一种家族性高胆固醇血症基因检测文库、其构建方法和试剂盒与流程

1.本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种家族性高胆固醇血症基因检测文库、其构建方法和试剂盒。


背景技术：

2.家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia,fh)是一种常染色体显性遗传病，病理特征为血浆总胆固醇(tc)和低密度脂蛋白胆固醇(ldl
‑
c)水平增高及早发冠心病(pcad)。冠状动脉粥样硬化性心脏病(cad)的病理基础是动脉粥样硬化(as)，而fh因血脂代谢异常会间接或直接促发as，与pcad(cad发病年龄男性＜55岁，女性＜65岁)的发生、发展具有密切关系。fh患者血脂代谢失衡会加快as及pcad进程，早期发现和诊断fh，及早进行干预，可显著降低冠脉疾病的发病率及死亡率，改善临床预后。
3.目前已知的fh相关变异超过2000个，其中约1000个变异已经得到足够证据支持而被归类为致病变异和可能致病变异两类之中，这些变异主要分布在三个基因：ldlr(90％以上)、apob(5％～10％)和pcsk9(1％以下)。但是，随着基因测序技术的发展，以及医患对于fh认知的不断提高，越来越多的基因，以及基因的突变位点被发现，对fh的相关基因检测的覆盖度还有待于进一步改善，例如授权公告号为cn109517884b的中国发明专利公开了fh的测序文库，仅涉及ldlr、apob、pcsk9这三种基因，覆盖度有待于进一步提高，并且采用的是ion torrent测序平台。
4.与目前非常成熟，并且已经面临要被更新迭代的ion torrent测序平台和illumina测序平台相比，dnbseq测序平台主要定位于医院、检验所级别的中小型规模的测序应用场景，仪器成本低，各项性能指标更加优异，但是目前还未见基于dnbseq测序平台的fh基因检测文库的相关报道。


技术实现要素：

5.本发明提供一种家族性高胆固醇血症基因检测文库、其构建方法和试剂盒，以至少解决上述技术问题之一。
6.本发明实现其目的采用的技术方案是：
7.一种家族性高胆固醇血症基因检测文库试剂盒，包含引物组3，引物组3的序列为seq id no.323
‑
382，检测如下基因或基因位点：ldlrap1基因，celsr2基因的多态性位点rs629301，abcg8基因的多态性位点rs4299376，slc22a1基因的多态性位点rs1564348，hfe基因的多态性位点rs1800562，mylip基因的多态性位点rs3757354，st3gal4基因的多态性位点rs11220462，nynrin基因的多态性位点rs8017377，apoe基因的多态性位点rs429358、rs7412，ldlr基因的多态性位点rs6511720，apob基因的多态性位点rs1367117，pcsk9基因的多态性位点rs2479409。
8.本发明还提供另一种家族性高胆固醇血症基因检测文库试剂盒，包含引物组1，引
物组1的序列为seq id no.1
‑
152，检测如下基因：ldlrap1基因、ldlr基因，apob基因，pcsk9基因。
9.本发明还提供第三种家族性高胆固醇血症基因检测文库试剂盒，包含引物组2，引物组2的序列为seq id no.153
‑
322，检测如下基因：ldlr基因，apob基因，pcsk9基因，ldlrap1基因。
10.上述的任意一种家族性高胆固醇血症基因检测文库试剂盒，还包括测序接头引物1和接头引物2，所述接头引物1的序列为seq id no.383所示，所述接头引物2的序列为seq id no.384所示。
11.本发明提供的一种家族性高胆固醇血症基因检测文库的构建方法，包括如下步骤：
12.1)获得dna样本；
13.2)采用权利要求1所述的试剂盒中的引物组3，权利要求2所述的试剂盒中的引物组1，权利要求3所述的试剂盒中的引物组2中的任一组，任意两组，或三组对所述dna样本进行第1轮多重pcr反应得到扩增产物；
14.3)合并第1轮多重pcr反应得到的扩增产物，在扩增产物中加入接头引物1和接头引物2，然后进行第2轮接头序列pcr反应，得到基因检测文库。
15.在上述技术方案中，所述步骤3)中，当引物组1
‑
3分别进行第1轮多重pcr反应时，引物组1
‑
3的多重pcr扩增产物以体积比6
‑
8﹕5
‑
7﹕1
‑
3合并。
16.在上述技术方案中，引物组1和引物组2的第1轮多重pcr反应的反应条件如下：
[0017][0018]
引物组3的第1轮多重pcr反应的反应条件如下：
[0019][0020]
本发明提供的一种家族性高胆固醇血症基因检测文库，所述基因检测文库由上述任一项所述的构建方法制备而成。
[0021]
本发明的有益效果在于：
[0022]
(1)本发明设计了适用dnbseq测序平台的关于fh基因检测的191对引物对(seq id no.1
‑
382)，其中引物seq id no.1
‑
324，以及引物seq id no.347
‑
382用于检测ldlrap1基因、pcsk9基因、ldlr基因和apob基因的编码外显子及侧翼区(
±
10bp)，主要考虑的是单基因遗传的突变特点，测序覆盖度已经能够达到100％。
[0023]
(2)除了考虑单基因遗传的突变特点外，本发明还考虑到了多基因遗传病的突变特点，将celsr2基因的多态性位点(rs629301)，abcg8基因的多态性位点(rs4299376)，slc22a1基因的多态性位点(rs1564348)，hfe基因的多态性位点(rs1800562)，mylip基因的
多态性位点(rs3757354)，st3gal4基因的多态性位点(rs11220462)，nynrin基因的多态性位点(rs8017377)，apoe基因的多态性位点(rs429358、rs7412)，ldlr基因的多态性位点(rs6511720)，apob基因的多态性位点(rs1367117)，pcsk9基因的多态性位点(rs2479409)纳入到检测范围，进一步提高了基因检测文库的覆盖范围。
[0024]
本发明提供的多重靶向捕获试剂盒能够检测fh相关基因变异的多个位点，基因panel扩大，检测范围更加全面，测序覆盖度能够达到100％，不需要使用探针捕获，利用多重pcr扩增实现待测区域的高度覆盖，具有高检测覆盖度和高均一性，样本消耗量少、样本要求低。
[0025]
(3)三组引物组，主要分组依据在于gc含量，以及防止引物之间相互配对，其中，引物组1和引物组2的gc含量大致范围在40
‑
60％，引物组3的gc含量大致范围在70
‑
80％。
[0026]
(4)本发明提供的试剂盒可以采用多种样本进行文库构建，如唾液gdna、血液gdna等。本发明优化了流程步骤，将多重pcr完成后的引物消化步骤改为磁珠纯化，减少了实验用时。
[0027]
(5)除引物外，检测时，本发明所采用的第1轮多重pcr反应和第2轮接头序列pcr反应的检测条件，使构建的基因检测文库具有构建周期短，比对率高，捕获率高，均一性好，重复性好，操作简便等优点。
[0028]
(6)本发明所称的“覆盖度”是指达到指定深度的测序碱基占有整个基因组或目标区域的百分比；深度是指比对到已知参考序列的碱基平均测序次数。
附图说明
[0029]
图1是采用agilent 2200生物分析仪对基因检测文库进行文库片段长度质控和浓度质控结果图。
具体实施方式
[0030]
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
[0031]
试剂来源：
[0032]
以下实施例所涉及的自备试剂和仪器如下表1所示：
[0033]
表1自备试剂和仪器
[0034][0035]
实施例1、采用家族性高胆固醇血症多重靶向捕获试剂盒构建基因检测文库
[0036]
一、家族性高胆固醇血症多重靶向捕获试剂盒组成
[0037]
表2试剂盒组成
[0038][0039][0040]
二、家族性高胆固醇血症多重靶向捕获试剂盒检测方法
[0041]
1.获取dna样本
[0042]
对收集的人类全血edta抗凝样本进行全基因组的dna提取，对dna的浓度和纯度进行检测，要求浓度＞5.6ng/μl，纯度od260/280为1.8
‑
2.0。
[0043]
2.构建基因检测文库
[0044]
1)第1轮多重pcr反应
[0045]
本实施例所涉及的fh相关基因有4个基因和12个多态位点，4个基因、12个多态位点以及对应的pcr扩增引物组如下：
[0046]
根据ldlr(低密度脂蛋白受体,low
‑
density lipoprotein receptor)基因所设计的引物：序列seq id no.33
‑
58和序列seq id no.201
‑
220；
[0047]
根据apob(载脂蛋白b,apolipoprotein b)基因所设计的引物：seq id no.序列59
‑
152，序列seq id no.221
‑
322和序列seq id no.347
‑
366；
[0048]
根据pcsk9(人蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶9,proprotein convertase subtilisin/kexintype9)基因所设计的引物：序列seq id no.15
‑
32、序列seq id no.167
‑
200和序列seq id no.367
‑
382；
[0049]
根据ldlrap1(低密度脂蛋白受体衔接蛋白1基因,(low density lipoprotein receptor adaptor protein 1)基因所设计的引物：序列seq id no.1
‑
14、序列seq id no.153
‑
166和序列seq id no.323
‑
324；
[0050]
根据pcsk9基因的多态性位点(rs2479409)所设计的引物：序列seq id no.325
‑
326；
[0051]
根据celsr2(钙粘蛋白egf
‑
lag七通型受体2基因，cadherin egf
‑
lag seven
‑
pass g
‑
type receptor 2)基因的多态性位点(rs629301)所设计的引物：序列seq id no.327
‑
328；
[0052]
根据st3gal4(唾液酸转移酶4)基因的多态性位点(rs11220462)所设计的引物：序列seq id no.329
‑
330；
[0053]
根据nynrin(nyn domain and retroviral integrase containing)基因的多态性位点(rs8017377)所设计的引物：序列seq id no.331
‑
332；
[0054]
根据ldlr基因的多态性位点(rs6511720)所设计的引物：序列seq id no.333
‑
334；
[0055]
根据apoe(apolipoprotein e，apoe)基因的多态性位点(rs429358、rs7412)所设计的引物：序列seq id no.335
‑
336；
[0056]
根据apob基因的多态性位点(rs1367117)所设计的引物：序列seq id no.337
‑
338；
[0057]
根据abcg8(atp结合盒b亚族成员8转运蛋白基因)基因的多态性位点(rs4299376)所设计的引物：序列seq id no.339
‑
340；
[0058]
根据mylip(肌球蛋白调节轻链相互作用蛋白,myosin regulatory light chain interacting protein)基因的多态性位点(rs3757354)所设计的引物：序列seq id no.341
‑
342；
[0059]
根据hfe(血色沉着病基因,hemochromatosis)基因的多态性位点(rs1800562)所设计的引物：序列seq id no.343
‑
344；
[0060]
根据slc22a1(阳离子转运蛋白1)基因的多态性位点(rs1564348)所设计的引物：序列seq id no.345
‑
346。
[0061]
上述引物分为引物组1、引物组2、引物组3。引物组1所含引物的核苷酸序列如下表3所列：
[0062]
表3引物组1所含引物的核苷酸序列
[0063]
[0064][0065]
引物组2所含引物的核苷酸序列如下表4所列：
[0066]
表4引物组2所含引物的核苷酸序列
[0067]
[0068]
[0069][0070]
引物组3所含引物的核苷酸序列如下表5所列：
[0071]
表5引物组3所含引物的核苷酸序列
[0072]
[0073][0074]
多重pcr反应分为3个反应管，引物组1反应管、引物组2反应管、引物组3反应管中除了引物不一样，其它试剂都一样，多重pcr反应体系(总体系30μl)如下表6所示。
[0075]
表6.第1轮多重pcr反应体系
[0076]
组份加入量(μl)ddh2o9
‑
xenhancer buffer nb(1n)3.5enhancer buffer m2.5引物组1/引物组2/引物组35gdnaxigt
‑
em808polymerase mixture10
[0077]
gdna起始量均为50ng/反应管；dna的浓度为qubit dsdna hs assay kit(thermo fisher)的定量结果；引物组中的各引物的浓度为：10μm。
[0078]
将反应混合物用漩涡振荡器震荡混匀，迷你离心机离心5秒置于pcr仪中反应。反应条件如表7(引物组1和2)和表8(引物组3)中所示。
[0079]
注意事项：
①
需要严格按照表7和表8中的反应体系和反应条件进行pcr反应，更改反应参数可能会导致文库的质量下降或文库构建失败；
②
进行pcr反应前，先将所有gdna的浓度稀释到同一浓度，并转移到pcr 8联管中，一方面是便于排枪操作，另一方面是为了加入相同起始量的gdna，降低最终文库的浓度差异，便于混合文库；
③
执行多重pcr反应时，特别是样本量多的情况下，请将引物组1设为一组，引物组2设为一组，引物组3设为一组，便于
制备反应试剂混合液和排枪操作；
④
执行多重pcr反应时，请将解冻好的试剂放置在冰盒上，并在冰盒上进行加样操作；
⑤
请在pcr管壁上方或者管盖上进行反应编号标记，防止高温或其他原因导致记号消失，避免后续产物混合操作失误，造成样本交叉污染。
[0080]
请按照普通pcr的操作规范进行第1轮多重pcr反应
[0081]
表7.第1轮多重pcr反应条件(引物组1和引物组2对应的反应管)
[0082][0083]
表8.第1轮多重pcr反应条件(引物组3对应的反应管)
[0084][0085]
2)第1轮多重pcr产物合并
[0086]
多重pcr反应结束后，3个反应管的pcr产物先分别加入接头引物1(seq id no.383)和接头引物2(seq id no.384)进行连接反应，反应完毕后3个反应管的pcr产物按照表9进行合并，总体积为30μl。
[0087]
表9.多重pcr产物合并
[0088]
反应管编号t1t2t3混合体积14μl12μl4μl
[0089]
向30μl pcr合并产物加入27μl室温平衡后的ampure xp磁珠，用移液器轻缓吸打混匀20次；
[0090]
室温孵育5min后，将pcr管置于dynamag
‑
96side磁力架上3min；
[0091]
彻底移除上清，将pcr管从磁力架取下，向管内加入50μl yf buffer b，用移液器轻缓吸打混匀20次；
[0092]
室温孵育5min后，将pcr管置于dynamag
‑
96side磁力架上3min；
[0093]
移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s；
[0094]
移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清；
[0095]
室温静置3min，使残留乙醇彻底挥发；
[0096]
将pcr管从磁力架取下，加入24μl nuclease
‑
free water(无核酸酶水)，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；
[0097]
将pcr管重新置于磁力架上，静置3min；
[0098]
用移液器吸取13.5μl上清液，转移到新的200μl pcr管内，管内上清液为合并后的多重pcr产物。
[0099]
3)第2轮接头序列pcr反应
[0100]
采用上一步纯化后的pcr合并产物，按表10配制接头pcr反应体系(总体系30μl)：
[0101]
表10.接头pcr反应体系
[0102]
组份加入量(μl)纯化后的pcr合并产物13.5enhancer buffer m2.5ddh2o2tpe1.0index(10μm)1tpe2.0index(10μm)1igt
‑
em808polymerase mixture10
[0103]
tpe1.0 index的序列信息如下表11所示：
[0104]
表11 tpe1.0 index的序列信息
[0105][0106]
tpe2.0 index的序列信息如下表12所示：
[0107]
表12 tpe2.0 index的序列信息
[0108][0109][0110]
将反应混合物用漩涡振荡器震荡混匀，迷你离心机离心5秒置于pcr仪中反应。反应条件如表13中所示：
[0111]
表13.接头pcr反应条件
[0112][0113]
4)第2轮磁珠纯化
[0114]
向步骤3)的pcr反应产物中加入27μl室温平衡后的ampure xp磁珠，用移液器轻缓吸打混匀20次；
[0115]
室温孵育5min后，将pcr管置于dynamag
‑
96side磁力架上3min；
[0116]
彻底移除上清，将pcr管从磁力架取下，向管内加入50μl yf buffer b，用移液器轻缓吸打混匀20次；
[0117]
室温孵育5min后，将pcr管置于dynamag
‑
96side磁力架上3min；
[0118]
移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s；
[0119]
移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清；
[0120]
室温静置3min，使残留乙醇彻底挥发；
[0121]
将pcr管从磁力架取下，加入24μl nuclease
‑
free water，用移液器轻缓吸打混匀20次，重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；
[0122]
将pcr管重新置于磁力架上，静置3min；
[0123]
用移液器吸取20μl上清液，转移到新的pcr管中，管中上清为制备好的基因检测文库。
[0124]
3.基因检测文库质控
[0125]
取1μl步骤4)得到的基因检测文库使用agilent 2200生物分析仪进行文库片段长度质控和浓度质控，正常文库的片段分布区间在280
‑
420bp之间，主峰在400bp左右，无明显小片段和大段杂峰；否则建库样品不符合要求，应重新建库。
[0126]
基因检测文库的长度质控和浓度质控结果如图1所示，结果显示均符合要求。
[0127]
取2μl基因检测文库使用2.0fluorometer(exkubit plus dsdna hs分析试剂盒)进行基因检测文库浓度测定，记录文库浓度。正常文库的浓度范围为5
‑
40ng/μl，文库浓度主要与模板的质量相关。
[0128]
实施例2、对30个fh患者的dna样本进行测序分析
[0129]
采用实施例1提供的家族性高胆固醇血症多重靶向捕获试剂盒，并参照现有技术中mgiseq
‑
2000基因测序仪使用说明书启动基因测序仪，完成dnb管、测序载片和测序试剂槽装载，并启动测序程序。
[0130]
测序完成后，使用现有技术中的生物信息学软件进行数据分析，严格按照说明书操作。测序结果见表14：
[0131]
表14.样本测序分析结果
[0132]
样本编号基因命名碱基突变chr.ref_pos.覆盖度1apobc.9406c>tchr221230334100％2apobc.1379c>tchr22125286199.99％3apobc.7331g>achr221232409100％4apobc.11456a>cchr221228284100％5pcsk9c.905a>gchr155521771100％6apobc.1837a>cchr221250930100％7apobc.11359c>tchr221228381100％8apobc.10167a>tchr221229573100％9apobc.7843c>gchr221231897100％10apobc.7729a>cchr22123201199.68％11apobc.7724a>tchr22123201699.68％12ldlrc.694+3a>tchr191121627999.67％
13apobc.12080g>achr221227148100％14apobc.3708a>gchr221237454100％15apobc.13621a>tchr221224673100％16apobc.12614c>tchr22122568099.99％17pcsk9c.588c>tchr15551801599.99％18apobc.8252a>gchr22123148899.68％19apobc.8379delcchr22123136199.67％20ldlrc.68
‑
2a>gchr191121089799.99％21apobc.9407g>achr221230333100％22apobc.8293c>tchr221231447100％23apobc.3745c>tchr22123741799.78％24apobc.9407g>achr221230333100％25apobc.5501a>gchr22123423999.45％26ldlrap1c.223g>achr125880547100％27ldlrap1c.231+1g>tchr125880556100％28pcsk9c.1930g>achr155529108100％29apobc.9452c>tchr221230288100％30apobc.3163c>tchr221239480100％
[0133]
结论：
[0134]
本实施例构建的基因检测文库对于ldlrap1基因、pcsk9基因、ldlr基因和apob基因的测序覆盖度为99.45
‑
100％，不需要使用探针捕获，利用多重pcr扩增实现待测区域的高度覆盖，具有高检测覆盖度和高均一性，样本消耗量少、样本要求低。