黄热病毒抗体及其应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及黄热病毒抗体及其应用。


背景技术：

2.黄热病毒(yfv)是以伊蚊为媒介在虫媒传染病毒，与寨卡病毒(zikv)、西尼罗河病毒(wnv)和登革热病毒(denv)等同属黄病毒科黄病毒属。黄热病毒的传播媒介是蚊子，因此，在蚊子流行地区和发展中国家中黄热病的暴发率很高。当前主要流行于非洲和南美洲的热带、亚热带地区。黄热病毒可引起严重危害人类健康的黄热病，表现为黄疸，出血、甚至多系统的器官衰竭。因黄热病症状与同科病毒引起的疾病症状类似，且同一地区还可能同时流行黄热病毒和其它黄病毒，因此在临床上凭借临床症状难以鉴别。此外，由于黄病毒科的病毒在抗原性上具有相似的特征，抗体可能会具有交叉反应性。而且，登革病毒还会引起ade(抗体依赖的增强作用)，这些情况使得临床诊断更为复杂。以上问题也对开发黄热病的血清学诊断方法提出了巨大挑战。
3.诊断黄热病毒感染的实验室方法主要包括病毒分离、核酸检测、抗原检测和血清学检测等。目前最可靠的诊断方法主要是提取病毒rna后进行qrt
‑
pcr，该方法费时、成本高昂且需要在特定的实验室由专业人员进行操作，使用的仪器也较复杂，无法广泛便捷的应用。因此，迫切需要开发一种操作简单、可在感染早期即可检测产品和方法，且课在偏远地区使用。
4.黄热病毒的非结构蛋白1(nonstructuralprotein1，ns1)是比较保守的糖蛋白，有膜型和分泌型两种形式，在感染机体中表达量高且时间长，是检测黄热病毒感染的良好靶点。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种黄热病毒抗体，能与黄热病毒ns1蛋白结合，具有较高的亲和力和特异性，以及较好的稳定性。
6.一种黄热病毒抗体，所述抗体包含如下(1)
‑
(5)中任一氨基酸序列：
7.(1)如氨基酸序列seqidno：1所示的氨基酸重链可变区，如氨基酸序列seqidno：2所示的氨基酸轻链可变区；
8.(2)如氨基酸序列seqidno：3所示的氨基酸重链可变区，如氨基酸序列seqidno：4所示的氨基酸轻链可变区；
9.(3)如氨基酸序列seqidno：5所示的氨基酸重链可变区，如氨基酸序列seqidno：6所示的氨基酸轻链可变区；
10.(4)如氨基酸序列seqidno：7所示的氨基酸重链可变区，如氨基酸序列seqidno：8所示的氨基酸轻链可变区；
11.(5)如氨基酸序列seqidno：9所示的氨基酸重链可变区，如氨基酸序列seqidno：10所示的氨基酸轻链可变区。
12.以上所述的抗体，其中，所述氨基酸序列seqidno：11所示的抗体重链恒定区，如氨基酸序列seqidno：12所示的抗体轻链恒定区。
13.以上所述的抗体，其中，所述抗体重链恒定区的编码核苷酸序列如seqidno：13所示，所述抗体轻链恒定区的编码核苷酸序列如seqidno：14所示。
14.以上所述的抗体，其中，所述抗体还包括信号肽序列，所述信号肽的氨基酸序列如seqidno：15所示，所述信号肽序列的编码核苷酸序列如seqidno：16所示。
15.以上所述的抗体，其中，所述氨基酸轻链均为k型轻链。
16.本发明的一种核酸分子，其中，所述核酸分子包含编码以上所述抗体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如下：
17.(1)如核苷酸序列seqidno：17所示的氨基酸重链可变区，如核苷酸序列seqidno：18所示的氨基酸轻链可变区；
18.(2)如核苷酸序列seqidno：19所示的氨基酸重链可变区，如核苷酸序列seqidno：20所示的氨基酸轻链可变区；
19.(3)如核苷酸序列seqidno：21所示的氨基酸重链可变区，如核苷酸序列seqidno：22所示的氨基酸轻链可变区；
20.(4)如核苷酸序列seqidno：23所示的氨基酸重链可变区，如核苷酸序列seqidno：24所示的氨基酸轻链可变区；
21.(5)如核苷酸序列seqidno：25所示的氨基酸重链可变区，如核苷酸序列seqidno：26所示的氨基酸轻链可变区。
22.本发明还包含以上所述核酸分子的表达载体。
23.本发明还包含以上所述表达载体的宿主细胞。
24.本发明的一种药物组合物，其中，包含以上任一所述的抗体。
25.本发明的一种检测试剂，其中，包含以上权利要求中任一所述的抗体。
26.本发明的一种检测试剂盒，其中，包含以上权利要求中任一所述的抗体。
27.以上任一所述抗体在制备检测、治疗和/或预防黄热病毒药物、试剂或试剂盒上的应用。
28.有益效果
29.本发明提供的黄热病毒抗体可以特异性识别黄热病毒，与黄病毒科的其他病毒无交叉反应，本发明的抗体与黄热病毒具有高亲和力，对于黄热病毒的检测以及检测产品的制备都具有较高的应用价值。
附图说明
30.图1为黄热病毒yfv
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ns1蛋白的亲和层析及sds
‑
page鉴定结果图；
31.图2为寨卡病毒zikv
‑
ns1蛋白的亲和层析及sds
‑
page鉴定结果图；
32.图3为血清型登革热病毒dv1
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ns1/dv2
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ns1/dv3
‑
ns1/dv4
‑
ns1蛋白的亲和层析及sds
‑
page鉴定结果图；
33.图4为西尼罗病毒wn
‑
ns1蛋白的亲和层析及sds
‑
page鉴定结果图；
34.图5为抗体蛋白通过westernblotting和sds
‑
page鉴定的结果图；
35.图6为测定黄热病毒抗体的结合活性的结果图；
36.图7为测定黄热病毒抗体亲和力的结果图。
具体实施方式
37.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
38.实施例1人源抗体的制备
39.一、黄热病毒非结构蛋白l(yfv
‑
ns1)的表达与纯化
40.yfv
‑
ns1的胞外区基因片段通过nde i和xho i克隆至pfastbac i载体中，转化至大肠杆菌dh10，获得重组质粒bacmid
‑
ns1。然后，转染sf9细胞，获得含有ns1基因的杆状病毒。杆状病毒感染hi5细胞后，可分泌表达ns1蛋白至培养上清。通过亲和层析和分子筛层析的方法进行纯化，通过sds
‑
page鉴定蛋白纯度。结果显示，ns1蛋白存在单体和二聚体形式，单体大小为43kda，如seq id no：27所示，结果如图1。将yfv
‑
ns1 浓缩至1mg/ml，冷冻保存于
‑
80℃备用。
41.二、其他黄病毒科ns1蛋白的表达与纯化
42.其他黄病毒属病毒：西尼罗病毒wnv
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ns1(wnv
‑
ns1单体蛋白，大小为92kda，如seq id no：28所示，如图2所示)、寨卡病毒zikv
‑
ns1(zikv
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ns1单体蛋白，90kda，如seq id no：29所示，如图3所示)、四种血清型登革热病毒denv
‑
ns1(dv1
‑
ns1/ dv2
‑
ns1/dv3
‑
ns1/dv4
‑
ns1单体蛋白，大小分别为92kda/86kda/43kda/43kda，如seqid no：30
‑
33所示，如图4所示)蛋白表达纯化过程参考上述yfv
‑
ns1蛋白表达纯化方法。
43.三、人源单克隆抗体的制备
44.1单细胞分选和克隆构建
45.取得康复者知情同意的情况下，采集两名感染yfv 6个月的康复者的外周血样本，分离外周血单核细胞(pbmcs)，加入各类血细胞特异性标记抗体和特异性yfv
‑
ns1抗原一起孵育。经facsaria ii(bd biosciences)分选，收集yfv
‑
ns1阳性的记忆型b 细胞至96孔板中，每孔1个细胞。
46.我们通过rt
‑
pcr和巢式pcr的方法从单个b细胞中扩增抗体可变区基因序列(vh 和vl)。首先，将获得的b细胞通过superscript iii reverse transcriptase试剂盒进行逆转录。获得cdna后，采用hotstar plus酶(qiagen)进行巢式pcr来扩增抗体可变区序列。第一轮pcr反应条件如下：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃(vh和v
k
)或50℃ (vλ)60s，72℃ 90s，35个循环；72℃ 7min。将获得的产物作为模板进行第二轮pcr，条件如下：95℃ 5min；95℃ 30s，58℃(重链)/60℃(k链)/64℃(λ链)30s，72℃ 90s， 35个循环；72℃ 7min。
47.采用琼脂糖凝胶电泳，分离pcr产物，用凝胶提取试剂盒(cwbio)提取分子量约为400bp的pcr条带，并将纯化后的产物进行测序。利用imgt(internationalimmunogenetics)信息系统和igblast对获得的靶序列进行分析。可变区序列与相对应的应的恒定区通过搭桥pcr连接，克隆至表达载体pcaggs中，其中重链与λ链采用ecori 和xhoi酶切位点，κ链采用saci与xhoi酶切位点。
48.2蛋白表达和纯化
49.将重链和轻链构建质粒转染hek
‑
293t细胞。转染6小时后用更换为新鲜的无血清的培养基进行培养。第3天和第7天，收集细胞培养上清。将收集的上清与含有20mm磷酸钠
(ph7.0)的缓冲液等体积混合，6500rpm离心30min去掉碎片，经过0.22um的滤膜过滤后，上清液流过hitrapproteina亲和层析柱，然后使用0.1m甘氨酸(ph3.0)洗脱结合的抗体。收集洗脱液浓缩后进行分子筛层析。目的峰通过sds
‑
page，分离出11种抗体，重链约为45kda，轻链约为25kda，说明目标蛋白得到正常表达。
50.实施例2抗体的功能鉴定
51.一、elisa检测抗体特异性结合yfv
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ns11)使用包被液稀释抗原2μg/ml(yfv
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ns1、yfv
‑
ns1cterminal、wnv
‑
ns1、zikv
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ns1、denv1
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ns1、denv2
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ns1、denv3
‑
ns1、denv4
‑
ns1)，加速至酶标板中，100μl/孔，4℃过夜。
52.2)第二天，加入pbst200μl/孔，洗板机(bio
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tek，405ls)洗板5次后，加入5％的脱脂奶粉封闭液，100μl/孔，37℃孵箱孵育l小时。
53.3)pbst漂洗5次，加入抗体yb5、yb17、yb19、yb33或yd30，400ng/孔，37℃孵箱孵育1小时。
54.4)pbst漂洗5次，将hpr标记的羊抗人igg，100μl/孔，37℃孵箱孵育45min。
55.5)pbst漂洗5次，加入tmb显色液，100μl/孔，室温避光，反应2分钟，之后加入2mh2so4终止反应，100μl/孔。
56.6)检测450nm波长处的od值，保存记录原始数据。
57.结果如图6所示，抗体yb5、yb17、yb19、yb33和yd30均为yfv的特异性单抗；与其他黄病毒科ns1蛋白均无结合。
58.二、表面等离子共振技术(spr)检测抗体与yfv
‑
ns1的结合能力
59.此项实验采用biacore
tm
8k机器完成。具体步骤如下：
60.首先，将抗人的二抗以氨基偶联的方式固定在cm5芯片的通道(flowcell，fc)。固定量控制在10,000响应值(responseunits，ru)左右。以抗体捕获的方式固定yb5、yb17、yb19、yb33或yd30，捕获量在60ru左右。缓冲液(10mmhepes，150mmnacl，ph7.4)倍比稀释yfv
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ns1蛋白，依次流过各通道，流速为30μl/min。利用biaevaluationsoftware(biacore，inc.)软件计算结合动力学常数。
61.spr的结果显示，抗体均可以与yfv
‑
ns1蛋白结合(图7)。得到的各相互作用的结合常数(ka)、解离常数(kd)和平衡解离常数(kd)，如表1所示。
62.表1
[0063][0064]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。