一种polβ抑制剂及其用途的制作方法

一种pol
β
抑制剂及其用途
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种polβ抑制剂及其用途。


背景技术：

2.替莫唑胺(tmz)是一种口服化疗药物，通过诱导dna损伤和破坏dna复制引起细胞死亡。临床研究显示，接受tmz治疗的患者有良好的耐受性和反应。然而，化疗的选择性低、副作用、全身毒性和癌细胞耐药性等缺点不容忽视。越来越多的研究表明，dna修复途径使肿瘤细胞能够在化疗药物诱导的dna损伤中存活。
3.tmz为咪唑并四嗪类具有抗肿瘤活性的烷化剂，在体循环生理ph状态下，迅速转化为活性产物mtic（3
‑
甲基
‑
(三嗪
‑1‑
)咪唑
‑4‑
甲酰胺），mtic通过n7(>70%)上鸟嘌呤的甲基化、o6原子(5%)和n3原子上腺嘌呤的甲基化(9.2%)引起癌细胞毒性。o6
‑
meg被o6
‑
甲基鸟嘌呤
‑
脱氧核糖核酸甲基转移酶修复(mgmt)。然而，mgmt的抑制剂如patrin没有显示出临床疗效。碱基切除修复(ber)途径修复tmz诱导的n7
‑
meg和n3
‑
mea损伤，并且ber途径的药物抑制可以增强tmz诱导的细胞毒性，而与mgmt状态无关。实际上，超过80%的tmz诱发的dna损伤是ber途径的底物。
4.ber被认为是哺乳动物细胞中消除小dna碱基损伤的主要dna修复途径。损伤的碱基残基被烷基腺嘌呤dna糖基化酶(aag)清除，aag是一种损伤特异性的dna糖基化酶。然后，由ape1（一种无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶）识别出一个基本碱基位点，切割受损链，在边缘留下5v脱氧核糖磷酸酯（5vdrp）和3v
‑
oh基团。dna聚合酶β(polβ)介导的dna合成步骤填补了单核苷酸缺口，polβ的5vdrp裂解酶活性清除了细胞毒性的5vdrp基因。最后，dna连接酶i或dna连接酶iii和xrcc1的复合物进行切口封闭步骤。
5.在缺乏polβ的情况下，由于ber中间体5vdrp未能修复，细胞表现出ber缺陷，因此对烷基化剂甲基磺酸甲酯过敏。因此，ber活性阻断正成为克服包括tmz在内的化疗药物耐药性的一种有吸引力的策略。抑制ber的关键限速酶polβ，如果与tmz和其他dna损伤药物联合使用，可能是治疗癌症的有效方法。
6.polβ由两个具有不同酶活性的结构域组成，分别称为聚合酶和裂解酶结构域，它们对dna上简单碱基损伤的修复至关重要。短片ber（short
‑
patch ber）中主要的间隙填充聚合酶是polβ，它纠正dna氧化、脱氨和烷基化引起的损伤。polβ缺陷细胞的活力或生长特性正常，但表现出对dna烷基化剂的敏感性增强。polβ被确定为介导肿瘤患者化疗耐药的分子之一。
7.抑制ber通路的活性是一种使癌细胞对dna损伤药物敏感的新策略。为了提高肿瘤治疗的疗效，需要高度特异性和更安全的基于结构的抑制剂。在过去的二十年里，已经发现了许多dna polβ的抑制剂。然而，由于缺乏潜在性或特异性，这些抑制剂大多不能被批准用于临床。因此，迫切需要开发新型的polβ抑制剂，以提高其临床应用水平。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种polβ抑制剂及其用途，以解决上述现有技术存在的问题，该方法利用噬菌体展示肽库技术筛选polβ抑制剂，并鉴定了一种新型的小分子肽抑制剂10d，实验表明，10d是一种潜在的靶向ber途径的小分子药物，对tmz治疗的癌细胞具有明显增敏作用。
9.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：本发明提供一种polβ抑制剂，为一种小分子多肽，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
10.本发明还提供如上述的polβ抑制剂在制备治疗和/或辅助治疗肿瘤药物中的用途。
11.本发明还提供一种治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物，包括有效剂量的如上述的polβ抑制剂。
12.本发明还提供如上述的polβ抑制剂用于制备肿瘤化疗药物敏感性促进剂的用途，所述polβ抑制剂用于提高肿瘤细胞或肿瘤对化疗药物的敏感性。
13.本发明还提供如上述的polβ抑制剂在制备肿瘤化疗药物耐药性逆转剂中的应用，所述polβ抑制剂用于降低肿瘤细胞或肿瘤对化疗药物的耐药性。
14.本发明还提供如上述的polβ抑制剂与肿瘤化疗药物联合用于制备肿瘤治疗药物的用途。
15.进一步地，所述化疗药物选自替莫唑胺。
16.进一步地，所述肿瘤为结直肠癌，尤其是脑转移性结直肠癌。
17.本发明还提供如上述的polβ抑制剂在制备ber通路抑制剂中的用途。
18.本发明公开了以下技术效果：噬菌体展示肽库作为一个重要的平台，为寻找适合药物开发的候选肽库提供了一种快速、高效和相对廉价的方法。本发明中使用的噬菌体展示肽库ph.d.
‑
12
tm
包含6.8
×
10
10
个克隆，而化学库只允许测定数百或数千个合成化合物。此外，噬菌体展示肽库具有体积小、血液清除快、亲和力和特异性高、稳定性好、易于生产、大规模生产成本低、组织渗透性好等优点。
19.polβ是研究烷基化试剂超敏性的靶点，在结直肠癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌和前列腺癌等多种肿瘤类型中均有过表达。过表达polβ的肿瘤细胞在用烷基化试剂处理时，会对polβ的阻断反应更强烈。因此，选择细胞系中polβ过表达的结直肠癌细胞系sw480。
20.结直肠癌（crc）是最具侵袭性的癌症之一，大约一半的结直肠癌患者发生局部复发或远处转移，甚至脑转移。tmz具有穿透血脑屏障的能力，可用于治疗脑转移瘤。tmz与其他药物联合用药显示，由于tmz被增强了化疗敏感性，能更好地改善脑转移瘤患者的临床结局。同时，减少tmz的用量，可减轻不良反应，提高患者的生活质量。本发明的小肽10d作为一个新的polβ抑制剂，能增强tmz对结直肠癌的抗肿瘤作用。因此，10d有望成为改善tmz治疗和辅助脑转移性crc化疗优化的候选药物。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为polβ基因敲除提高sw480细胞对tmz的敏感性。其中，a为sw480细胞中polβ基因敲除，微管蛋白作为对照。b为tmz作用后，测定polβ
‑
敲除细胞的存活率。空向量和dmso作为对照。每个数据点至少有三次重复。经t检验建立统计学意义。*与其他治疗组及对照组比较，p<0.05。
23.图2为从噬菌体展示肽库中筛选polβ抑制剂。其中，a为噬菌体酶联免疫吸附试验提高了每轮淘洗的od率。b为每一轮阳性克隆的富集。c为用噬菌体elisa鉴定17个克隆的结合选择性。用hrp结合的抗m13噬菌体抗体检测与polβ和bsa结合的噬菌体克隆。每个数据点重复三次，显示了polβ和bsa的od450 nm比。
24.图3为10d体外抑制polβ活性。其中，a为间隙填充活性测定。b为引物延伸活性测定。c为短片误码率测定。纯化蛋白体外重建ber短片修复。每个面板的左侧部分显示了相应dna底物的示意性结构。每个面板的右侧部分显示页面分隔的产品。c中的条表示修复产品的相对百分比，以氨基酸相同但序列完全不同的肽作为对照。
25.图4为10d和tmz联合应用降低癌细胞存活率。其中，a为10d和tmz处理显著降低sw480细胞的活力，**p<0.01。b为sw480细胞在10d和5μm tmz作用后形成更多的γh2ax灶，***p<0.001。c为tunel检测显示tmz和10d处理组sw480细胞凋亡明显增加，与tmz处理组相比，***p<0.001。d和e分别是b和c的代表图像。刻度，50μm。所有的实验至少重复三次。
26.图5为10d和tmz对异种移植瘤小鼠的抗肿瘤作用。其中，a为polβ抑制剂治疗或联合tmz治疗后肿瘤生长的比较。将sw480细胞注射于裸鼠右侧体表皮下制备动物模型。结果用均值
±
sd，方差分析和scheffe事后检验确定统计学意义。b为在tmz、10d或联合治疗期间监测肿瘤体积。c为肿瘤标本的h&e染色、ihc染色(ki67、caspase
‑
3、γh2ax)和tunel试验的代表性显微照片。刻度，250μm。
具体实施方式
27.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
28.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
29.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的
文献冲突时，以本说明书的内容为准。
30.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
31.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
32.实施例11.材料和方法1.1 细胞系和细胞培养结肠直肠癌细胞系sw480来源于atcc(manassas,va,usa）。所有这些细胞均在标准条件下培养。
33.1.2 抗体本发明实施例中使用的抗体如下：抗微管蛋白(am103a；bio
‑
world,dublin,oh,usa），抗γh2ax(ser139,#9718,cell signaling technology,danvers,ma,usa），抗裂解caspase
‑
3(asp175,#9664,cell signaling technology,danvers,ma,usa），抗ki67(d2h10,cell signaling technology,danvers,ma,usa），抗dna polβ(q324,bioworld,dublin,oh,usa），抗m13（45001419,r37119，life technologies）。
34.1.3 慢病毒及稳定细胞系制备用含有polβ shrna序列的重组慢病毒载体(shc203)感染sw480细胞，获得稳定的polβ敲除细胞系。用含慢病毒培养基加4μg/ml凝聚胺培养24h，用1.5μg/ml嘌呤霉素培养72h。所有慢病毒颗粒均由基因制药生物技术公司（中国上海）制备。
35.慢病毒制备：将载体质粒与包装质粒一起转染293t细胞，制备慢病毒颗粒。每24h采集一次含病毒培养基，连续3天。将细胞与含慢病毒的培养基加4μg/ml凝聚胺孵育24h，然后在1.0μg/ml嘌呤霉素中孵育72h后，选择细胞。
36.稳定细胞系制备：将制备好的病毒感染sw480细胞，侵染前一天取1x105的细胞铺板于24孔板，按照moi值取相应的病毒量侵染细胞，24h后换液药杀2天。取药杀后的细胞，提取基因组，pcr扩增后测序，检测到pool细胞中存在基因组被编辑的细胞。pool细胞计数后，通过有限稀释，使细胞浓度控制在1
‑
1.5个细胞每100μl。把该细胞悬液接种到96孔板中。培养一周左右，显微镜下观察96孔板中生长的单克隆，并标记单克隆所在的孔。经消化
‑
终止后，取50μl细胞悬液用于基因组检测，余下的部分用于传代。细胞悬液经1500rpm，离心5min后，去上清，加入细胞裂解液获取基因组。使用测序引物对这些基因组样品进行pcr扩增。在pcr扩增获得条带的情况下，送测序，并与原基因组进行比对，最终获得稳定的polβ敲除细胞系。
37.1.4 药物敏感性试验用细胞生长抑制法测定对dna损伤试剂的敏感性。将sw480细胞接种（每孔3000个细胞），在正常生长条件下孵育过夜，并用tmz稀释液处理72小时。活细胞数采用kit
‑
8(enogene，china)细胞计数法测定。每个克隆平均至少有4个重复。数据表示为相对于未处理对照的细胞数量的百分比。
38.1.5 肽噬菌体文库的筛选及噬菌体elisa检测
以重组polβ为抗原，用标准方法筛选出大于10
10
个克隆的人肽噬菌体文库。将100μl噬菌体加到polβ包被的elisa板上，在37℃下孵育1小时。洗涤后，加入兔抗m13 hrp结合二抗(ge)(1:5000pbs），37℃孵育1h。用底物tmb进行比色检测。加入2m h2so4停止反应，在450 nm处测得吸光度。
39.1.6 dna聚合酶活性测定dna底物与20μl反应缓冲液a(50 mm tris
‑
hcl ph8.0，10 mm mgcl2，2 mm dtt，20 mm nacl，10%甘油）、50μm dntp、polβ、不同量（0
‑
20 ng）的10d和对照肽在37℃孵育30 min。对照肽的序列为ffsmlmplshrl，来自中国南京genscript生物技术公司。然后加入等体积的凝胶负载缓冲液（90%甲酰胺染料，3m edta，0.02%溴酚蓝和0.02%二甲苯甲醇）停止反应。混合物加热（5min，95
°
c），用含8m尿素的15%聚丙烯酰胺凝胶分离，荧光光谱显示。
40.1.7 polβber活性测定用中间区携带尿嘧啶的合成dna双链体（41 nt）检测polβ的ber活性。完全修复反应在20μl的缓冲液中进行（40 mm hepes
‑
koh ph 7.8,70 mm kcl、7 mm mgcl2、1 mm二硫苏糖醇、0.5 mm edta,2 mm atp,50μm dntp）。将尿嘧啶
‑
dna糖化酶(udg，8 ng)、ape1(2ng)、连接酶iiia(20ng)、polβ和不同量的10d与底物混合，在37℃下孵育30 min。加入等体积的凝胶缓冲液停止反应，混合物用含8m尿素的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，荧光光谱显示。
41.1.8 免疫荧光染色细胞接种在含有酸处理盖玻片的12孔板中，并孵育过夜。药物处理3天后，用pbs冲洗盖片，用4%甲醛在pbs中固定30min，再次用pbs冲洗。加入triton x
‑
100(0.05%)使细胞渗透5min。玻片用3%bsa封闭，然后用一抗孵育。将玻片洗涤，与fitc结合的二抗孵育，pbs洗涤，dapi染色。用尼康80i10
‑
1500x显微镜观察载玻片，用照相机拍摄图像。
42.1.9 tunel（tdt介导的dutp缺口末端标记）试验细胞接种在含有酸处理盖玻片的12孔板中，并孵育过夜。药物处理3天后，用pbs冲洗盖玻片，用4%甲醛在pbs中固定30min，再次用pbs冲洗。加入triton x
‑
100(1%)使细胞渗透5min，然后用3%h2o2孵育10min，用冰冷的pbs洗涤。将细胞与tdt标记液在37℃温育1h，然后用pbs轻洗3次。细胞在100μl染色缓冲溶液中，黑暗孵育30 min，pbs洗涤，dapi染色。
43.1.10 裸鼠移植瘤所有动物实验都是按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行的。小鼠购自北京hfk生物科学有限公司。老鼠的体重在18到20g左右。小鼠被维持在空调无病原体的室内，控制光照12h/d。将悬浮在100μl无血清培养基中的sw480细胞(4
×
106个)接种于4周龄雌性balb/c裸鼠皮下。大约两周后，当平均肿瘤体积达到50
‑
100 mm3时，小鼠被随机分为两组。每组10只小鼠。腹腔注射10d(10mg/kg小鼠体重）和tmz(20mg/kg小鼠体重），每2天一次，共10次。用游标卡尺测量肿瘤大小，以长度
×
宽度2/2计算肿瘤体积(mm3)。当对照组小鼠肿瘤直径达到2 cm左右时，全部实施人道安乐死。所有动物均未出现多发性皮下肿瘤。
44.1.11 免疫细胞化学分析肿瘤组织用10%福尔马林固定，分级乙醇脱水，石蜡包埋。切片在6μm处切开，装在载玻片上。组织标本石蜡包埋切片去石蜡，在10 mm柠檬酸盐缓冲液(ph6.0)中97
°
c加热20min以提取抗原。切片用pbs冲洗，室温下用3%h2o2处理，37℃封闭20min，用一抗孵育。肿瘤
切片经pbs漂洗后，用生物素化二抗孵育，然后用abc试剂孵育，二氨基联苯胺(dab)暴露。通过估计显示特征染色的细胞百分比和染色强度来分析免疫反应性。
45.1.12 统计分析除另有说明外，所有实验均一式三份。结果用均值
±
sd表示。各组与未配对的t检验比较，p值<0.05被认为有统计学意义。在活体动物实验中，对收集的数据进行方差分析(anova)检验，然后进行scheffe事后检验进行多组比较。p值＜0.05被认为有统计学意义。
46.2.结果2.1 polβ基因敲除可提高sw480细胞对tmz的敏感性由于polβ在dna修复中是必需的，我们推测polβ的下调可能会改变肿瘤细胞对dna损伤诱导的化疗药物的反应，从而降低肿瘤细胞的生存能力。我们发现，与对照组相比，polβ基因敲除细胞对tmz表现出更高的敏感性（图1中的a和b)。说明抑制polβ可能增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。
47.2.2 从噬菌体肽库中筛选polβ抑制剂用含有6.8
×
10
10
个克隆的大噬菌体肽库分离polβ抑制剂。对固定化的polβ进行了三轮选择，选择了不同的配体浓度、洗涤次数和洗涤缓冲液浓度（表1）。每轮筛选后，随机抽取60个噬菌体克隆，用噬菌体elisa检测其与polβ的结合亲和力。od比值(polβ/bsa)在每轮淘选后都有所提高，尤其是在第三轮淘选后（图2中的a)，阳性克隆数也有所增加（图2中的b)，表明通过三轮淘选，对polβ的结合亲和力有所增强。用噬菌体elisa对第三轮的17个阳性克隆进行分析（图2中的c)。对亲和力较高的克隆进行dna测序分析。如表2所示，两个克隆(2c和3g)具有相同的序列，而其他克隆具有不同的序列。genscript biotech公司（中国南京）根据dna序列鉴定并合成了6个潜在的polβ抑制剂的序列。对6种肽进行了polβ活性和溶解度测试，并选择10d（氨基酸序列如seq id no.1所示）进行进一步研究。
48.表1 生物淘选条件及三次淘选的回收率表2 肽测序结果
2.3 体外重建dna修复10d的表征为了验证10d对polβ活性的抑制作用，我们利用人工合成的dna底物对polβ的引物延伸活性和间隙填充活性进行了体外重建。使用含有相同氨基酸但序列完全不同的对照肽。我们发现与对照肽相比，10d显著地抑制了引物延伸活性和间隙填充活性（图3中的a，图3中的b)。接下来，我们确定了10d介导的阻断引物延伸活性和间隙填充活性是否抑制polβ导向的短片ber(sp
‑
ber)，我们发现10d在体外能以剂量依赖的方式抑制sp
‑
ber（图3中的c)。
49.2.4 10d增强癌细胞对化疗药物的敏感性通过测定10d对化疗药物对癌细胞的细胞毒性的影响。如图4中的a所示，10d和tmz联合处理显著降低了sw480细胞的活力。进一步推测tmz联合治疗10d可增强肿瘤细胞dna双链断裂(dsbs)。结果表明，tmz和10d联合治疗与tmz单独治疗相比，γh2ax灶数量明显增加，凋亡细胞数量增加（图4中的b，图4中的d)。
50.tunel法用于检测单个细胞中dna的过度断裂。tunel检测显示，联合用药组细胞凋亡率是单药组的2倍以上（图4中的c)。γh2ax病灶染色可检测到tmz等化学物质引起的dna双链断裂。图中显示了具有代表性的γh2ax灶检测和tunel法的显微照片（图4中的d、图4中的e）。结果表明，10d联合tmz对sw480癌细胞有较高的杀伤作用。
51.2.5 tmz与10d联用可降低体内癌细胞生长，增加细胞凋亡为了扩大体外发现，我们进行了一项用裸鼠进行的体内异种移植研究。对照组肿瘤体积呈时间依赖性增加，而单独使用10d或tmz以及tmz与10d联合使用的小鼠肿瘤体积减小（图5中的a)。组合组下降趋势最大（图5中的a)。此外，联合组的肿瘤体积均小于其他各组（图5中的b)，提示tmz联合10d时肿瘤抑制作用明显。
52.h&e染色显示对照组肿瘤标本排列紧密。而tmz+10d组小鼠肿瘤呈空泡和分离细胞增多。tunel检测显示tmz与10d联合作用的肿瘤细胞凋亡最多。caspase3免疫荧光染色显示在tmz治疗的肿瘤中caspase3高表达，在10d+tmz治疗的肿瘤中caspase3高表达（图5中的c)。ki67是细胞增殖的标志物。tmz治疗的肿瘤显示ki67低染色，而10d+tmz治疗的肿瘤显示ki67低染色（图5中的c)。γh2ax染色检测dsbs。具有代表性的γh2ax染色照片显示，10d联合tmz导致更多的dsbs（图5中的c)，表明更多的dna断裂。所有这些发现与上述体外数据一致。
53.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行
限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。