
47.图6、实施例5中编号为dll
‑
5的鼢鼠引物对16s rrna基因pcr产物测序峰图(第三段motif所在位置序列的反向互补序列)。
具体实施方式
48.为了更清楚地理解本发明，现参照以下实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。
49.实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商建议的条件；实施例中所用到的各种化学试剂均可以商购获得，所用引物委托合成。
50.实施例1、本发明鉴别中华鼢鼠的试剂盒
51.本发明试剂盒的组分包括：
52.(1)pcr扩增试剂：包含seq no:1～2的引物对；(2)测序用试剂。
53.实施例2、本发明鉴别中华鼢鼠的试剂盒
54.本发明试剂盒的组分包括：
55.(1)pcr扩增试剂：包含seq no:3～4的引物对；(2)测序用试剂。
56.实施例3、本发明鉴别中华鼢鼠的试剂盒
57.本发明试剂盒的组分包括：
58.(1)pcr扩增试剂：包含seq no:1～2和seq no:3～4的引物对；(2)测序用试剂。
59.实施例4、pcr引物设计与snp位点的验证
60.发明人对8个鼢鼠物种121个鼢鼠个体的线粒体基因组序列进行比对，发现12s rrna基因存在2个中华鼢鼠物种特异性snp基因型，16s rrna基因存在1个中华鼢鼠物种特异性snp基因型，在snp位点的两端经过比对，发现存在保守序列，从而确定12s rrna和16s rrna基因片段为中华鼢鼠物种鉴定dna条形码。
61.8个鼢鼠物种121个鼢鼠个体：草原鼢鼠12个、东北鼢鼠10个、中华鼢鼠15个、斯氏鼢鼠18个、罗氏鼢鼠16个、高原鼢鼠14个、甘肃鼢鼠24个、秦岭鼢鼠12个。
62.将12s rrna和16s rrna及附近基因序列，在保守区设计引物如下：
63.me12s
‑
1l：agcactgaaaatgcttagatgg(seq id no:1)；
64.me12s
‑
1r：cggctaagcatagtggggta(seq id no:2)。
65.me16s
‑
1l：agaggagataagtcgtaacaaggt(seq id no:3)
66.me16s
‑
1r：tcctgatccaacatcgaggt(seq id no:4)
67.使用上述引物对不同鼢鼠物种的dna样本进行扩增，确认用于中华鼢鼠物种鉴定的12s rrna基因和的16s rrna基因的3个snp位点：
68.1)中华鼢鼠12s rrna基因扩增产物第307个碱基(seq id no:5保守motif序列的第37位碱基)基因型为a，其他鼢鼠物种该位点基因型为g；
69.2)中华鼢鼠12s rrna基因扩增产物第347个碱基(seq id no:6保守motif序列的第23位碱基)基因型为t，其他鼢鼠物种该位点基因型为a或g；
70.3)中华鼢鼠16s rrna基因扩增产物第1304个碱基(seq id no:7保守motif序列的第18位碱基)基因型为t，其他鼢鼠物种该位点基因型为c。
71.实施例5、中华鼢鼠物种鉴别
72.首先合成12s rrna基因片段引物对(seq id no:1和seq id no:2)和16s rrna基因片段引物对(seq id no:3和seq id no:4)。
73.采用如下方法进行鉴别：
74.a)利用凯杰dneasy blood&tissue kit试剂盒，分别提取编号为jx
‑
5的鼢鼠肌肉组织的基因组总dna、编号为zyx
‑
4的鼢鼠肌肉组织的基因组总dna、编号为dll
‑
5的鼢鼠肝脏组织的基因组总dna；
75.b)以步骤a)所述的编号为zyx
‑
4和dll
‑
5的基因组总dna为模板，利用所述12s rrna引物对和16s rrna引物对分别进行pcr反应，jx
‑
5反应体系25μl，退火温度56℃；dll
‑
5反应体系25μl，退火温度55℃；以步骤a)所述的编号为jx
‑
5的基因组总dna为模板，利用所述12s rrna引物对进行pcr反应，反应体系25μl，退火温度52℃；
76.c)对步骤b)所得pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，观察到490bp左右和1450bp的明亮条带；
77.d)对步骤c)的pcr产物分别进行双向sanger测序，获得12s rrna基因和16s rrna基因测序峰图；
78.e)在所得测序峰图中找到seq id no:5～7的保守motif序列，分析snp位点碱基。
79.结果如下：
80.(1)zyx
‑
4鼢鼠：seq id no:5的序列中第37位碱基为a(图1)；seq id no:6所示的序列中第23位碱基为t(图2)；seq id no:7所示的序列中第18位碱基为t(图3)。
81.即判断编号zyx
‑
4的样本为中华鼢鼠。
82.(2)jx
‑
5鼢鼠：seq id no:5的序列中第37位碱基为a。
83.即判断编号jx
‑
5的样本为中华鼢鼠。
84.(3)dll
‑
5鼢鼠：seq id no:5的序列中第37位碱基不为a(图4)；seq id no:6所示的序列中第23位碱基不为t(图5)；seq id no:7所示的序列中第18位碱基不为t(图6)。
85.即判断编号dll
‑
5的样本不是中华鼢鼠。
86.另外，通过传统形态鉴定方式，对编号为jx
‑
5、zyx
‑
4和dll
‑
5的鼢鼠进行鉴别。
87.jx
‑
5和zyx
‑
4个体体型大，额部具白斑，鼻垫椭圆，尾较长，裸露；头骨脑颅枕部隆起，鼻垫椭圆形，颧弓扩展程度低，颧弓最宽处位于偏后部，顶嵴平行，眶上嵴、枕中嵴不发达，门齿孔被前颌骨和上颌骨包围，第三上臼齿(m3)具后伸叶，这些特征中华鼢鼠相符，表明是中华鼢鼠。
88.而编号为dll
‑
5的个体体型小，前爪明显纤弱，鼻垫僧帽状，尾被密毛；头骨脑颅枕部隆起，颧弓扩展，顶嵴平行，不在中缝处靠近，在额部内折靠近，向前与发达的眶上嵴联合，门齿孔被前颌骨和上颌骨包围，这些特征都符合罗氏鼢鼠的形态鉴定特征，证实了编号为dll
‑
5的鼢鼠为罗氏鼢鼠，不为中华鼢鼠。
89.实验结果说明，本发明鉴别中华鼢鼠的方法准确，可以实际用于进行中华鼢鼠物种的鉴别检测。
90.综上，本发明提供了一种简便、准确鉴定中华鼢鼠物种的试剂盒以及鉴定中华鼢鼠的方法，解决了通过形态进行鼢鼠物种鉴定的难题，在鼢鼠的物种鉴别中具有优异的应用前景。