一种提高OMVs产量的重组猪霍乱沙门菌的构建方法

一种提高omvs产量的重组猪霍乱沙门菌的构建方法
技术领域
1.本发明设计一种提高omvs产量的重组猪霍乱沙门菌的构建方法，涉及一种将野生型猪霍乱沙门菌tol
‑
pal相关基因敲除以提高omvs产量的构建方法，属于动物细菌基因工程技术领域。


背景技术：

2.猪霍乱沙门菌(salmonella choleraesuis)是导致2
‑
4月龄仔猪副伤寒的主要病原之一，此病原菌可引起断奶仔猪大批发病，表现为不同的临床反应，包括败血症及其它组织的局部炎症、也可使怀孕母畜发生流产导致急性流行性爆发，给养殖业带来巨大的经济损失。细菌感染仍然是导致人类和动物死亡的主要原因之一。由于耐药菌的增加和快速传播，抗生素治疗细菌性疾病的有效性受到了挑战。因此，疫苗被认为是后抗生素时代应对细菌性疾病最直接有效的策略。目前针对猪霍乱沙门菌的商品化疫苗主要包括亚单位疫苗、灭活苗和弱毒苗。这些疫苗目前都存在着一定的不足。亚单位疫苗的成本相对较高且交叉保护效果不够理想；灭活苗会使其丢失大部分抗原表位、免疫保护持续时间短，保护性不足；弱毒苗具有毒力返强的风险，存在很大的安全隐患。细菌性疾病亚单位疫苗由于其生产工艺简单、成本低及安全性高等优势，成为细菌疫苗的重要发展方向。此类疫苗主要由原核表达系统(如大肠杆菌)大规模生产，表达产物通常无法进行正确的加工和折叠，影响表达蛋白的构象导致免疫原性较差。除了安全性外，评价一个疫苗的另一个重要指标就是其免疫原性。因此如何提高细菌性疾病亚单位疫苗的免疫原性成为首要解决的问题。
3.与传统疫苗相比，omvs作为细菌疫苗存在着诸多优势：(1)免疫原性好：omvs为典型的纳米颗粒结构，有利于进入淋巴管并被抗原递呈细胞高效摄取，另外omvs包含大量天然构象的外膜抗原，可有效刺激机体的体液和细胞免疫反应；(2)有效的天然佐剂：omvs含有lps可作为佐剂，可诱导宿主产生高效的免疫应答；(3)靶向改造：omvs可通过基因工程手段被定向改造，将目标抗原包裹入囊泡腔内或者镶嵌至外膜上，然后递呈至宿主细胞。尽管大量的试验表明omvs作为相对安全的佐剂可以成为良好的疫苗候选，但其作为疫苗仍然存在一个不可忽视的关键问题：产量低，成本高：omvs产量是其作为疫苗的关键，需要引入能够显著提高omvs产量的关键基因；作为免疫原，omvs产量低是诱导高免疫保护效力和一线生产疫苗的大忌，因此需要研究提高omvs的产量的方法。因此，如何提高omvs的产量，是今后omvs疫苗研究的主要方向。只有解决上面的这个关键问题，omvs才有可能作为成熟的商品化疫苗得到应用。研究表明omvs无论是作为病原菌自身疫苗还是作为疫苗递呈载体构建重组二联疫苗均具有非常大的应用潜力。想开发猪病相关的omvs疫苗，找到能提高猪霍乱沙门菌omvs的相关基因非常关键，tol
‑
pal系统相关基因在猪霍乱沙门菌中的作用及其对omvs的产量的影响值得深入研究。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对上述现有技术不足，现提出一种提高omvs产量的重组猪霍乱
沙门菌的构建方法。
5.本发明是这样实现的：一种提高omvs产量的重组猪霍乱沙门菌的构建方法，其特征是，包括以下步骤：
6.1)、构建缺失tola、tolb和tolr基因的猪霍乱沙门菌自杀载体，将野生株猪霍乱沙门菌c78
‑
3为母本菌株与含有缺失tola、tolb和tolr基因的猪霍乱沙门菌自杀载体大肠杆菌供体菌结合，在野生株猪霍乱沙门菌c78
‑
3中分别引入δtola、δtolb和δtolr突变，构建出含δtola、δtolb、δtolr突变的三株猪霍乱沙门菌缺失株；完成提高omvs产量的重组猪霍乱沙门菌的构建。
7.tola、tolb和tolr是猪霍乱沙门菌tol
‑
pal系统的一部分，是与沙门菌中肽聚糖互作过程中密切相关的一类内膜蛋白，在维持细菌外膜完整性上发挥重要作用，分别失活这三个基因会导致沙门菌omvs分泌量的提高。
8.δtola缺失株的构建方法为：
9.基于同源重组的原理，根据genbank中猪霍乱沙门菌c78
‑
3的全基因序列，找到tola基因及其上下游序列，经tola
‑
a和tola
‑
b扩增获得目的基因上游同源臂tola
‑
l，经tola
‑
c和tola
‑
d扩增获得目的基因下游同源臂tola
‑
r；然后以tola
‑
l、tola
‑
r基因片段为模板进行融合pcr，扩增缺失了目的基因的tola
‑
lr片段，随后将tola
‑
lr克隆到自杀载体pre112，即pre112::cm
r
‑
tola
‑
lr；接着转化至2,6
‑
二氨基庚二酸dap缺陷菌株χ7213中，pcr显示有特异性阳性条带，与预期的融合片段大小相符；双酶切结果也显示自杀载体pre112::cmr
‑
tola
‑
lr构建成功，酶切和序列鉴定正确后冻存。
10.吸取含有pre112::cm
r
‑
tola
‑
lr的供体菌χ7213和受体菌c78
‑
3各一滴于含50mg/ml dap的lb固体培养基，将结合菌在含25ug/ml氯霉素的lb平板上划线；挑取单菌落于lb液体中培养至云雾状，随后涂布于含5％蔗糖的lb平板上，如果细菌只在普通固体培养基中生长，而在氯霉素培养基中不生长，此类菌落为疑似成功的基因缺失株，选用tola外部引物a/d和内部引物e/f进行鉴定，筛选δtola缺失株，通过不断的筛选和鉴定，对疑似缺失株进行了pcr检测，结果显示缺失株的同源臂引物tola
‑
ad扩增出来的片段大小比在亲本株中的片段小一个目的基因长度，目的基因内部检测引物无法在缺失株中扩增出条带，证明缺失株构建成功。
11.δtolb缺失株的构建方法为：
12.基于同源重组的原理，根据genbank中猪霍乱沙门菌c78
‑
3的全基因序列，找到tolb基因及其上下游序列，经tolb
‑
a和tolb
‑
b扩增获得目的基因上游同源臂tolb
‑
l，经tolb
‑
c和tolb
‑
d扩增获得目的基因下游同源臂tolb
‑
r；然后以tolb
‑
l、tolb
‑
r基因片段为模板进行融合pcr，扩增缺失了目的基因的tolb
‑
lr片段，随后将tolb
‑
lr克隆到自杀载体pre112，即pre112::cm
r
‑
tolb
‑
lr，接着转化至2,6
‑
二氨基庚二酸dap缺陷菌株χ7213中，pcr显示有特异性阳性条带，与预期的融合片段大小相符；双酶切结果也显示自杀载体pre112::cmr
‑
tolb
‑
lr构建成功，酶切和序列鉴定正确后冻存。
13.吸取含有pre112::cm
r
‑
tolb
‑
lr的供体菌χ7213和受体菌c78
‑
3各一滴于含50mg/ml dap的lb固体培养基，将结合菌在含25ug/ml氯霉素的lb平板上划线；挑取单菌落于lb液体中培养至云雾状，随后涂布于含5％蔗糖的lb平板上，如果细菌只在普通固体培养基中生长，而在氯霉素培养基中不生长，此类菌落为疑似成功的基因缺失株，选用tolb外部引物a/
d和内部引物e/f进行鉴定，筛选δtolb缺失株，通过不断的筛选和鉴定，对疑似缺失株进行了pcr检测，结果显示缺失株的同源臂引物tolb
‑
ad扩增出来的片段大小比在亲本株中的片段小一个目的基因长度，目的基因内部检测引物无法在缺失株中扩增出条带，证明缺失株构建成功。
14.δtolr缺失株的构建的构建方法为：
15.基于同源重组的原理，根据genbank中猪霍乱沙门菌c78
‑
3的全基因序列，找到tolr基因及其上下游序列，经tolr
‑
a和tolr
‑
b扩增获得目的基因上游同源臂tolr
‑
l，经tolr
‑
c和tolr
‑
d扩增获得目的基因下游同源臂tolr
‑
r；然后以tolr
‑
l、tolr
‑
r基因片段为模板进行融合pcr，扩增634bp缺失了目的基因的tolr
‑
lr片段，随后将tolr
‑
lr克隆到自杀载体pre112，即pre112::cm
r
‑
tolr
‑
lr，接着转化至2,6
‑
二氨基庚二酸dap缺陷菌株χ7213中，pcr显示有特异性阳性条带，与预期的融合片段大小相符；双酶切结果也显示自杀载体pre112::cmr
‑
tolr
‑
lr构建成功；酶切和序列鉴定正确后冻存。
16.吸取含有pre112::cm
r
‑
tolr
‑
lr的供体菌χ7213和受体菌c78
‑
3各一滴于含50mg/ml dap的lb固体培养基，将结合菌在含25μg/ml氯霉素的lb平板上划线；挑取单菌落于lb液体中培养至云雾状，随后涂布于含5％蔗糖的lb平板上，如果细菌只在普通固体培养基中生长，而在氯霉素培养基中不生长，此类菌落为疑似成功的基因缺失株，我们选用tolr外部引物a/d和内部引物e/f进行鉴定，筛选δtolr缺失株，通过不断的筛选和鉴定，对疑似缺失株进行了pcr检测，结果显示缺失株的同源臂引物tolr
‑
ad扩增出来的片段大小比在亲本株中的片段小一个目的基因长度，目的基因内部检测引物无法在缺失株中扩增出条带，证明缺失株构建成功。
17.本发明方法先进科学，通过本发明，构建缺失tola、tolb和tolr基因的猪霍乱沙门菌自杀载体；通过同源重组，在野生型猪霍乱沙门菌c78
‑
3中引入δtola、δtolb和δtolr突变；比较δtola、δtolb、δtolr和猪霍乱沙门菌野生株c78
‑
3的表型特点；检测缺失株的omvs产量，评价本技术中的提高omvs产量的相关调控基因的效果，旨在找到能提高猪霍乱沙门菌omvs的相关基因，为omvs疫苗的应用提供理论基础。在方案上，构建缺失tola、tolb和tolr基因的猪霍乱沙门菌自杀载体，将受体菌c78
‑
3与含有自杀载体大肠杆菌供体菌结合，在野生株猪霍乱沙门菌c78
‑
3中分别引入δtola、δtolb和δtolr突变。比较c78
‑
3和δtola、δtolb、δtolr的生物学功能，包括生长特性、细菌形态和运动特性，检测其表型变化特点。通过透射电镜、bca蛋白定量和sds
‑
page等实验方法确定omvs产量的差异。
18.本发明的方案包括猪霍乱沙门菌δtola、δtolb、δtolr自杀载体的构建：以猪霍乱沙门菌野生强毒株c78
‑
3为母本菌株，运用自杀质粒介导的同源重组技术，分别引入δtola、δtolb、δtolr三个突变，成功构建了含δtola、δtolb、δtolr突变的三株猪霍乱沙门菌缺失株。其中，tola、tolb和tolr是猪霍乱沙门菌tol
‑
pal系统的一部分，是与沙门菌中肽聚糖互作过程中密切相关的一类内膜蛋白，在维持细菌外膜完整性上发挥重要作用，分别失活这三个基因可能会导致沙门菌omvs分泌量的提高。
19.猪霍乱沙门氏菌δtola、δtolb、δtolr的表型鉴定：为了探究缺失tola、tolb和tolr是否会对猪霍乱沙门菌的菌体形态产生影响，分别对c78
‑
3与δtola、δtolb、δtolr进行了革兰氏染色观察。结果显示野生株c78
‑
3呈革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌，而缺失株δtola、δtolb、δtolr形态发生明显改变，菌体呈球形，散在、成对或短链状分布。该实
验结果提示缺失tola、tolb和tolr后对野生株的外膜完整性产生影响，进而影响菌体的形态结构。透射电镜观察结果显示野生株形态正常，呈短杆状。δtola、δtolb、δtolr呈多个相连的椭圆形，菌体周围有许多omvs分泌，与野生株相比缺失株形态发生明显的改变。该实验结果进一步证实缺失tola、tolb和tolr后确实对野生株的外膜完整性产生了影响，进而影响菌体的形态结构，最终可能影响omvs的产量。细菌运动性检测结果显示，各缺失株运动直径相近，大约在4
‑
6mm，野生株菌圈直径大约是缺失株的2.5倍，数据表明将tola、tolb和tolr基因缺失后，c78
‑
3的运动能力显著下降。生长曲线测定结果显示，在对数生长期缺失株与野生株相比生长速度较缓慢，各缺失株的生长速度相似。
20.含有δtola、δtolb、δtolr的猪霍乱沙门氏菌omvs产量的检测：为了确定敲除tola、tolb和tolr基因是否影响猪霍乱沙门菌omvs的产量，我们在相同的培养条件下，将野生株和缺失株培养至对数期，以同样的方式提取各菌株的omvs，并进行了透射电镜观察。结果显示，野生株产生的omvs多为圆形或椭圆形，并且含有大量鞭毛。而缺失株产生的omvs除了圆形和椭圆形外，还有很多不规则的杆状结构。与野生株相比，缺失株omvs的数量相比野生株显著提高，形态发生了明显改变，同时鞭毛消失。接着我们通过bca蛋白浓度测定试剂盒检测了omvs的蛋白浓度，结果显示相比野生株omvs的蛋白浓度，从缺失株δtola、δtolb、δtolr中提取的omvs蛋白浓度分别提高了7.6倍，7.9倍，9.3倍。随后我们将omvs进行了sds
‑
page分析。我们观察到野生株omvs的蛋白条带较少，主要蛋白条带约为55kd(对应于鞭毛蛋白)，缺失株omvs中的蛋白条带数量及丰度显著高于野生株。这些结果表明tola、tolb和tolr三个基因的缺失可以明显提高omvs的产量。
21.国内外未见tola、tolb、tolr基因影响猪霍乱沙门菌的omvs生物发生的相关报道，要想开发猪病相关的omvs疫苗，探索提高猪霍乱沙门菌omvs的相关研究非常关键。本专利运用自杀载体同源重组的方法，分别在猪霍乱沙门菌c78
‑
3染色体上引入δtola、δtolb和δtolr突变，实验结果显示缺失株可以提高omvs的产量，初步解决了omvs疫苗生产应用中存在的产量低这一主要问题。为tol
‑
pal系统相关基因在猪霍乱沙门菌中的作用及其对omvs的产量的影响提供理论基础。
22.综上，本发明通过在猪霍乱沙门氏菌c78
‑
3中分别构建δtola、δtolb和δtolr，探究这三个基因对猪霍乱沙门菌的生物学功能、omvs产量的影响，推进猪霍乱沙门氏菌omvs疫苗的开发，具有较大的市场应用潜力和潜在的经济效益。
附图说明
23.图1为缺失株δtola的构建示意图。
24.图2为δtola重组自杀质粒的pcr和酶切鉴定。
25.图3为δtola缺失株pcr鉴定。
26.图4为缺失株δtolb的构建示意图。
27.图5为δtolb重组自杀质粒的pcr和酶切鉴定。
28.图6为δtolb缺失株pcr鉴定。
29.图7为缺失株δtolr的构建示意图。
30.图8为δtolr重组自杀质粒的pcr和酶切鉴定。
31.图9为δtolr缺失株pcr鉴定。
32.图10为c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr革兰氏染色光学显微镜观察。
33.图11为c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr的透射电镜观察。
34.图12为c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr的运动性检测。
35.图13为c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr的生长曲线测定。
36.图14为c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr omvs的透射电镜观察。
37.图15为c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr omvs的蛋白浓度测定。
38.图16为c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr omvs的sds
‑
page检测。
具体实施方式
39.结合附图下面对本发明进一步说明。
40.实施1猪霍乱沙门菌δtola、δtolb和δtolr缺失株的构建；
41.1.1δtola缺失株的构建；
42.基于同源重组的原理，δtola缺失株的构建示意图如图1所示。根据genbank中猪霍乱沙门菌c78
‑
3的全基因序列，找到tola基因及其上下游序列，经tola
‑
a和tola
‑
b扩增获得目的基因上游同源臂tola
‑
l，经tola
‑
c和tola
‑
d扩增获得目的基因下游同源臂tola
‑
r。然后以tola
‑
l、tola
‑
r基因片段为模板进行融合pcr，扩增缺失了目的基因的tola
‑
lr片段，随后将tola
‑
lr克隆到自杀载体pre112(pre112::cm
r
‑
tola
‑
lr)，接着转化至2,6
‑
二氨基庚二酸(dap)缺陷菌株χ7213中，pcr显示有特异性阳性条带，与预期的融合片段大小相符。双酶切结果也显示自杀载体pre112::cmr
‑
tola
‑
lr构建成功，如图2。酶切和序列鉴定正确后冻存。
43.吸取含有pre112::cm
r
‑
tola
‑
lr的供体菌χ7213和受体菌c78
‑
3各一滴于lb(含50mg/ml的dap)固体培养基，将结合菌在含25ug/ml氯霉素的lb平板上划线。挑取单菌落于lb液体中培养至云雾状，随后涂布于含5％蔗糖的lb平板上，如果细菌只在普通固体培养基中生长，而在氯霉素培养基中不生长，此类菌落为疑似成功的基因缺失株，我们选用tola外部引物(a/d)和内部引物(e/f)进行鉴定，筛选δtola缺失株，通过不断的筛选和鉴定，对疑似缺失株进行了pcr检测，结果显示缺失株的同源臂引物tola
‑
ad扩增出来的片段大小比在亲本株中的片段小一个目的基因长度，目的基因内部检测引物无法在缺失株中扩增出条带，证明缺失株构建成功，如图3。
44.1.2δtolb缺失株的构建；
45.基于同源重组的原理，δtolb缺失株的构建示意图如图4所示。根据genbank中猪霍乱沙门菌c78
‑
3的全基因序列，找到tolb基因及其上下游序列，经tolb
‑
a和tolb
‑
b扩增获得目的基因上游同源臂tolb
‑
l，经tolb
‑
c和tolb
‑
d扩增获得目的基因下游同源臂tolb
‑
r。然后以tolb
‑
l、tolb
‑
r基因片段为模板进行融合pcr，扩增缺失了目的基因的tolb
‑
lr片段，随后将tolb
‑
lr克隆到自杀载体pre112(pre112::cm
r
‑
tolb
‑
lr)，接着转化至2,6
‑
二氨基庚二酸(dap)缺陷菌株χ7213中，pcr显示有特异性阳性条带，与预期的融合片段大小相符。双酶切结果也显示自杀载体pre112::cmr
‑
tolb
‑
lr构建成功，如图5。酶切和序列鉴定正确后冻存。
46.吸取含有pre112::cm
r
‑
tolb
‑
lr的供体菌χ7213和受体菌c78
‑
3各一滴于lb(含50mg/ml的dap)固体培养基，将结合菌在含25ug/ml氯霉素的lb平板上划线。挑取单菌落于
lb液体中培养至云雾状，随后涂布于含5％蔗糖的lb平板上，如果细菌只在普通固体培养基中生长，而在氯霉素培养基中不生长，此类菌落为疑似成功的基因缺失株，我们选用tolb外部引物(a/d)和内部引物(e/f)进行鉴定，筛选δtolb缺失株，通过不断的筛选和鉴定，对疑似缺失株进行了pcr检测，结果显示缺失株的同源臂引物tolb
‑
ad扩增出来的片段大小比在亲本株中的片段小一个目的基因长度，目的基因内部检测引物无法在缺失株中扩增出条带，证明缺失株构建成功，如图6。
47.1.3δtolr缺失株的构建；
48.基于同源重组的原理，δtolr缺失株的构建示意图如图7所示。根据genbank中猪霍乱沙门菌c78
‑
3的全基因序列，找到tolr基因及其上下游序列，经tolr
‑
a和tolr
‑
b扩增获得目的基因上游同源臂tolr
‑
l，经tolr
‑
c和tolr
‑
d扩增获得目的基因下游同源臂tolr
‑
r。然后以tolr
‑
l、tolr
‑
r基因片段为模板进行融合pcr，扩增缺失了目的基因的tolr
‑
lr片段(634bp)，随后将tolr
‑
lr克隆到自杀载体pre112(pre112::cm
r
‑
tolr
‑
lr)，接着转化至2,6
‑
二氨基庚二酸(dap)缺陷菌株χ7213中，pcr显示有特异性阳性条带，与预期的融合片段大小相符。双酶切结果也显示自杀载体pre112::cmr
‑
tolr
‑
lr构建成功，如图8。酶切和序列鉴定正确后冻存。
49.吸取含有pre112::cm
r
‑
tolr
‑
lr的供体菌χ7213和受体菌c78
‑
3各一滴于lb(含50mg/ml的dap)固体培养基，将结合菌在含25μg/ml氯霉素的lb平板上划线。挑取单菌落于lb液体中培养至云雾状，随后涂布于含5％蔗糖的lb平板上，如果细菌只在普通固体培养基中生长，而在氯霉素培养基中不生长，此类菌落为疑似成功的基因缺失株，我们选用tolr外部引物(a/d)和内部引物(e/f)进行鉴定，筛选δtolr缺失株，通过不断的筛选和鉴定，对疑似缺失株进行了pcr检测，结果显示缺失株的同源臂引物tolr
‑
ad扩增出来的片段大小比在亲本株中的片段小一个目的基因长度，目的基因内部检测引物无法在缺失株中扩增出条带，证明缺失株构建成功，如图9。
50.实施2c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr的表型鉴定；
51.2.1c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr的革兰氏染色观察；
52.取四张干净的玻片做好标记，用注射器抽取无菌生理盐水滴一滴到玻片中央，将接种环放于酒精灯外焰灭菌，接着分别挑取c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr的菌落，均匀涂抹在生理盐水上，做成直径为1cm的薄层，再将接种环灭菌放回，最后把玻片置于酒精灯外焰干燥固定。首先初染：在固定过的涂片菌膜上滴加草酸铵结晶紫染液初染1min后，用细小的水流冲洗；然后媒染：加碘液媒染1min，用细小水流冲洗；接着脱色：加95％酒精，并轻轻摇动进行脱色，20s
‑
30s后再进行水洗；最后复染：加石炭酸复红染色液复染1min后进行水洗，将玻片自然干燥，镜检拍照。结果显示观察到野生株呈革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌，而缺失株形态发生明显改变，呈球形，散在、成对或三个四个球形短链分布，如图10。该实验结果提示缺失tola、tolb和tolr后很可能对c78
‑
3的外膜完整性产生影响，进而影响菌体的形态结构。
53.2.2c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr的透射电镜观察；
54.将c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr培养至对数生长期(od
600
＝0.9)，pbs洗涤两次后，用5％的戊二醛室温固定2h，然后再用2％四氧化锇固定2h。样品用不同浓度的丙酮梯度脱水，嵌入环氧树脂中后制作切片，将切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅分别染色，随后在透射
电子显微镜上以80kv的加速电压进行观察拍照。结果显示野生株形态正常，呈短杆状。周围存在大量鞭毛。缺失株呈多个相连的椭圆形，菌体周围有许多omvs分泌，与野生株相比缺失株形态发生明显的改变，鞭毛减少甚至消失，如图11。
55.2.3c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr的运动性检测；
56.将c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr培养至对数生长期(od
600
＝0.9)，pbs洗涤两次后，稀释10倍后各吸1μl滴于含有0.5％琼脂和0.02％阿拉伯糖的lb平板上，随后放置于37℃培养箱中培养5h，最后取出平板测量菌圈直径，试验一式三份，并独立重复三次。δtola、δtolb和δtolr的运动直径分别为4.7mm、4.7mm、5.0mm，野生株的运动直径大约是缺失株的2倍多为12.4mm，可以看出在相同od值下，缺失株的运动能力明显低于野生株。数据表明将tola、tolb、tolr基因缺失后，c78
‑
3的运动能力显著下降，如图12。
57.2.4c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr的生长曲线的测定；
58.挑取c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr单菌落分别接种5ml lb液体培养基，摇菌培养至od
600
＝0.9，按1：200比例分别接种到50ml lb培养基中，于37℃恒温摇床220rpm振荡培养12小时，观察四种菌在培养基中的生长状态，之后每隔一小时测一次od
600
的读值，记录数据并绘制生长曲线。试验一式三份，并独立重复三次。如图13所示缺失株与野生株相比生长速度较缓慢，各缺失株的生长速度相似。
59.实施3c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr的omvs产量检测；
60.3.1c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr omvs的透射电镜观察；
61.分别挑取c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr单菌落分别于5ml的lb液体培养基过夜培养，各取3ml按1：100比例扩大培养至300ml lb液体培养基中，置于恒温摇床，200rpm，37℃培养，摇菌至od600＝1.0，8000rpm，离心30min，收集上清，用0.45μm的细菌滤器过滤，接种少量滤液于lb固体培养基，置于37℃恒温培养箱过夜培养，以检测滤液是否彻底无菌。将无菌滤液转移至超速离心管中，40000rpm，4℃超速离心3h，弃其上清，将沉淀重悬于1ml无菌pbs中。随后将粗提的omvs样品进行密度梯度离心，在离心管中依次加入浓度不连续的optiprep(axis
‑
shield)梯度分离液(依次为45％，40％，35％，30％，25％，20％)，将omvs样品加入液体最上方，40000rpm，4℃超速离心过夜。根据sds
‑
pagd结果将某一浓度下富集的omvs分离液进行再次超速离心，得到的沉淀即为富集的沙门菌omvs，置于
‑
80℃保存备用。所有的omvs样品在提取和纯化过程中至少独立重复三次。电镜观察采用负染色法，取5μl omvs样品滴在具有膜的铜网上，静止10min后滤纸吸去多余悬液，然后滴加2％的磷钨酸染液于铜网上，静止5min后滤纸吸去多余染液，自然半干后透射电镜观察omvs的形态并拍照记录结果。结果显示，野生株产生的omvs多为圆形或椭圆形，并且含有大量鞭毛。而缺失株产生的omvs除了圆形和椭圆形外，还有很多不规则的杆状结构。与野生株相比，缺失株omvs的数量相比野生株显著提高，形态发生了明显改变，同时鞭毛消失，如图14。说明敲除tola，tolb和tolr基因除了影响细菌外膜表面形态结构外，还影响omvs的产量。暗示猪霍乱沙门菌外膜的形态结构与omvs的分泌可能存在某些联系。
62.3.2c78
‑
3、δtola、δtolb和δtolr omvs的蛋白浓度测定；
63.用bca蛋白浓度测定试剂盒检测所提取omvs中的蛋白浓度，根据试剂盒说明书，用96孔板进行检测。首先将蛋白标准品稀释至0.5mg/ml，作为蛋白标准液；然后配制适量bca工作液，充分混匀；随后将蛋白标准液配置成合适的浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、
0.3、0.4、0.5mg/ml；加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20μl，需加pbs补足到20μl；各孔加入200μl bca工作液，37℃放置20
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30min；冷却至室温后，用酶标仪测定a562的吸光值，记录数据；根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。用蛋白标准品绘制蛋白浓度标准曲线，并生成标准曲线方程，标准曲线方程为y＝0.654x+0.1164，r2＝0.995。相比野生株omvs的蛋白浓度，从缺失株δtola、δtolb、δtolr中提取的omvs蛋白浓度分别提高了7.6倍，7.9倍和9.3倍，如图15。缺失株omvs的蛋白浓度明显高于野生株。结果证实将tola、tolb、tolr基因缺失后，c78
‑
3的omvs产量显著增加。
64.3.3c78
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3、δtola、δtolb和δtolr omvs的sds
‑
page检测；
65.将所提取的c78
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3、δtola、δtolb和δtolr omvs经蛋白上样缓冲液重悬煮沸变性后，按顺序加入相同体积到泳道中，经过12％的sds
‑
page鉴定。我们观察到野生株omvs的蛋白条带较少，主要蛋白条带约为55kda，而在缺失株中未见明显条带，推测此蛋白为鞭毛蛋白。在野生株和缺失株中均可见在37kda处有一明显蛋白条带，且缺失株浓度显著高于野生株，推测此蛋白可能是omvs特有外膜蛋白ompa。sds
‑
page结果显示缺失株omvs中的蛋白条带数量及丰度显著高于野生株，如图16。这些结果表明tola、tolb和tolr三个基因的缺失可以明显提高omvs的产量。
66.综上所述，本技术成功构了猪霍乱沙门菌基因缺失株δtola，δtolb，δtolr，通过对野生株和缺失株的生长特性、细菌形态、运动特性以及omvs的产量等生物学功能进行比较，解析tola、tolb、tolr基因在猪霍乱沙门菌中的作用。
67.结果表明，tola、tolb、tolr基因的缺失，都使猪霍乱沙门菌菌体的鞭毛数量显著减少，造成缺失株运动能力的显著下降。同时细菌的形态结构发生改变，菌体表面omvs分泌增多，最终造成缺失株omvs的产量明显高于野生株；本技术研究结果为tol
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pal系统相关基因在猪霍乱沙门菌中作用及进一步深入研究提供了理论基础，同时为之后研究猪霍乱沙门菌omvs的疫苗开发提供理论参考，具有较大的市场应用潜力。