抗PTK7单域抗体及其应用的制作方法

本发明涉及抗体领域，具体地涉及针对ptk7的特异性单域抗体，更具体地涉及其编码序列和其在疾病诊断和治疗中的应用。

背景技术：

1、蛋白酪氨酸激酶7(ptk7)，又名结肠癌激酶4(cck4)，是一种高度保守、无催化活性的跨膜蛋白酪氨酸激酶(ptk)，参与造血细胞，体细胞祖细胞以及干细胞发育过程的非标准wnt信号转导收体(peradziryi，2012)。

2、研究表明，ptk7在多种肿瘤组织中过度表达，包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌，其过度表达与预后不良和转移风险增加有关。另外，ptk7也被证实病人源性肿瘤组织中的肿瘤启动细胞(tic)或肿瘤干细胞高度富集。因此，靶向ptk7不单消除一般癌细胞，更能消除负责肿瘤复发的tic，成为靶向治疗的一个天然候选靶点(damelin，2017)。然而，由于ptk7没有催化活性，因此对此开发典型酪氨酸激酶抑制剂是不切实际的，以其为靶点的不同抗体偶联物以及不用型式的等多种药物正处于临床研发中。其中新型抗体偶联药物(adc)，利用人源化抗体hu6m024作为靶向载体与金盏花素微管抑制剂aur0101偶联而成的cofetuzumab pelidotin，已于转移性三阴性乳腺癌，铂耐药卵巢癌和非小细胞肺癌进行首次人体临床试验。其中早期研究数据证明，每3周一次2.8mg/kg cofetuzumabpelidotin是安全的，并在接受治疗的患者中观察到抗肿瘤活性，总体客观有效率分別为铂耐药卵巢癌27％(n＝63)，非小细胞肺癌19％(n＝31)和三阴性乳腺癌21％(n＝29)(maitland,2021)。此外，利用f-18标记的aptamer核酸适体作为靶向ptk7的免疫显像示踪剂能够在种肿瘤细胞系(hct116和umg)的异种移植模型中特异性、选择性和高亲和力地监察ptk7表达，并可能进一步开发ptk7靶向治疗(jacobson,2015)。

3、截至目前，市场上尚未有针对ptk7靶点的单域抗体药物。单域抗体即骆驼重链单域抗体vhh(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)，是目前可以得到的具有完整功能的稳定的可结合抗原的最小单位。单域抗体其分子量是传统抗体的1/10,具有稳定性高、水溶性好、人源化简单、靶向性高、穿透性强等特点，作为放射性同位素靶向载体，能够快速、特异性地穿透肿瘤组织结合靶标，而无结合抗体能很快从血液清除，减低身体放射性剂量，对比传统抗体用于开发放射免疫成像及放射免疫疗法具有众多明显优势(d’huyvetter,2014)。

4、因此，本领域需要开发一种抗ptk7单域抗体，尤其是能够单一有效地结合ptk7的特异性单域抗体，开发新一代放射免疫成像及放射免疫疗法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种具备良好的ptk7抗原结合性的抗ptk7单域抗体。

2、本发明的第一方面，提供了一种抗ptk7单域抗体vhh链的互补决定区cdr，所述vhh链的互补决定区cdr包含：

3、seq id no:9-11所示的cdr1；

4、seq id no:12-14所示的cdr2；和

5、seq id no:15-18所示的cdr3。

6、在另一优选例中，所述的cdr1、cdr2和cdr3由vhh链的框架区fr1、fr2、fr3和fr4所隔开。

7、在另一优选例中，所述vhh链的互补决定区cdr包含：

8、seq id no:9所示的cdr1；

9、seq id no:12所示的cdr2；和

10、seq id no:15所示的cdr3。

11、在另一优选例中，所述vhh链的互补决定区cdr包含选自下组的cdr1、cdr2和cdr3：

12、 组 cdr1序列编号 cdr2序列编号 cdr3序列编号 1 9 12 15 2 10 13 16 3 10 13 17 4 11 14 18。.

13、本发明的第二方面，提供了一种抗ptk7单域抗体的vhh链，所述vhh链包括框架区fr和本发明第一方面所述的互补决定区cdr。

14、在另一优选例中，所述框架区由选自下组的fr1、fr2、fr3和fr4组成：

15、 组 fr1序列编号 fr2序列编号 fr3序列编号 fr4序列编号 1 19 22 25 29 2 20 23 26 30 3 20 23 27 29 4 21 24 28 31。

16、在另一优选例中，所述的框架区由：

17、seq id no:19所示的fr1，seq id no:22所示的fr2，seq id no:25所示的fr3，和seq id no:29所示的fr4组成。

18、在另一优选例中，所述的抗ptk7单域抗体的vhh链具有如seq id no:1-4任一所示的氨基酸序列。

19、在另一优选例中，所述的抗ptk7单域抗体的vhh链具有如seq id no:1所示的氨基酸序列。

20、本发明的第三方面，提供了一种抗ptk7单域抗体，所述单域抗体是针对ptk7蛋白的单域抗体，并且具有如seq id no:1-4任一所示的氨基酸序列的vhh链。

21、在另一优选例中，所述单域抗体具有如seq id no:1所示的氨基酸序列的vhh链。

22、本发明的第四方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：本发明第一方面所述的cdr区、本发明第二方面所述的抗ptk7单域抗体的vhh链、或本发明第三方面所述的抗ptk7单域抗体。

23、在另一优选例中，所述多核苷酸具有如seq id no.:5-8任一所示的核苷酸序列。

24、在另一优选例中，所述的多核苷酸包括dna、cdna或rna。

25、本发明的第五方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第四方面所述的多核苷酸。

26、在另一优选例中，所述表达载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

27、本发明的第六方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第五方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第四方面所述的多核苷酸。

28、在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

29、在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞。

30、本发明的第七方面，提供了一种产生抗ptk7单域抗体的方法，包括步骤：

31、(a)在适合产生单域抗体的条件下，培养本发明第六方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗ptk7单域抗体的培养物；以及(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗ptk7单域抗体。

32、在另一优选例中，所述的抗ptk7单域抗体具有如seq id no:1-4任一所示的氨基酸序列。

33、本发明的第八方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：

34、(a)如本发明第二方面所述的抗ptk7单域抗体的vhh链、或如本发明第三方面所述的抗ptk7单域抗体；和(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

35、在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。

36、在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。

37、在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il-2等)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

38、在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明第二方面所述的抗ptk7单域抗体的vhh链、如本发明第三方面所述的抗ptk7单域抗体。

39、在另一优选例中，所述多价是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本发明第二方面所述的抗ptk7单域抗体的vhh链、本发明第三方面所述的抗ptk7单域抗体。

40、本发明的第九方面，提供了如本发明第二方面所述的vhh链，如本发明第三方面所述的抗ptk7单域抗体，或如本发明第八方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备(a)用于检测ptk7分子的试剂；(b)用于治疗肿瘤的药物。

41、在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。

42、在另一优选例中，所述肿瘤为ptk7高表达的肿瘤。

43、在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌，或其组合。

44、本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：(i)如本发明第三方面所述的单域抗体或如本发明第八方面所述的免疫偶联物；和(ii)药学上可接受的载体。

45、在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。

46、在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌，或其组合。

47、本发明的第十一方面，提供了一种体外(诊断和非诊断性)检测样品中ptk7蛋白的方法，包括步骤：

48、(1)将样品与本发明第三方面所述的单域抗体接触；

49、(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在ptk7蛋白。

50、本发明的第十二方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，包括向需要的对象施用如本发明第三方面所述的单域抗体，如本发明第八方面所述的免疫偶联物，或如本发明第十方面所述的药物组合物。

51、在另一优选例中，所述肿瘤为ptk7高表达的肿瘤。

52、在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌，或其组合。

53、在另一优选例中，所述对象包括人或非人类哺乳动物。

54、本发明的第十三方面，提供了一种放射性免疫成像方法，包括使用如本发明第三方面所述的单域抗体，或如本发明第八方面所述的免疫偶联物进行成像。

55、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。